CN102250085A

CN102250085A - 联苯双酯衍生物及其在制备自身免疫性疾病药物中的应用

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Publication number: CN102250085A
Application number: CN2010101795794A
Authority: CN
Inventors: 陈俐娟; 魏于全; 罗有福
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2030-05-21
Also published as: CN102250085B

Abstract

本发明涉及一类新型联苯双酯衍生物及用途，属于化学医药领域。具体地说，涉及如式I所示的化合物及其用途，R1代表2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基位于邻位、间位、对位的一类化合物。试验表明式I所示的化合物对治疗急慢性肝炎、肺纤维化等自身免疫性疾病具有很好的效果，为制备治疗自身免疫性疾病的药物提供了一种新的选择。

Description

联苯双酯衍生物及其在制备自身免疫性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种新型联苯双酯衍生物及用途，尤其在在治疗肝炎方面的应用，属于化学制药领域。

背景技术

联苯双酯是人工合成的五味子丙素的类似物，经药理实验证明，有降低四氯化碳和硫代乙酰胺引起的小鼠高血清谷丙转氨酶作用，现已用于急慢性肝炎的治疗。

通过对联苯双酯的代谢进行研究发现，联苯双酯在胃肠道中并不被破坏，且吸收很少，只有20％左右。联苯双酯是一种比较难溶的药物，实验证明大鼠、小鼠、及正常人口服联苯双酯淀粉悬浮液或片剂后，生物利用度仅25％-30％。临床研究表明联苯双酯对肝脏中的谷丙转氨酶有强大的抑制作用，故用药后血清中谷丙转氨酶可在短时间内下降至正常，但血清中谷丙转氨酶的正常并不代表肝脏病变的恢复或正常，病人应按肝炎为治愈处理，所以病人在停药后经常会出现“反跳”现象，不能达到很好的治愈效果。

本领域急需开发更多的药物，为肝炎等疾病提供更多更好的选择。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种新型的联苯双酯衍生物，它具有通式I所示的结构：

其中，R1代表2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基位于邻位、间位、对位的一类化合物。该化合物具有治疗肝炎的作用。

进一步地，R1是式(II)、(III)或(IV)：

其中，

R2、R3、R4、R5相互独立的是氢、卤素、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷氧基、氰基、硝基，其任选1至4个取代基相互组合；

R6、R7、R8、R9相互独立的是氢、卤素、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷氧基、氰基、硝基，其任选1至4个取代基相互组合；

R10、R11、R12、R13相互独立的是氢、卤素、烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰胺基、烷氧基、氰基、硝基，其任选1至4个取代基相互组合。

具体地，可以是如下化合物或类似结构的化合物：

上述化合物的制备方法如下：

A)4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-联苯二甲酸甲酯置于5％KOH水溶液中，在80-120℃加热水解3-10h，浓盐酸调节PH1-4，过滤干燥得4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-联苯二甲酸(2)

B)4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-联苯二甲酸置于乙酸酐中，于100℃-150℃回流10-24h，旋干后得4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-联苯二甲酸酐(3)

C)4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-联苯二甲酸酐置于甲醇中，于50℃-70℃回流5-15h，旋干后得4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2-甲氧羰基-2’-羧酸联苯(4)

D)4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2-甲氧羰基-2’-羧酸联苯溶于二氧六环中，于80-120℃与氯化亚砜回流0.5-5h，旋干后溶于二氯甲烷，以三乙胺做碱，与羟基苯甲醛类化合物室温搅拌10-20h，萃取后旋干得2-(4-甲酰基苯基)-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(5)

E)2-(4-甲酰基苯基)-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯以β-丙氨酸为催化剂，与噻唑烷二酮在冰乙酸中于100-140℃回流2-8h，萃取后旋干以二氯甲烷结晶或硅胶柱层析纯化得(Z)-2-[4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6)

上述A)无机碱可以选用NaOH、KOH等；反应温度为80-120℃；反应时间为3-10h。

上述B)反应温度为100℃-150℃；反应时间为10-24h。

上述C)反应温度为50℃-70℃；反应时间为5-15h。

上述D)上述反应溶剂可为二氧六环、二氯甲烷等；第一步反应温度为80-120℃；反应时间为0.5-5h；第二步所用碱可为三乙胺、DIEA、DMAP等；反应时间为10-20h。

