CN102247305B - 一种抑制紫外线对皮肤损伤的提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制紫外线对皮肤损伤的提取物及其制备方法与应用。该制备方法包括如下步骤：1)将仙人掌与水混合，在温度为40℃-60℃的条件下反应3h-4h，离心，取上清液，得到仙人掌提取物；2)将银杏叶与水混合，在温度为50℃-80℃的条件下反应3h-5h，离心，取上清液，得到银杏叶提取物；3)将所述仙人掌提取物和所述银杏叶提取物混合，得到仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物。本发明的制备抑制紫外线对皮肤损伤的提取物混合物的方法，不需要有机试剂，操作简便，省去了去除有机试剂的步骤，精简了提取步骤又节省了成本，使得到的产物更加安全。本发明方法得到的提取物的混合物，具有优异的抗紫外线功能。

Description

一种抑制紫外线对皮肤损伤的提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种抑制紫外线对皮肤损伤的提取物及其制备方法与应用。

背景技术

不同的人对光的敏感程度也不同，那些容易晒伤的人就属于光敏感者，照射部位容易出现红肿、红斑或明显的皮炎，荨麻疹和多形性红斑损害，大泡和慢性增厚的鳞屑斑等。皮肤过敏的一般表现是：干燥、瘙痒、红肿和色素沉着等。它与正常的免疫反应不同，不但不起保护作用，相反由于反应过度强烈而导致生理功能紊乱和组织损伤。光敏反应一直困扰着光敏感者，影响其正常生活，因此，需要研发出有效的抑制光敏的产品。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的方法。

本发明所提供的制备仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的方法，包括如下步骤：1)将仙人掌与水混合，在温度为40℃-60℃的条件下反应3h-4h，离心，取上清液，得到仙人掌提取物；2)将银杏叶与水混合，在温度为50℃-80℃的条件下反应3h-5h，离心，取上清液，得到银杏叶提取物；3)将所述仙人掌提取物和所述银杏叶提取物混合，得到仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物。

其中仙人掌指仙人掌的地上生长部分，可为仙人掌粉或其它形式的仙人掌。银杏叶可为银杏叶粉或其它形式的银杏叶粉。仙人掌粉可为购自上虞市海通绿色保健品开发部的仙人掌粉；银杏叶粉可为购自陕西森弗生物技术有限公司的银杏叶粉。

上述方法中，所述步骤1)中，所述仙人掌与水的配比为50g∶(1000ml-1500ml)，具体为50g∶1000ml、50g∶1250ml或50g∶1500ml；所述温度为40℃、50℃或60℃，所述时间为3h、3.5h或4h；

上述方法中，所述步骤2)中，所述银杏叶与水的配比为50g∶(1000ml-1500ml)，具体为50g∶1000ml、50g∶1250ml或50g∶1500ml；所述温度为50℃、60℃或80℃，所述时间为3h、4h或5h；

上述方法中，所述步骤3)中，所述仙人掌提取物和所述银杏叶提取物的体积比为1∶(1-3)，具体为1∶1、1∶2或1∶3。

上述方法中，所述步骤1)中，在所述取上清液后，包括将所述上清液进行如下脱色的步骤：向所述上清液中加入活性炭，在温度为75℃-85℃、pH值为4.5-5.0的条件下搅拌1h-2h，过滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为(1-2)∶100，具体为1∶100或2∶100；所述温度具体为80℃、75℃或85℃，所述pH值为4.5或5.0，所述时间为1h、1.5h或2h；

上述方法中，所述步骤2)中，在所述取上清液后，包括将所述上清液进行如下脱色的步骤：向所述上清液中加入活性炭，在温度为75℃-85℃、pH值为4.5-5.0的条件下搅拌1h-2h，过滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为(1-2)∶100，具体为1∶100或2∶100；所述温度具体为80℃、75℃或85℃，所述pH值为4.5或5.0，所述时间为1h、1.5h或2h。

上述方法中，所述步骤1)中，在所述脱色后，包括将所述滤液进行如下脱盐的步骤：将所述滤液依次用001×7阳离子树脂和D309阴离子树脂进行脱盐处理，得到的溶液记作脱盐滤液。

上述方法中，所述步骤1)中，在所述脱盐后，包括如下浓缩步骤：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/2-1/3，收集浓缩液；

