CN102204990A - 一种降糖和保护糖尿病血管病变的药对提取物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种药对提取物，该提取物由生地和山茱萸按重量比2：1提取制得，其制备方法为：（1）称取生地和山茱萸，按重量比2:1混匀，用药材量的8~12倍量蒸馏水提取2~3次，每次1~2小时；（2）将上述药对水提液用纱布过滤，滤液离心，合并上清液，用旋转蒸发浓缩、水浴蒸干、减压干燥至恒重，制得药对提取物浸膏。该浸膏得率为71.9%，浸膏中总环烯醚萜苷含量为12.48%。经药理试验结果表明该提取物有降糖作用，具有保护血管，改善血管内外因子水平，在保护肾脏、心脏方面作用独特。因此本发明提供的药对提取物可作为制备降糖及保护糖尿病血管病变的药物。

Description

一种降糖和保护糖尿病血管病变的药对提取物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物，特别是涉及用于降糖及保护糖尿病血管病变的提取物和制备方法及其应用。

背景技术

糖尿病在中医学上属于“消渴证”范畴。糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症，其大血管病变性质为动脉粥样硬化，主要累及主动脉、冠状动脉等大血管，而糖尿病的微血管病变是糖尿病特有的慢性血管并发症，主要表现为视网膜、肾等微血管病变。据统计我国糖尿病患者大概有4100万人。临床统计表明，40％-50％的糖尿病患者在发病10年后发生视网膜病变；约有2％的患者在发病15年后完全失明；5％～10％的患者在发病20年后恶化成终末期肾病。糖尿病血管病变是由高血糖引起的多种代谢途径发生异常，使血管细胞的结构和功能发生改变的缘故。但有研究显示单独控制血糖水平并不能完全阻止糖尿病血管病变的发生和发展。所以，既控制血糖又保护血管细胞是预防和治疗糖尿病血管病变的两个重要环节。目前糖尿病血管病变的发病机制虽然尚未完全阐明，但现有的假说主要与氧化应激增强、多元醇通路活跃、蛋白质非酶糖基化等有关。目前用于治疗糖尿病的化学药物如蛋白质非酶糖基化抑制剂(NEDI)、醛糖还原酶抑制剂(ARI)副作用较大，且该类药物仍处于实验阶段，尚未进入临床。ACEI由于其单靶点的作用机制，在治愈糖尿病上具有局限性，且毒副作用也较大。因此从目前的治疗现状来看，西医对糖尿病肾病的防治仍处于探索阶段，尚未发现具有特效的控制药物。中医药治疗糖尿病及其并发症方面有着悠久的历史，毒副作用小且方药加减灵活颇具优势使中医药在治疗糖尿病上发挥了化学药物难以替代的作用。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种药对提取物和提取方式，本发明还有一个目的是提供一种药对提取物在制备降糖及保护糖尿病血管病变药物中的应用。技术方案：

一种药对的提取物，其特征在于该提取物由生地和山茱萸按重量比2∶1提取制得。

一种药对提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取生地和山茱萸，按重量比2∶1混匀，用药材量的8～12倍量蒸馏水提取2～3次，每次1～2小时；

(2)将上述药对水提液用纱布过滤，滤液离心，合并上清液，用旋转蒸发浓缩、水浴蒸干、减压干燥至恒重，制得药对提取物浸膏。

步骤(2)中离心采用的是3000～4000rpm离心，50～60℃旋转蒸发浓缩、80～90℃水浴蒸干、50～60℃减压干燥。

步骤(2)所得药对提取物浸膏得率为71.9％。

步骤(2)所得药对提取物浸膏中总环烯醚萜苷含量为12.48％。

所述的药对提取物在制备降糖及保护糖尿病血管病变药物中的应用。

本发明生地和山茱萸药材分别为玄参科多年生草本植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥的块根和山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.etZucc.的干燥成熟果肉。

生地具有清热凉血、养阴生津功效，用于阴虚骨蒸、内热消渴等，为治疗糖尿病的“四大圣药”之一，并能保护肾脏，是临床上治疗糖尿病肾病的常用中药。现代药理研究表明生地中梓醇和地黄寡糖具有降血糖、降血脂、改善血脂等作用。山茱萸具有补益肝肾、涩精固脱之功效，主治眩晕耳鸣、腰膝酸痛、内热消渴等。在用于治疗消渴病的方剂中，六味地黄丸、金匮肾气丸、合沉汤、引龙汤、左归丸等均含有山茱萸。现代化学研究表明山茱萸药效成分主要有环烯醚萜苷、三萜酸和多糖。山茱萸乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位、乙醇提取液具有降低血糖和升高胰岛素的水平。山茱萸醇提物、山茱萸环烯醚萜苷具有抗血小板聚集和抗血栓作用。临床实践中，北京中医药大学赵进喜教授针对糖尿病肾病皆有肾虚、精微不固病机，经常选用二药，补肾固肾，对于肾虚精微不固所致的腰膝酸痛，尿频量多，眩晕耳鸣，自汗盗汗，阳萎遗精等症收效显著。临床使用药对经常采用水煎煮法，本发明采用此法制备药对提取物，结合整体实验充分阐明此药对保护糖尿病血管病变的作用机理。

