CN102226208A - D-天冬酰胺的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于采用以下步骤：(1)在130℃～180℃条件下，L-天冬氨酸与邻苯二甲酸酐反应，生成邻苯二甲酰-L-天冬氨酸；(2)步骤(1)获得邻苯二甲酰-L-天冬氨酸与醋酸酐及消旋试剂一起回流反应20～60分钟，生成邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐；(3)将步骤(2)获得邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐与氨的四氢呋喃溶液反应，得到邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺；(4)将步骤(3)得到邻苯二甲酰-DL-天冬酰氨与水合肼反应，脱除邻苯二甲酰基得到产物DL-天冬酰胺；(5)将步骤(4)得到DL-天冬酰胺利用微生物的L-天冬酰胺酶，专一性水解其中的L-天冬酰胺，分离得D-天冬酰胺与L-天冬氨酸。

Description

D-天冬酰胺的制备方法
技术领域
本发明涉及一种D-天冬酰胺的制备方法，属于化学生物学领域。
背景技术
D-天冬酰胺是一种重要的药物合成中间体，可用于制备具有良好的催产性和降低血压性的催产素，亦可以用作重要的药物中间体β-Homo-天冬酰胺原料。此外，D-天冬酰胺还常用于药理学方面的研究，研究表明它对雾化氨水刺激引起的小鼠咳嗽以及乙酰胆碱和组织胺引起的豚鼠哮喘有明显的抑制作用，还可用于治疗支气管炎。
D-天冬酰胺的合成方法文献报道很少，国内有学者(中国专利200810020843.2)以DL-天冬氨酸甲酯为原料，经化学拆分得到D-天冬氨酸-β-甲酯；再将D-天冬氨酸-β-甲酯进行氨解得到D-天冬酰胺。制备过程所用拆分剂价格昂贵，D-天冬酰胺收率低。目前制备D-型氨基酸的主流方法是以廉价的L-氨基酸为原料，经化学或生物的方法消旋得到DL-氨基酸，再用生物或化学拆分的方法获得D-型氨基酸。但作为制备D-天冬酰胺的原料DL-天冬酰胺难以用L-天冬酰胺经化学消旋得到，主要是由于L-天冬酰胺的β-酰胺基不稳定，消旋过程中易分解。因此，DL-天冬酰胺基本上是直接用化学方法合成的。DL-天冬酰胺的化学合成方法，主要有(1)以顺酐(马来酸酐)为原料，经一系列化学反应，最后合成DL-天冬酰胺(J.Am.Chem.Soc.，75，330-332，1953；精细化工，17(2)，112-114，2000)；(2)以DL-天冬氨酸为原料，与邻苯二甲酸酐反应生成邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸，再与醋酐回流反应得邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐，再经氨解、脱保护基得到DL-天冬酰胺(J.Chem.Soc.，3315，1949)。我们对方法(2)进行了改进，不仅可以用DL-天冬氨酸也可以用L-天冬氨酸为原料，合成DL-天冬酰胺。起初试图利用微生物中的L-天冬酰胺α-脱羧酶，转化DL-天冬酰胺中L型对映体，分离制备D-天冬酰胺，结果发现多种微生物中的L-天冬酰胺α-脱羧酶的活性都很低，难以用此方法获得D-天冬酰胺。最后通过实验发现，埃希氏菌E.coli AS 1.588菌体中的L-天冬酰胺酶能专一水解L-天冬酰胺为L-天冬氨酸，通过等电点结晶和离子交换柱完成了D-天冬酰胺与L-天冬氨酸的分离。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用廉价的DL-天冬氨酸或L-天冬氨酸为原料，通过化学合成与生物转化制备D-天冬酰胺的方法、其技术方案为：
一种D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
(1)在130℃～180℃条件下，L-天冬氨酸与邻苯二甲酸酐反应生成邻苯二甲酰-L-天冬氨酸；
(2)步骤(1)获得邻苯二甲酰-L-天冬氨酸与醋酸酐及消旋试剂一起回流反应，生成邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐；
(3)将步骤(2)获得邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐与氨的四氢呋喃溶液反应，得到邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺；
(4)将步骤(3)得到邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺与水合肼反应，脱除邻苯二甲酰基得到DL-天冬酰胺；
(5)将步骤(4)得到DL-天冬酰胺，利用微生物的L-天冬酰胺酶，专一性水解其中的L-天冬酰胺，分离得D-天冬酰胺与L-天冬氨酸。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(1)中，L-天冬氨酸与邻苯二甲酸酐的摩尔比为0.8～1.2，反应温度130℃～180℃，反应时间20～60分钟。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(2)中，醋酸酐与邻苯二甲酰-L-天冬氨酸的摩尔比为1.8～10，消旋试剂用量为原料量的0.1～1％，回流反应时间为20～60分钟。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(2)中消旋试剂指的是邻苯二甲酰亚胺的碱金属盐或乙酸钠。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(3)中氨的四氢呋喃溶液中氨的质量百分比浓度为1～10％，氨与邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐摩尔比为1.0～10，反应温度为0～40℃。