上述E)所用碱可为β-丙氨酸、乙酸钠、乙酸钾、KF/Al₂O₃、哌啶等；反应溶剂可为甲醇、乙醇、乙酸等；反应温度为100-140℃；反应时间为2-8h。

本发明目的之二在于上述新型衍生物在制备治疗急性肝炎、慢性肝纤维化等免疫性疾病药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗免疫性疾病药物，其活性成分包含上述所述的化合物中的至少一种。

本发明还提供了上述化合物的前体或盐，以及所述化合物的前体或盐在制备急性肝炎或慢性肝纤维化药物中的应用。

所述“化合物前体”指的是当病人用适当的方法服用后，某化合物在病人体内进行代谢或化学反应而转变成化学结构通式I的一个化合物。

本发明的有益效果是：

本发明化合物一方面可以改善药代动力学性质，提高生物利用度。另一方面药物在体内会被酶水解成两个原型药物。利用联苯双酯的高效降酶作用，和5-苯亚甲基-2，4-噻唑烷二酮类化合物治疗肝炎的作用，从而发挥协同作用，起到更好的治疗效果。

实验证明式I所示的新型联苯双酯衍生物具有很好的治疗急性肝炎和肝纤维化等自身免疫性疾病的作用，为该类疾病的治疗提供了一种新的药物选择。

附图说明

图1是血清转氨酶ALT的生化学评价对比图。

图2是肝组织H&E染色进行病理切片观察图(200X)：(A)，正常组；(B)，模型组：D-Galn/LPS诱导；(C)对照组：D-Galn/LPS+联苯双酯(25mg/kg)；(D)治疗组：D-Galn/LPS+化合物(6-1)(25mg/kg)。

图3是肝组织H&E染色进行病理切片观察图(400X)：(A)，正常组；(B)，模型组：D-Galn/LPS诱导；(C)对照组：D-Galn/LPS+联苯双酯(25mg/kg)；(D)治疗组：D-Galn/LPS+化合物(6-1)(25mg/kg)。

图4化合物(6-1)对D-Galn/LPS诱导的小鼠急性肝损伤致死剂量保护。

图5是血清转氨酶ALT的生化学评价对比图。

图6是化合物(6-1)治疗CCl₄诱导的急性肝炎的不同时间点的免疫组化疗效观察，

(A)CCl₄ 2h；

(B)CCl₄ 6h；

(C)CCl₄ 24h；

(D)CCl₄+(6-1) 2h；

(E)CCl₄+(6-1) 6h；

(F)CCl₄+(6-1) 24h。

图7化合物(6-1)治疗肝纤维化的天狼星红染色。A正常组小鼠肝脏仅在中央静脉，汇管区以及大的血管壁有被天狼星红染成色红色的区域。B ConA连续每周注射一次，第4次给药一周以后，可见小鼠肝脏的肝小叶内胶原蛋白呈条索状分布，并分割包绕肝小叶。C化合物(6-1)治疗一周以后，肝小叶内胶原沉积减少，没有条索状分布的肝纤维，及肝小叶的包裹。

图8化合物(6-1)治疗肺纤维化各组大鼠肺组织切片H&E染色。A，模型组；B，25mg/kg化合物(6-1)干预组；C，50mg/kg化合物(6-1)干预组；D，正常组。

图9化合物(6-1)治疗肺纤维化各组大鼠肺组织切片Masson染色和肺内羟脯氨酸含量测定。A，模型组；B，25mg/kg化合物(6-1)干预组；C，50mg/kg化合物(6-1)干预组；D，正常组。

具体实施方式

实施例1：4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-联苯二甲酸(2)的制备

化合物(1)10g，加入15gKOH及300ml水，加热回流6小时，TLC检测反应完毕，冷却到室温过滤除去不容物，用浓盐酸调节PH为2，此时有大量白色固体粉末析出，过滤水洗至中性，真空干燥，得白色固体粉末(2)8.34g，收率89.5％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：3.88(6H，s，2×OCH₃)，5.96(2H，s，OCH₂O)，6.00(2H，s，OCH₂O)，7.26(2H，s，ArH)，12.36(2H，s，COOH)。