所述步骤2)中，在所述脱色后，包括如下浓缩步骤：将所述滤液的体积浓缩至原体积的1/2-1/3，收集浓缩液。

上述方法中，所述步骤1)中，所述用001×7阳离子树脂进行脱盐处理的方法为：先用4％(体积百分比)的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂在25℃的条件下浸泡24h-48h或24h或36h或48h，再用水冲洗所述001×7阳离子树脂至pH值为7.0，再将所述滤液上样，收集流出的溶液，记作阳离子脱盐滤液；

所述用D309阴离子树脂进行脱盐处理的方法为：先用4％(质量百分比)的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂在25℃的条件下浸泡24h-48h或24h或36h或48h，再用水冲洗所述D309阴离子树脂至pH值为7.0，再将所述阳离子脱盐滤液上样，收集流出的溶液，即为脱盐滤液；

上述方法中，所述步骤1)和所述步骤2)中，所述离心的速度为4000rpm-5000rpm，所述离心的时间为10min-15min；所述离心的速度为4000rpm、4500rpm或5000rpm，所述离心的时间为10min、12min或15min；所述水为去离子水；所述过滤的方法为用硅藻土进行抽滤。

由上述任一所述方法得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种具有抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤功能的产品。

本发明所提供的具有抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤功能的产品，其活性成分为上述任一所述仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物。

上述产品中，所述抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤为抑制紫外线引起的皮肤细胞膜结构损伤、去除紫外线引起的皮肤中的过剩自由基、抑制皮肤中的透明质酸酶活性和/或延迟紫外线引起的皮肤红斑的产生；

所述自由基为超氧阴离子自由基、羟基自由基或DPPH自由基。

所述产品具体可为化妆品。

上述任一所述仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物在制备具有抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤为抑制紫外线引起的皮肤细胞膜结构损伤、去除紫外线引起的皮肤中的过剩自由基、抑制皮肤中的透明质酸酶活性和/或延迟紫外线引起的皮肤红斑的产生；

所述自由基为超氧阴离子自由基、羟基自由基或DPPH自由基。

本发明的制备抑制紫外线对皮肤损伤的提取物混合物的方法，不需要有机试剂，操作简便，省去了去除有机试剂的步骤，精简了提取步骤又节省了成本，使得到的产物更加安全。本发明方法得到的提取物的混合物，具有优异的抗紫外线功能，增加皮肤对紫外线的耐受性，与市售防紫外线产品相比，具有良好的广谱吸收性，高效的清除自由基及抑制透明质酸酶效果，可明显减轻紫外线引起的晒红、晒伤、光毒及光变态反应现象，对因紫外线造成的细胞损伤及皮肤过敏反应具有显著的抑制和修复作用。本发明的提取物的混合物可用于制备防晒、舒敏抗敏系列化妆品。

附图说明

图1为光敏制修复剂降低红细胞溶血率数据图。

图2为光敏抑制修复剂对三种自由基清除率。

图3为光敏抑制修复剂对透明质酸酶抑制率。

图4为光敏抑制修复剂延迟MED效果比率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

仙人掌粉购自上虞市海通绿色保健开发部；银杏叶粉购自陕西森弗生物技术有限公司。

001×7阳离子树脂购自丹东明珠特种树脂有限公司；D309阴离子树脂购自丹东明珠特种树脂有限公司；

实施例1、提取物的制备

方法一、提取物的制备

具体步骤如下：

1、仙人掌提取物的制备：

1)提取：将仙人掌粉与去离子水混合(仙人掌粉与水的配比为50g∶1000ml)，在温度为50℃的条件下反应3h，以4000rpm的速度离心10min，取上清液；

2)脱色：将步骤1)得到的上清液的pH值调至4.5，向其中加入活性炭，在温度为80℃的条件下搅拌1h，用硅藻土进行抽滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为1∶100；脱色的目的是为了去除其中的色素。

3)脱盐：

将步骤2)得到的滤液用001×7阳离子树脂进行脱盐：先用4％(体积百分比)的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂活化[用4％(体积百分比)的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂室温(25℃)浸泡36小时，排去酸液]。