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(4)中水合肼与邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺摩尔比为1.0～5.0，在乙醇中回流反应30～60分钟。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(5)中微生物指的是埃希氏菌E.coli AS 1.588菌株。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(5)中专一性水解反应指的是利用已培养的含酶细胞与DL-天冬酰胺溶液混合，再加入表面活性剂吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵，在温度28～45℃、pH值6.5～8.5条件下，进行酶促反应。
所述的D-天冬酰胺的制备方法，在步骤(5)中分离D-天冬酰胺与L-天冬氨酸是采用等电点结晶法和离子交换法。
本发明与现有技术相比，在化学合成DL-天冬酰胺以及生物转化制备D-天冬酰胺方面都有着显著的有益效果，主要表现在：
(一)化学合成DL-天冬酰胺
1、邻苯二甲酰-L-天冬氨酸与醋酸酐及少量消旋试剂一起回流反应，直接生成邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐，扩大了制备DL-天冬酰胺原料范围，不仅可以使用DL-天冬氨酸，也可以直接使用L-天冬氨酸为原料，制备DL-天冬酰胺；
2、以四氢呋喃的氨溶液替代乙醚氨溶液，提高了反应先择性；
3、采用乙醇回流脱除保护基(邻苯二甲酰基)，大大缩短了反应时间，显著提高了产物的收率。
(二)生物转化制备D-天冬酰胺
1、采用E.coli.AS1.588菌株，DL-天冬酰胺为原料，反应条件温和，L-天冬酰胺酶专一性强、活性高，转化效率高；
2、转化产物D-天冬酰胺与L-天冬氨酸理化性质有较大差异，可以用简单的等电点结晶法分离，分离成本低；
3、原料来源丰富，价格低廉，整过制备过程操作简便，适合大规模生产。
具体实施方法
实施例1
1)148克邻苯二甲酸酐与133克L-天冬氨酸混合，升温至155℃，反应50分钟，加水1000毫升溶解，冷却析出晶体；过滤、干燥得252克邻苯二甲酰-L-天冬氨酸；
2)252克邻苯二甲酰-L-天冬氨酸和0.5克邻苯二甲酰亚胺的钠盐加入到300毫升醋酸酐中，回流反应30分钟，冷却结晶，过滤、干燥得到邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐226克；
3)122.5克邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐加入到200毫升含氨5％的四氢呋喃氨溶液中，室温反应2小时，蒸出并回收四氢呋喃，固体物加入600毫升水，用6M氢氧化钠溶液调节pH值至9使固体物全部溶解，再用6M的盐酸调节pH值至3，重新析出固体产物，过滤、干燥得98克邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺；
4)79克邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺和20克80％的水合肼分别加入到300毫升无水乙醇中，回流反应60分钟，冷却、过滤收集固体物，将所得固体加入到300毫升水中，用6M的盐酸调节pH值至3，过滤除去固体，酸性滤液用氨水调节pH值到6，减压浓缩、冷却结晶、过滤、干燥得到36.2克DL-天冬酰胺；
5)将E.coli.AS1.588菌株培养在含蛋白胨10克，NaCl 5克，牛肉膏3克，L-天冬酰胺1克的1000毫升培养基中，维持pH 7.0，温度35℃，摇瓶振荡培养12小时，4000rpm离心15分钟得湿细胞。将所得细胞加入到含DL-天冬酰胺36克、吐温-80 0.03克的600毫升pH为7的硼酸缓冲液中，37℃振荡反应36小时，L-天冬酰胺转化率大于98％。将反应液用6M的NaOH调pH值到6，升温到60℃，活性碳脱色，过滤除去菌体，滤液用6M的盐酸调pH值至3，减压浓缩到120毫升，冷却结晶，过滤、干燥得13克L-天冬氨酸；L-天冬氨酸结晶母液加水稀释，用6M的NaOH调pH值到5，上大孔强碱性阴离子交换树脂D201吸附L-天冬氨酸，含D-天冬酰胺的流出液调节pH值到6，活性碳脱色、滤液碱压浓缩至50毫升，加入等体积的95％乙醇，析出晶体，过滤、干燥得15.1克D-天冬酰胺，结晶母液循环套用。
实施例2
1)178克邻苯二甲酸酐与133克L-天冬氨酸混合，升温至180℃，反应20分钟，加水1000毫升溶解，活性碳脱色，冷却析出晶体；过滤、干燥得255克邻苯二甲酰-L-天冬氨酸；
2)255克邻苯二甲酰-L-天冬氨酸和1.0克乙酸钠加入到300毫升醋酸酐中，回流反应20分钟，冷却结晶，过滤、干燥得到邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐220克；
3)122.5克邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐加入到300毫升含氨10％的四氢呋喃氨溶液中，室温反应2小时，蒸出并回收四氢呋喃，固体物加600毫升水，用氢氧化钠溶液调节pH值至9使固体物全部溶解，再用6M的盐酸调节pH值至3，重新析出固体产物，过滤、干燥得90克邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺；
4)79克邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺和40克80％的水合肼分别加入到300毫升无水乙醇中，回流反应反应20分钟，冷却、过滤收集固体物，将所得固体加入到300毫升水中，用6M的盐酸调节pH值至3，过滤除去固体，酸性滤液用氨水调节pH值到6，减压浓缩、冷却结晶、过滤、干燥得到36.4克DL-天冬酰胺；