实施例2：4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2，2’-联苯二甲酸酐(3)的制备

化合物(2)8.3g，加入乙酸酐50ml，加热回流12h，反应完毕后冷却到室温，旋去溶剂得淡黄色固体粉末，将所得固体粉末加入无水甲苯50ml，混匀后抽滤，并用无水甲苯洗涤3次，得白色固体粉末(3)6.1g，收率73.6％。所得产品未进一步纯化，直接用于下一步反应。

实施例3：4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基-2-甲氧羰基-2’-羧酸联苯(4)的制备

称取化合物(3)6.1g，加入甲醇200ml，加入回流10h，TLC检测反应完毕，冷却到室温，旋去绝大部分甲醇，抽滤，滤饼用乙醇洗涤2次，干燥，得白色固体粉末(4)5.9g，收率96.7％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：3.58(3H，s，COOCH₃)，3.89(6H，s，2×OCH₃)，5.97-6.01(4H，m，OCH₂O)，7.24(1H，s，ArH)，7.27(1H，s，ArH)，12.34(1H，s，COOH)。

实施例4：2-(4-甲酰基苯基)-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(5-1)的制备

称取0.808g化合物(4)，加入10ml无水二氧六环，1.5ml氯化亚砜，1滴DMF，加热回流2小时，减压蒸干溶剂，蒸干后加入无水甲苯20ml，混匀后继续加压蒸干，得黄色固体粉末。将所得黄色固体粉末溶于20ml无水二氯甲烷中，加入三乙胺1.5ml，对羟基苯甲醛0.3908g，室温搅拌过夜，停止反应，用20ml×3水洗三次，饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得褐色泡沫状固体(5-1)0.81g，收率79.7％，所得产品未进一步纯化，直接用于下一步反应。取少许硅胶柱层析纯化，得白色泡沫状固体。¹H-NMR(CDCl₃)δ：3.72(3H，s，COOCH₃)，3.94(3H，s，OCH₃)，4.01(3H，s，OCH₃)，5.99-6.06(4H，m，OCH₂O)，7.19(1H，d，J＝8.8Hz，ArH)，7.38(1H，s，ArH)，7.57(1H，s，ArH)，7.89(1H，d，J＝8.8Hz，ArH)，9.96(1H，s，CHO)

实施例5：(Z)-2-[4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-1)的制备

称取0.508g化合物(5-1)，加入0.35g噻唑烷二酮，0.105g β-丙氨酸及10ml冰乙酸。回流5h，冷却至室温，加入水50ml，用30ml×3二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，二氯甲烷结晶得淡白色固体粉末(6-1)392mg，收率64.6％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：3.63(3H，s，COOCH₃)，3.87(3H，s，OCH₃)，3.95(3H，s，OCH₃)，6.05-6.09(4H，m，OCH₂O)，7.20(1H，d，J＝8.8Hz，ArH)，7.25(1H，s，ArH)，7.48(1H，s，ArH)，7.66(1H，d，J＝8.8Hz，ArH)，7.79(1H，s，CH＝C)，12.64(1H，s，NH)

实施例6：2-(3-乙氧基-4-甲酰基苯基)-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(5-2)的制备

称取1.212g化合物(4)，加入10ml无水二氧六环，1.5ml氯化亚砜，1滴DMF，加热回流2小时，减压蒸干溶剂，蒸干后加入无水甲苯20ml，混匀后继续加压蒸干，得黄色固体粉末。将所得黄色固体粉末溶于20ml无水二氯甲烷中，加入三乙胺1.5ml，3-乙氧基-4羟基苯甲醛0.7978g，室温搅拌过夜，停止反应，用20ml×3水洗三次，饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶柱层析纯化，得白色泡沫状固体(5-2)1.182g，收率71.3％。¹H-NMR(CDCl₃)δ：1.33(3H，t，J＝6.8Hz，CH3CH2)，3.70(3H，s，COOCH₃)，3.92(3H，s，OCH₃)，4.01(3H，s，OCH₃)，4.01(2H，q，J＝7.2Hz J＝14Hz，CH3CH2)，5.99-6.05(4H，m，OCH₂O)，7.16(1H，d，J＝8.0Hz，ArH)，7.26(1H，s，ArH)，7.37(1H，s，ArH)，7.41(1H，d，J＝8.8Hz，ArH)，7.64(1H，s，ArH)，9.91(1H，s，CHO)