再用纯水冲洗所述001×7阳离子树脂至pH值为7.0，再将步骤2)得到的滤液进行上样，收集流出的溶液，将其记作阳离子脱盐滤液；

将得到的阳离子脱盐滤液用D309阴离子树脂进行脱盐：先用4.5％(质量百分比)的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂活化[用4.5％(质量百分比)的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂室温(25℃)浸泡36小时，排去碱液]。再用纯水冲洗所述D309阴离子树脂至pH值为7.0，再将阳离子脱盐滤液进行上样，收集流出的溶液，将其记作脱盐滤液；

4)浓缩：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/2，收集浓缩液，即得到仙人掌提取物；

2、银杏叶提取物的制备：

1)提取：将银杏叶粉与去离子水混合(仙人掌粉与水的配比为50g∶1000ml)，在温度为60℃的条件下反应4h，以4000rpm的速度离心10min，取上清液；

2)脱色：将步骤1)得到的上清液的pH值调至4.5，向其中加入活性炭，在温度为80℃的条件下搅拌1h，用硅藻土进行抽滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为1∶100；脱色的目的是为了去除其中的色素。

3)浓缩：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/2，收集浓缩液，即得到银杏叶提取物。

3、混合：将步骤1得到的仙人掌提取物与步骤2得到的银杏叶提取物以1∶1的体积比混合均匀，即得到仙人掌提取物与银杏叶提取物的混合物。

方法二、提取物的制备

1、仙人掌提取物的制备：

1)提取：将仙人掌粉与去离子水混合(仙人掌粉与水的配比为50g∶1250ml)，在温度为40℃的条件下反应4h，以4500rpm的速度离心12min，取上清液；

2)脱色：将步骤1)得到的上清液的pH值调至5.0，向其中加入活性炭，在温度为85℃的条件下搅拌1.5h，用硅藻土进行抽滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为1∶100；

3)脱盐：

将步骤2)得到的滤液用001×7阳离子树脂进行脱盐：先用4％(体积百分比)的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂活化[用4％(体积百分比)的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂室温(25℃)浸泡24小时，排去酸液]。再用纯水冲洗所述001×7阳离子树脂至pH值为7.0，再将步骤2)得到的滤液进行上样，收集流出的溶液，将其记作阳离子脱盐滤液；

将得到的阳离子脱盐滤液用D309阴离子树脂进行脱盐：先用4.5％(质量百分比)的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂活化[用4.5％(质量百分比)的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂室温(25℃)浸泡24小时，排去碱液]。再用纯水冲洗所述D309阴离子树脂至pH值为7.0，再将阳离子脱盐滤液进行上样，收集流出的溶液，将其记作脱盐滤液；

4)浓缩：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/3，收集浓缩液，即得到仙人掌提取物；

2、银杏叶提取物的制备：

1)提取：将银杏叶粉与去离子水混合(仙人掌粉与水的配比为50g∶1250ml)，在温度为50℃的条件下反应5h，以4500rpm的速度离心12min，取上清液；

2)脱色：将步骤1)得到的上清液的pH值调至5.0，向其中加入活性炭，在温度为85℃的条件下搅拌1.5h，用硅藻土进行抽滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为1∶100；

3)浓缩：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/3，收集浓缩液，即得到银杏叶提取物。

3、混合：将步骤1得到的仙人掌提取物与步骤2得到的银杏叶提取物以1∶3的体积比混合均匀，即得到仙人掌提取物与银杏叶提取物的混合物。

方法三、提取物的制备

具体步骤如下：

1、仙人掌提取物的制备：

1)提取：将仙人掌粉与去离子水混合(仙人掌粉与水的配比为50g∶1500ml)，在温度为60℃的条件下反应3.5h，以5000rpm的速度离心15min，取上清液；

2)脱色：将步骤1)得到的上清液的pH值调至4.5，向其中加入活性炭，在温度为75℃的条件下搅拌2h，用硅藻土进行抽滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为2∶100；

3)脱盐：

将步骤2)得到的滤液用001×7阳离子树脂进行脱盐：先用4％(体积百分比)的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂活化[用4％(体积百分比)的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂室温(25℃)浸泡48小时，排去酸液]。再用纯水冲洗所述001×7阳离子树脂至pH值为7.0，再将步骤2)得到的滤液进行上样，收集流出的溶液，将其记作阳离子脱盐滤液；

将得到的阳离子脱盐滤液用D309阴离子树脂进行脱盐：先用4.5％(质量百分比)的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂活化[用4.5％(质量百分比)的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂室温(25℃)浸泡48小时，排去碱液]。再用纯水冲洗所述D309阴离子树脂至pH值为7.0，再将阳离子脱盐滤液进行上样，收集流出的溶液，将其记作脱盐滤液；