5)以下操作参数和步骤与实施例1完全相同。
实施例3
1)120克邻苯二甲酸酐与133克L-天冬氨酸混合，升温至130℃，反应60分钟，加水1000毫升溶解，冷却析出晶体；过滤、干燥得180克邻苯二甲酰-L-天冬氨酸；
2)180克邻苯二甲酰-L-天冬氨酸和0.5克邻苯二甲酰亚胺的钠盐加入到300毫升醋酸酐中，回流反应60分钟，冷却结晶，过滤、干燥得到邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐162克；
3)122.5克邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐加入到300毫升含氨4％的四氢呋喃氨溶液中，室温反应2小时，蒸出并回收四氢呋喃，固体物加600毫升水并用氢氧化钠溶液调节pH值至9使固体物全部溶解，再用6M的盐酸调节pH值至3，重新析出固体产物，过滤、干燥得92克邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺；
4)79克邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺和25克80％的水合肼分别加入到300毫升无水乙醇中，回流反应反应40分钟，冷却、过滤收集固体物，将所得固体加入到300毫升水中，用6M的盐酸调节pH值至3，过滤除去固体，酸性滤液用氨水调节pH值到6，减压浓缩、冷却结晶、过滤、干燥得到35.9克DL-天冬酰胺；
5)以下操作参数和步骤与实施例1完全相同。
实施例4
1)化学合成DL-天冬酰胺(实施例1中的步骤1至4)的操作参数及步骤与实施例1完全相同；
2)将E.coli.AS1.588菌株培养在含玉米浆5克，NaCl 5克，牛肉膏10克，L-天冬酰胺1克的1000毫升培养基中，维持pH 7.2，温度37℃，摇瓶振荡培养12小时，4000rpm离心15分钟得湿细胞。将所得细胞加入到含DL-天冬酰胺36克、CTAB 0.02克的600毫升pH为7.2的Tris缓冲液中，35℃振荡反应48小时，L-天冬酰胺转化率大于95％。将反应液用6M的NaOH调pH值到6，升温到60℃，加活性碳脱色，过滤除去菌体，滤液用6M的盐酸调pH值至3，减压浓缩到120毫升，冷却结晶，过滤、干燥得12.6克L-天冬氨酸；L-天冬氨酸结晶母液加水稀释，用6M的NaOH调pH值到5，上弱酸型阳离子交换树脂101吸附D-天冬酰胺，吸附饱和后，用1％稀氨水洗脱，收集洗脱液，调节pH值到6，活性碳脱色、滤液碱压浓缩至50毫升，加入等体积的95％乙醇，析出晶体，过滤、干燥得14.8克D-天冬酰胺，结晶母液循环套用。

Claims (9)

1.一种D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于采用以下步骤：
(1)在130℃～180℃条件下，L-天冬氨酸与邻苯二甲酸酐反应生成邻苯二甲酰-L-天冬氨酸；
(2)步骤(1)获得邻苯二甲酰-L-天冬氨酸与醋酸酐及消旋试剂一起回流反应，生成邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐；
(3)将步骤(2)获得邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐与氨的四氢呋喃溶液反应，得到邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺；
(4)将步骤(3)得到邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺与水合肼反应，脱除邻苯二甲酰基得到DL-天冬酰胺；
(5)将步骤(4)得到DL-天冬酰胺，利用微生物的L-天冬酰胺酶，专一性水解其中的L-天冬酰胺，分离得D-天冬酰胺与L-天冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，L-天冬氨酸与邻苯二甲酸酐的摩尔比为0.8～1.2，反应温度130℃～180℃，反应时间20～60分钟。
3.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，醋酸酐与邻苯二甲酰-L-天冬氨酸的摩尔比为1.8～10，消旋试剂用量为原料量的0.1～1％，回流反应时间为20～60分钟。
4.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中消旋试剂指的是邻苯二甲酰亚胺的碱金属盐或乙酸钠。
5.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中氨的四氢呋喃溶液中氨的质量百分比浓度为1～10％，氨与邻苯二甲酰-DL-天冬氨酸酐摩尔比为1.0～10，反应温度为0～40℃。
6.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中水合肼与邻苯二甲酰-DL-天冬酰胺摩尔比为1.0～5.0，在乙醇中回流反应30～60分钟。
7.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中微生物指的是埃希氏菌E.coli AS 1.588菌株。
8.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中专一性水解反应指的是利用已培养的含酶细胞与DL-天冬酰胺溶液混合，再加入表面活性剂吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵，在温度28～45℃、pH值6.5～8.5条件下，进行酶促反应。
9.根据权利要求1所述的D-天冬酰胺的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中分离D-天冬酰胺与L-天冬氨酸是采用等电点结晶法和离子交换法。
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