实施例7：(Z)-2-[3-乙氧基-4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-2)的制备

称取0.5525g化合物(5-1)，加入0.35g噻唑烷二酮，0.105g β-丙氨酸及10ml冰乙酸。回流5h，冷却至室温，加入水50ml，用30ml×3二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱层析得淡白色固体粉末(6-2)419mg，收率64.3％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：1.23(3H，t，J＝7.2Hz，CH3CH2)，3.61(3H，s，COOCH₃)，3.87(3H，s，OCH₃)，3.95(3H，s，OCH₃)，4.06(2H，q，J＝6.8Hz J＝14Hz，CH3CH2)，6.03-6.09(4H，m，CH₂O)，7.17(2H，s，ArH)，7.25(1H，s，ArH)，7.34(1H，s，ArH)，7.48(1H，s，ArH)，7.66(1H，d，J＝8.8Hz，ArH)，7.79(1H，s，CH＝C)，12.65(1H，s，NH)。

实施例8：2-(3-甲氧基-4-甲酰基苯基)-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(5-3)的制备

称取1.212g化合物(4)，加入10ml无水二氧六环，1.5ml氯化亚砜，1滴DMF，加热回流2小时，减压蒸干溶剂，蒸干后加入无水甲苯20ml，混匀后继续加压蒸干，得黄色固体粉末。将所得黄色固体粉末溶于20ml无水二氯甲烷中，加入三乙胺1.5ml，3-甲氧基-4羟基苯甲醛0.7303g，室温搅拌过夜，停止反应，用20ml×3水洗三次，饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶柱层析纯化，得白色泡沫状固体(5-3)1.1515g，收率71.3％。¹H-NMR(CDCl₃)δ：3.71(3H，s，COOCH₃)，3.83(3H，s，OCH₃)，3.92(3H，s，OCH₃)，4.01(3H，s，OCH₃)，5.99-6.05(4H，m，OCH₂O)，7.15(1H，d，J＝8.0Hz，ArH)，7.36(1H，s，ArH)，7.43-7.45(2H，m，ArH)，7.61(1H，s，ArH)，9.92(1H，s，CHO)。

实施例9：(Z)-2-[3-甲氧基-4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-3)的制备

称取0.5385g化合物(5-1)，加入0.35g噻唑烷二酮，0.105g β-丙氨酸及10ml冰乙酸。回流5h，冷却至室温，加入水50ml，用30ml×3二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱层析得淡白色固体粉末(6-3)536mg，收率84％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：3.65(3H，s，COOCH₃)，3.78(3H，s，OCH₃)，3.86(3H，s，OCH₃)，3.95(3H，s，OCH₃)，6.02-6.09(4H，m，OCH₂O)，7.14-7.17(2H，m，ArH)，7.25(1H，s，ArH)，7.35-7.35(1H，m，ArH)，7.45(1H，s，ArH)，7.80(1H，s，CH＝C)，12.65(1H，s，NH)

实施例10：2-(3-甲酰基苯基)-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(5-4)的制备

称取1.212g化合物(4)，加入10ml无水二氧六环，1.5ml氯化亚砜，1滴DMF，加热回流2小时，减压蒸干溶剂，蒸干后加入无水甲苯20ml，混匀后继续加压蒸干，得黄色固体粉末。将所得黄色固体粉末溶于20ml无水二氯甲烷中，加入三乙胺1.5ml，3-羟基苯甲醛0.5862g，室温搅拌过夜，停止反应，用20ml×3水洗三次，饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶柱层析纯化，得白色泡沫状固体(5-4)1.3485g，收率88.4％。¹H-NMR(CDCl3)δ：3.72(3H，s，COOCH₃)，3.94(3H，s，OCH₃)，4.01(3H，s，OCH₃)，6.00-6.05(4H，m，OCH₂O)，7.29(1H，d，J＝8.0Hz，ArH)，7.38(1H，s，ArH)，7.58(1H，s，ArH)，7.73(1H，d，J＝8.0Hz，ArH)，9.97(1H，s，CHO)。