4)浓缩：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/2，收集浓缩液，即得到仙人掌提取物；

2、银杏叶提取物的制备：

1)提取：将银杏叶粉与去离子水混合(仙人掌粉与水的配比为50g∶1500ml)，在温度为80℃的条件下反应3h，以5000rpm的速度离心15min，取上清液；

2)脱色：将步骤1)得到的上清液的pH值调至4.5，向其中加入活性炭，在温度为75℃的条件下搅拌2h，用硅藻土进行抽滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为2∶100；

3)浓缩：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/2，收集浓缩液，即得到银杏叶提取物。

3、混合：将步骤1得到的仙人掌提取物与步骤2得到的银杏叶提取物以1∶2的体积比混合均匀，即得到仙人掌提取物与银杏叶提取物的混合物。

实施例2、提取物的功能及其应用

将实施例1中方法一、二、三得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物分别依次进行如下实验。

一、保护细胞膜试验

氯丙嗪是公认的能够导致皮肤光过敏的药物，其在紫外线激发下，极易失去电子变成药物自由基，这些自由基与紫外线照射下产生的活性氧自由基等易攻击细胞膜脂双层的不饱和脂肪酸链，产生过氧化脂质，从而使细胞膜结构损伤。在氯丙嗪的存在下，较短时间、较少的紫外线照射量既能引起膜损伤。

实验采用光敏物质在紫外线诱导下导致红细胞膜损伤，通过检测红细胞损伤后上清液中的血红蛋白含量，计算溶血率，从而反映细胞损伤程度及光敏抑制修复剂对细胞的保护程度。

盐酸氯丙嗪购自千辉药业(安徽)有限责任公司，每片含盐酸氯丙嗪25mg，取10片去糖衣，碾碎使其溶解于PBS中，定容至250mL容量瓶，制成1.0mg/mL溶液，记作盐酸氯丙嗪溶液。

红细胞按照如下方法制备：屠宰场取新鲜鸡血450mL，盛装于聚乙烯塑料容器中，与50mL柠檬酸缓冲液混匀。立即将混匀血样保温于保温箱中，温度为21-22℃。30分钟内运于实验室，若血样没有受到污染，时间可延长至1小时，将得到的混合物记作红细胞样品溶液。

红细胞悬液的配制：吸取1mL红细胞样品溶液于25mL容量瓶中，用PBS定容，稀释成1∶24的红细胞悬液。取200μL于2mL EP管中，加入1.8mL缓冲液，即将悬液稀释10倍，重复此操作一次，即将细胞悬液稀释成100倍，在显微镜下计数，确定细胞个数及浓度。

取干净6孔细胞培养板，用PBS冲洗。每孔中加入3mL 1.0mg/mL盐酸氯丙嗪溶液，紫外灯下照射，每5min取出测定吸光度，消除药物本身经UV照射可能引起的吸光度改变的影响因素。

取干净6孔细胞培养板，用PBS冲洗。在6孔板各孔中加入1mL红细胞悬液，然后加盐酸氯丙嗪溶液1mL和1mL PBS缓冲液，混匀。同时做两块实验板，一块添加盐酸氯丙嗪溶液，另一块以1mL PBS代替盐酸氯丙嗪溶液，将两块板同时放置在UV光源下照射，当照射功率固定不变，以不同的照射时间观察盐酸氯丙嗪对红细胞的致溶血反应。之后每照射5min分别取出加入盐酸氯丙嗪药液与未加入盐酸氯丙嗪药液的红细胞混合液，10,000r/min离心1min，取出上清液，于紫外分光光度计540nm处测吸收值。抑制UV损伤实验只需在加盐酸氯丙嗪药物之前向体系中加入1mL提取物混合物(使提取物混合物在反应体系中的质量百分比浓度分别为：1％、2％、5％和10％)，静置10min，对照板加入1mL缓冲液，之后与上述方法一致。