实施例11：(Z)-2-[3-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-4)的制备

称取0.5084g化合物(5-1)，加入0.35g噻唑烷二酮，0.105g β-丙氨酸及10ml冰乙酸。回流5h，冷却至室温，加入水50ml，用30ml×3二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱层析得淡白色固体粉末(6-3)553mg，收率91％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：3.63(3H，s，COOCH₃)，3.87(3H，s，OCH₃)，3.96(3H，s，OCH₃)，6.05-6.09(4H，m，OCH₂O)，7.13-7.16(1H，m，ArH)，7.19(1H，s，ArH)，7.26(1H，s，ArH)，7.47(1H，s，ArH)，7.49-7.58(2H，m，ArH)，7.78(1H，s，CH＝C)，12.68(1H，s，NH)

实施例12：2-(3，5-二甲氧基-4-甲酰基苯基)-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(5-5)的制备

称取1.212g化合物(4)，加入10ml无水二氧六环，1.5ml氯化亚砜，1滴DMF，加热回流2小时，减压蒸干溶剂，蒸干后加入无水甲苯20ml，混匀后继续加压蒸干，得黄色固体粉末。将所得黄色固体粉末溶于20ml无水二氯甲烷中，加入三乙胺1.5ml，3-甲氧基-4羟基苯甲醛0.8744g，室温搅拌过夜，停止反应，用20ml×3水洗三次，饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，硅胶柱层析纯化，得白色泡沫状固体(5-3)1.3507g，收率79.2％。¹H-NMR(CDCl₃)δ：3.69(3H，s，COOCH₃)，3.83(6H，s，OCH₃)，3.91(3H，s，OCH₃)，4.01(3H，s，OCH₃)，5.97-6.04(4H，m，OCH₂O)，7.10(2H，s，ArH)，7.38(1H，s，ArH)，7.63(1H，s，ArH)，9.88(1H，s，CHO)

实施例11：(Z)-2-[3，5-二甲氧基-4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-5)的制备

称取0.5685g化合物(5-1)，加入0.35g噻唑烷二酮，0.105g β-丙氨酸及10ml冰乙酸。回流5h，冷却至室温，加入水50ml，用30ml×3二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱层析得淡白色固体粉末(6-5)550mg，收率82％。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：3.62(3H，s，COOCH₃)，3.77(6H，s，OCH₃)，3.86(3H，s，OCH₃)，3.94(3H，s，OCH₃)，5.91-6.10(4H，m，OCH₂O)，6.95(2H，s，ArH)，7.24(1H，s，ArH)，7.44(1H，s，ArH)，7.77(1H，s，CH＝C)，12.66(1H，s，NH)

药效学试验部分

实施例1(Z)-2-[4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-1)治疗D-Galn/LPS诱导的急性肝炎

1、实验材料及建模方法：

建模方法：先注射D-Galn 700mg/kg，再注射LPS 4ug/kg

实验动物：BALB/c购自四川大学华西动物中心

动物分组：每组7只，共4组

模型组：D-Galn/LPS诱导

治疗组I：化合物(6-1)12.5mg/kg治疗；D-Galn/LPS诱导后0.5h第一次灌药，

2.5h后第二次灌药

治疗组II：化合物(6-1)25.0mg/kg治疗；D-Galn/LPS诱导后0.5h第一次灌药，

2.5h后第二次灌药

对照组：阳性药物联苯双酯25.0mg/kg治疗；D-Galn/LPS诱导后0.5h第一次灌药，2.5h后第二次灌药，待-8h后，取各组动物取血和肝脏检测ALT和AST，HE染色考察化合物6-1对肝脏的保护效果。