血清稀释板中加入1mL红细胞悬液，再加入2mL超纯水混匀，吸取2mL摇匀10min使其全部溶血，此时540nm处测得吸光度为RBC100％溶血吸光度值。

溶血率的计算见公式：

其中：A1：样品经UV照射后在540nm处吸光度值。

A2：样品未经UV照射后在540nm处吸光度值。

A3：未加RBC的样品在540nm处吸光度值。

A4：RBC 100％溶血在540nm处吸光度值。

实施例1中方法一得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果如图1所示，提取物混合物在5.0％的使用量时即具有很好的保护效果，可保护红细胞40分钟不溶血；当空白组溶血率已达100％时，10％用量的提取物混合物组依旧未发生溶血。说明该提取物混合物能够抑制紫外线引起的细胞膜结构损伤，在抗光敏治疗中，可保证从源头上阻断紫外线对细胞造成的损伤，从而达到防光抗敏的功效。

实施例1中方法二和三得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果与上述结果无显著差异。

二、清除过剩自由基

自由基，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。生物体系主要遇到的是超氧阴离子自由基、羟自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基等。过多的自由基会导致人体正常细胞和组织的损坏，从而导致人体出现一系列不适症状。

自由基对人体的损害主要有三个方面：一、使细胞膜被破坏；二、使血清抗蛋白酶失去活性；三、损伤基因导致细胞变异的出现和蓄积。自由基对人体的攻击首先从细胞膜开始的。细胞膜极富弹性和柔韧性，这是由它松散的化学结构决定的，正因为如此，其电子很容易丢失，因此细胞膜极易遭受自由基的攻击。一旦被自由基夺走电子，细胞膜就会失去弹性并丧失一切功能。现有技术研究表明，紫外线照射下会产生大量自由基，过多自由基的堆积会成为光敏反应发生的必要因素，它能攻击人体细胞、组织从而导致个器官功能的丧失。

实验采用0.5％、1.0％、2.0％、4.0％四个梯度的测试浓度(即提取物混合物在反应体系中的质量百分比浓度分别为0.5％、1.0％、2.0％、4.0％)，分别测定其对超氧阴离子自由基(.O²)、羟自由基(.OH)、DPPH自由基(DPPH)的清除率。

1、对超氧阴离子清除作用的测定

取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml，置于25℃水浴中预热20min，分别加入1ml不同浓度的试样和0.4ml 25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入8mol/L HCl1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，在299nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以1ml试样溶剂代替样品，每个处理均做三个重复。

清除率的计算公式：超氧阴离子自由基清除率(％)＝100(A1-A2)/A1，其中A1为空白的平均吸光度，A2为试样的平均吸光度。

2、对羟自由基清除作用的测定

羟基自由基由Fenton反应产生，·OH氧化水杨酸产生对510nm光有特征吸收的2，3-二羟基苯甲酸，通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物确定·OH的清除率。在25ml比色管中2mmol/L FeSO₄3ml、1mmol/L H₂O₂3ml，摇匀，接着加入6mmol/L水杨酸3ml，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度A₀。然后分别加入不同浓度的待测液1ml，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度Ax。

待测液对·OH清除率为：·OH清除率(％)＝100(A₀-Ax)/A₀

3、对DPPH·自由基清除作用的测定

按照Larrauri方法，准确称取20mgDPPH·，用无水乙醇定容于250ml容量瓶中，得到浓度为20mmol/L的DPPH·溶液，将提取物样品分别用蒸馏水稀释成不同浓度的测试液。取2ml测试液及2ml的20mmol/L DPPH·混匀后反应30min，测定波长517nm下吸光度的变化，对照溶剂用无水乙醇代替，按下式计算抗氧化物质的抑制率。

抑制率(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中，Ai为2mlDPPH·液与2ml提取液的吸光度；Aj为2ml提取液与2ml无水乙醇的吸光度；Ac为2mlDPPH·液与2ml无水乙醇的吸光度。

实施例1中方法一得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果如图2所示。结果表明：本发明的提取物混合物具有极强的清除DPPH自由基(DPPH)和羟自由基(.OH)能力，在4.0％的使用量时，DPPH和.OH自由基的清除能力能够分别达到90.3％和92.5％。说明本发明的提取物混合物能够去除紫外线引起的皮肤中的自由基，通过清除过剩的自由基，切断其进攻机体途径从而达到调节免疫，改善机体各项功能。

实施例1中方法二和三得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果与上述结果无显著差异。

三、抑制透明质酸酶活性试验

方法：采用透明质酸酶体外抑制实验检测本发明的提取物混合物抑制透明质酸酶活性效果，实验测试浓度分别采用0.5％，1.0％，2.0％，5.0％浓度的本发明的提取物混合物(即提取物混合物在反应体系中的质量百分比浓度分别为0.5％，1.0％，2.0％，5.0％)。

醋酸缓冲溶液(pH＝5.6)：量取1.155mL冰乙酸稀释至100mL混匀后取其中4.8mL为A溶液；称取2.72g乙酸钠结晶加水溶解定容至100mL混匀后取其中45.2mL为B溶液；混合溶液A、B，以水定容至100mL混匀。精密测定其PH值，用溶液A或B调至5.6即可。

透明质酸酶溶液：称取透明质酸酶10mg置于烧杯中加入4mL醋酸缓冲溶液，使该酶在反应体系中的最终浓度为1250unit/mL。

0.5mg/mL透明质酸钠溶液：称取透明质酸钠5mg置于烧杯中加入10mL醋酸缓冲溶液，得0.5mg/mL透明质酸钠溶液。

埃尔利希试剂(Ehrlich reagent)：称取0.8g对-二甲氨基苯甲醛溶于15mL浓盐酸和15mL无水乙醇中。

乙酰丙酮溶液：取乙酰丙酮3.5mL溶于50mL1.0mol/L的碳酸钠溶液中，此溶液在用前配制。

具体实验步骤

取0.1mL 0.25mmol/L CaCl₂溶液和0.5mL透明质酸酶溶液37℃保温培养20min；加入样品液0.5mL，继续37℃保温培养20min；加入0.5mL透明质酸钠液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.1mL0.4mol/L NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0mL并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定其吸光度值。

透明质酸酶抑制率的计算

样品对透明质酸酶抑制率的测定计算公式见公式：

式中：A——对照溶液ABS值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)

B——对照空白溶液ABS值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)

C——试样溶液ABS值

D——试样空白溶液ABS值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)

实验时先对A组试样进行450~700nm范围的波长扫描，以确定最大吸收波长，然后以去离子水作为参比，在该最大吸收波长处分别进行相关组ABS值测定。

实施例1中方法一得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果如图3所示。结果表明，本发明提取物混合物在0.5％的使用量时，透明质酸酶抑制率为34.6％，当使用量达到5.0％时，其透明质酸酶抑制率可达63.2％，体现出很好的抑制透明质酸酶活性的功效，能够很大程度的抑制透明质酸酶对透明质酸的酶解，起到很好的抗敏作用。

实施例1中方法二和三得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果与上述结果无显著差异。

四、抑制皮肤红斑试验

本实验均经过各测试者的同意。

MED(最小红斑量)，是在固定的条件(光源和距离)引起皮肤产生刚可见的红斑所需的时间或毫焦耳/平方厘米(mJ/cm2)。MED值得测定是光斑贴试验的基础，在此基础上可进一步检测光敏物所引起的光毒及光变态反应。测定方法：北京工商大学植物资源研究开发重点实验室随机选取健康无紫外线过敏史者30人，实验前，将30名志愿者(男：15名，女：15名)上臂用清水清洗净，用GS2006型MULTI-WAVELENGTHRANGE SPF TESTER(多波长SPF测试仪)在上臂内侧进行。按阶梯递增的剂量照射各孔2小时，之后每隔6小时观察结果。确定每个人的MED值。

实验采用预先在上臂表面涂抹含5.0％本发明提取物混合物的膏霜，后根据每人不同MED值进行照射至红斑产生，之后每隔6小时进行观察。

实施例1中方法一得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果如图4所示。显示：红斑发生时间由18小时延长至24小时的人数由3人增至8人，发生时间由12小时延长至18小时人数由6人增至15人。表明本发明提取物混合物能明显延长红斑产生的时间即延迟紫外线引起的皮肤红斑的产生，证明本发明提取物混合物具有抗紫外线保护皮肤不受照射损伤的作用。

实施例1中方法二和三得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的结果与上述结果无显著差异。

Claims (11)

1.一种制备仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物的方法，包括如下步骤：

1)将仙人掌与水混合，在温度为40℃-60℃的条件下反应3h-4h，离心，取上清液，得到仙人掌提取物；

2)将银杏叶与水混合，在温度为50℃-80℃的条件下反应3h-5h，离心，取上清液，得到银杏叶提取物；

3)将所述仙人掌提取物和所述银杏叶提取物混合，得到仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物；