2、对比结论：

图1血清ALT检测显示：新型化合物(6-1)25.0mg/kg能显著降低D-Galn/LPS诱导的血清转氨酶的升高。

图3显示图3B(模型组)的肝血窦扩张、充血，伴有炎症细胞的侵润，肝细胞大面积坏死。图3C(对照组)的肝细胞只有局部坏死，仍有炎症细胞的侵润。图3D(治疗组)的肝血窦充血，周围也有炎症细胞的侵润，只有肝血窦周围有少量肝细胞坏死，说明新型化合物(6-1)有显著地治疗效果。

实施例2生存率

1、实验材料及建模方法：

建模方法：先注射D-Galn 700mg/kg，再注射LPS 5ug/kg

实验动物：BALB/c购自四川大学华西动物中心

实验分组：

模型组：D-Galn/LPS诱导

治疗组：先口服新化合物(6-1)(50mg/kg)，0.5小时后D-Galn/LPS诱导；以后每3小时口服新化合物(6-1)(50mg/kg)一次，持续3次。

2.结论对比：

D-Galn/LPS注射腹腔2h后观察各组小鼠的生存情况(n＝10)，每2h观察记录1次。模型组(D-Galn/LPS)小鼠在24h内，死亡率达到80％，经口服化合物(6-1)的小鼠的18h内死亡率仅为20％，此后小鼠全部生存，持续观察8周。图4说明化合物(6-1)能明显降低D-Galn/LPS致死剂量诱导的死亡率，两组小鼠生存期差异具有统计学意义。

实施例3(Z)-2-[4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-1)治疗四氯化碳(CCl4)诱导的急性肝炎和肝损伤

1、实验材料及建模方法：

建模方法：注射CCL4 2ml/kg

实验动物：SD雌鼠购自四川大学华西动物中心

动物分组：每组7只，共2组

模型组：CCl4 2ml/kg，以橄榄油1∶1(v/v)稀释，腹腔注射一次

治疗组：化合物(6-1)50mg/kg Id治疗后，注射CCl4后灌胃一次。

2，6，24h后各组动物取血和肝脏。

2、对比结论：

不同时间点(2h，6h和24h)的血清ALT检测显示：化合物(6-1)能显著降低CCl4诱导的血清转氨酶升高。

图6显示不同时间点的CCl4模型组和治疗组大鼠肝组织HE染色，从6小时起，肝细胞开始出现水肿，肝血窦扩张，充血，伴炎症细胞的浸润。但此时肝内尚无明显的组织坏死，到第24小时，肝细胞水肿进一步加重，靠近被膜的肝组织大片坏死。与之相比，治疗组的肝细胞水肿及坏死有明显减轻。

实施例4(Z)-2-[4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-1)治疗Con A诱导肝纤维化

1实验材料：

健康雌性8～10周龄Balb/C小鼠，清洁级，由四川大学动物实验中心提供。

ConA剂量为10mg/Kg，无菌生理盐水配制；化合物6-1剂量为50mg/Kg，无菌生理盐水配制。

2实验方法：

实验分四组：正常组，模型组，治疗组。

正常组：不做任何处理。

模型组：每周ConA尾静脉给药，连续给药四次，

治疗组：在第三次注射ConA，化合物(6-1)每天灌胃治疗，治疗一周。

3评价指标：

肝纤维化的病理学评价：天狼星红染色

4.实验结果：化合物(6-1)减轻肝纤维化过程中的胶原蛋白沉着，说明化合物(6-1)具有治疗肝纤维化的作用。如图7所示。

实施例5化合物(6-1)减轻博莱霉素引起的大鼠肺纤维化

化合物(6-1)显著改善了博来霉素诱导的大鼠肺部生理组织结构

在建立肺纤维化模型后第28天处死大鼠，取其右侧肺固定于10％中性福尔马林，经脱水、石蜡包埋后制成病理切片，行HE&Massopm染色观察肺组织病理形态学改变。结果如图8所示：正常对照组(D图)及肺组织结构清晰、正常；博莱霉素处理组(A图)可观察到明显的肺组织纤维化改变：肺泡间隔明显增宽，正常肺组织结构被破坏甚至消失，代之明显的纤维性变；而化合物(6-1)干预组(C图/D图)较未治疗组(A图)，无论是肺组织纤维化的范围还是程度都有明显减少。