所述步骤1)中，所述仙人掌与水的配比为50g∶(1000ml-1500ml)；

所述步骤2)中，所述银杏叶与水的配比为50g∶(1000ml-1500ml)；

所述步骤3)中，所述仙人掌提取物和所述银杏叶提取物的体积比为1∶(1-3)；

所述步骤1)中，在所述取上清液后，包括将所述上清液进行如下脱色的步骤：向所述上清液中加入活性炭，在温度为75℃-85℃、pH值为4.5-5.0的条件下搅拌1h-2h，过滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为(1-2)∶100；

所述步骤2)中，在所述取上清液后，包括将所述上清液进行如下脱色的步骤：向所述上清液中加入活性炭，在温度为75℃-85℃、pH值为4.5-5.0的条件下搅拌1h-2h，过滤，取滤液；所述活性炭与所述上清液的质量份数比为(1-2)∶100；

所述步骤1)中，在所述脱色后，包括将所述滤液进行如下脱盐的步骤：将所述滤液依次用001×7阳离子树脂和D309阴离子树脂进行脱盐处理，得到的溶液记作脱盐滤液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述步骤1)中，所述仙人掌与水的配比为50g∶1000ml、50g∶1250ml或50g∶1500ml；所述温度为40℃、50℃或60℃，所述时间为3h、3.5h或4h；

所述步骤2)中，所述银杏叶与水的配比为50g∶1000ml、50g∶1250ml或50g∶1500ml；所述温度为50℃、60℃或80℃，所述时间为3h、4h或5h；

所述步骤3)中，所述仙人掌提取物和所述银杏叶提取物的体积比为1∶1、1∶2或1∶3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述活性炭与所述上清液的质量份数比为1∶100或2∶100；所述温度为80℃、75℃或85℃，所述pH值为4.5或5.0，所述时间为1h、1.5h或2h；

所述步骤2)中，所述活性炭与所述上清液的质量份数比为1∶100或2∶100；所述温度为80℃、75℃或85℃，所述pH值为4.5或5.0，所述时间为1h、1.5h或2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，在所述脱盐后，包括如下浓缩步骤：将所述脱盐滤液的体积浓缩至原体积的1/2-1/3，收集浓缩液；

所述步骤2)中，在所述脱色后，包括如下浓缩步骤：将所述滤液的体积浓缩至原体积的1/2-1/3，收集浓缩液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述用001×7阳离子树脂进行脱盐处理的方法为：先用体积百分比为4％的HCl水溶液将所述001×7阳离子树脂在25℃的条件下浸泡24h-48h，再用水冲洗所述001×7阳离子树脂至pH值为7.0，再将所述滤液上样，收集流出的溶液，记作阳离子脱盐滤液；

所述用D309阴离子树脂进行脱盐处理的方法为：先用质量百分比为4.5％的NaOH水溶液将所述D309阴离子树脂在25℃的条件下浸泡24h-48h，再用水冲洗所述D309阴离子树脂至pH值为7.0，再将所述阳离子脱盐滤液上样，收集流出的溶液，即为脱盐滤液；

所述步骤1)和所述步骤2)中，所述离心的速度为4000rpm-5000rpm，所述离心的时间为10min-15min；

所述水为去离子水；所述过滤的方法为用硅藻土进行抽滤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)和所述步骤2)中，所述离心的速度为4000rpm、4500rpm或5000rpm，所述离心的时间为10min、12min或15min。

7.由权利要求1-6中任一所述方法得到的仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物。

8.一种具有抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤功能的产品，其活性成分为权利要求7中所述仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤为抑制紫外线引起的皮肤细胞膜结构损伤、去除紫外线引起的皮肤中的过剩自由基、抑制皮肤中的透明质酸酶活性和/或延迟紫外线引起的皮肤红斑的产生；

所述自由基为羟基自由基或DPPH自由基。

10.权利要求7中所述仙人掌提取物和银杏叶提取物的混合物在制备具有抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤功能的产品中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述抑制和/或修复紫外线对皮肤的损伤为抑制紫外线引起的皮肤细胞膜结构损伤、去除紫外线引起的皮肤中的过剩自由基、抑制皮肤中的透明质酸酶活性和/或延迟紫外线引起的皮肤红斑的产生；

所述自由基为羟基自由基或DPPH自由基。

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