化合物(6-1)抑制博莱霉素致大鼠肺纤维化的组织学改变。在博莱霉素处理后第28天处死大鼠，取其右侧肺行HE染色，观察肺组织的形态学改变。放大倍数为100×。博莱霉素气管内注入后可以引起明显的肺间质纤维化：正常肺泡结构被破坏甚至消失，肺泡间隔增宽，肺组织纤维样变。化合物(6-1)干预组(C图/D图)较未治疗组(A图)，肺组织纤维化的范围及程度均明显减轻。

Ashcroft评分也是评价肺部组织结构破坏程度和间质纤维化程度的一个公认的标准，可以对肺纤维化作半定量分析。我们对各组肺组织切片进行了纤维化程度的Ashcroft测评。结果显示(如图E)，正常组评分最低(1.55±0.13)，模型组评分显著增加，达到7.02±0.34，而化合物(6-1)干预组的评分相对于模型组明显降低，只有分别4.34±0.61(25mg/kg化合物6-1干预组)和2.89±0.45(50mg/kg化合物(6-1)干预组)。并且在统计学计算上，模型组相对于正常组，干预组相对于模型组都有显著差异，均为P＜0.05。但与切片观察一致的是，两个不同浓度的干预组之间的评分并没有统计学上的差异。

实施例6化合物(6-1)明显降低了博来霉素诱导的大鼠肺部的胶原沉积和纤维化程度

肺组织切片的Masson染色能够很好的显示肺部肺泡壁、气道壁以及组织间隙间胶原沉积的情况，如图9。染色后，切片中胶原呈现蓝色，其他组织呈现红色。观察各组Masson染色切片可以发现：正常组呈现胶原的蓝色最少，在肺部分布正常，气管和血管周围纤维较多的地方蓝色较明显；模型组纤维化程度很高，有大量的蓝色区域，分布很广，不仅仅局限于集中在气管和血管周围，在肺泡壁、组织间隙间也有大量异常增多的胶原，肺部正常结构被纤维化组织破坏，肺功能严重丧失；在两个干预组的切片中，仍然能够看到不少的胶原沉积，只是分布的区域较模型组明显减少，蓝色的深度也较轻，肺部结构和功能得到了一定的保护。

胶原蛋白含量异常升高是肺纤维化的重要标志，其含量可以用羟脯氨酸来反映。本实验取博莱霉素处理后第28天大鼠肺组织，采用碱水解法测定其含量，结果如图E所示。与模型组相比，化合物(6-1)干预组大鼠肺组织所含羟脯氨酸含量明显减少，差异具有统计学意义，说明化合物(6-1)能有效降低博莱霉素引起的小鼠肺组织胶原蛋白增加，抑制肺纤维化进程。化合物(6-1)降低博莱霉素处理大鼠肺组织的羟脯氨酸含量。采用碱水解法测定博莱霉素处理后第28天各组大鼠肺组织的羟脯氨酸含量。与模型相比，化合物(6-1)治疗组肺羟脯氨酸含量明显降低，P＜0.05，差异有统计学意义。

实施例7(Z)-2-[4-(2，4-噻唑烷二酮-5-亚甲基)苯基]-2’-甲基-4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-二次甲二氧基联苯二甲酸酯(6-1)安全药理评价

化合物(6-1)对小鼠的有效剂量为25mg/kg，折算成犬等效剂量为5.75mg/kg。D-化合物(6-1)对小鼠的有效剂量为25mg/kg，折算成犬等效剂量为5.25mg/kg。本实验设计犬用药组剂量分别为20、100、300mg/kg。另设一组溶剂对照组，给予等体积2.5％吐温80。安全药理显示：化合物6-1安全性好，高剂量(相当于犬有效剂量的57倍)无明显的异常心电图。如表1所示。

表1