本发明药对提取物中总环烯醚萜苷的检测方法为紫外-可见光分光光度法，具体如下：

1.该药对提取物中梓醇结构环烯醚萜苷含量检测：

精密量取梓醇对照品溶液和70％乙醇各1mL于10mL具塞试管中，加入1mol/L的HCl溶液2mL，摇匀，90℃水浴反应15min，放冷。加二硝基苯肼乙醇试液0.5mL，摇匀，90℃水浴反应25min，放冷，加1mol/L NaOH 70％乙醇溶液3mL，摇匀，室温下放置1h，显色，在200～800nm范围内进行扫描，结果如图1所示，对照品在470～473nm处都有最大吸收，即在470nm处测定供试样品吸光度。

分别精密吸取梓醇对照溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL入10mL容量瓶中，加70％乙醇至刻度，按“2.1.3”项下显色条件显色，以70％乙醇反应液为空白，在470nm处测定吸光度，吸光度值分别为0.1047、0.1620、0.208、0.260、0.298。吸光度(A)为纵坐标、浓度(c，μg/ml)为横坐标绘制标准曲线，结果如图2所示，梓醇在0.56～2.8μg/mL范围内线性关系良好，得回归方程y＝0.0865x+0.0612，R²＝0.9959。

精密称取药对提取物，显色后，测定吸光度，根据标准曲线计算梓醇结构环烯醚萜含量。经检测样品中梓醇结构环烯醚萜含量为9.08％。

2.该药对提取物中马钱苷结构环烯醚萜苷含量检测：

取马钱苷对照品溶液各1mL，在200～800nm范围内进行扫描，结果如图3所示。马钱苷最大吸收波长为239nm，即在239nm下测定供试品吸光度。

精密吸取马钱苷对照溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL入10mL容量瓶中，加70％乙醇至刻度。以70％乙醇为空白，在239nm处测定吸光度，吸光度值分别为0.302、0.619、11517、1.731、2.234、2.644。吸光度(A)为纵坐标、浓度(c，mg/mL)为横坐标绘制标准曲线，结果如图4所示，马钱苷在0.01～0.10mg/mL范围内线性关系良好，得回归方程y＝26.284x+0.089，R²＝0.9967。

精密称取药对水提物，测定吸光度，根据标准曲线计算马钱苷结构环烯醚萜含量。结果为3.40％。

3.该药对提取物中总环烯醚萜苷含量按以上两者总和计算结果为：12.48％。

本发明提供的药对提取物经高脂饲料复合小剂量STZ致大鼠糖尿病模型的研究表明，该提取物可改善糖尿病大鼠“三多一少”症状，降糖作用明显，保护胰岛细胞效果良好，在保护肾脏和改善血管因子方面作用较好。因此本发明提供的新提取物可以作为制备降糖及治疗糖尿病血管病变的药物。

本发明的有益效果：本发明提供的提取物及其制备方法和现有技术中相比具有如下优点：药对中两药配比符合中医药理论，是临床多年用于治疗糖尿病肾病的经验之方；该药对提取物提取工艺与临床服用中药方式方法相同，安全经济，提取物中有效成分含量高；经高脂饲料复合小剂量STZ致大鼠糖尿病模型的研究表明，该药对提取物有降糖作用，作用机制可能是保护胰岛细胞，刺激胰岛素分泌；同一模型可证实该药对提取物具有保护血管，改善血管内外因子水平，在保护肾脏、心脏方面作用独特。因此本发明提供的新提取物可以作为制备降糖及保护糖尿病血管病变的药物。

附图说明：

图1梓醇的紫外吸收光谱图

图2梓醇的标准曲线图

图3马钱苷的紫外吸收光谱图

图4马钱苷的标准曲线图

图5糖尿病大鼠肾脏病理组织学检查

A正常组HE×200

B模型组HE×200

C氨基胍组HE×200

D格列美脲组HE×200

E药对水提低剂量组HE×200

F药对水提高剂量组HE×200

图6糖尿病大鼠心脏病理组织学检查

A-1正常组(横)HE×200

A-2正常组(纵)HE×200

B模型组(横)HE×200

C氨基胍组(纵)HE×200

D格列美脲组(横)HE×200

E药对水提低剂量组(横)HE×200

F药对水提高剂量组(横)HE×200

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1药对提取物的提取工艺步骤：

称取200g生地和100g山茱萸药材，用8倍量蒸馏水煎煮提取2次，每次1小时；将上述药对水提液用纱布过滤，滤液按3000rpm离心，合并上清液，60℃旋转蒸发浓缩、80℃水浴蒸干、60℃减压干燥至恒重，制得药对水提物213g。

实施例2药对提取物的提取工艺步骤：

称取300g生地和150g山茱萸药材，用10倍量蒸馏水煎煮提取3次，每次1.5小时；将上述药对水提液用纱布过滤，滤液按3500rpm离心，合并上清液，55℃旋转蒸发浓缩、85℃水浴蒸干、55℃减压干燥至恒重，制得药对水提物324g。

实施例3药对提取物的提取工艺步骤：

称取500g生地和250g山茱萸药材，用12倍量蒸馏水煎煮提取3次，每次2小时；将上述药对水提液用纱布过滤，滤液按4000rpm离心，合并上清液，50℃旋转蒸发浓缩、90℃水浴蒸干、50℃减压干燥至恒重，制得药对水提物542g。

实施例4药对提取物对糖尿病大鼠降糖作用的实验研究：

取180g～200g雄性Wistar大鼠，高脂饲料喂养12周，一次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，筛选血糖值在7～20之间的大鼠作为糖尿病大鼠模型。灌胃给药12周，给药0周、6周与12周，分别用血糖仪测量大鼠空腹血糖值。12周末，禁食(不禁水)12小时，取血制备得血清。放射免疫法测量血清中胰岛素含量，计算胰岛素敏感性指数。实验结果见表1-2所示。

表1药对提取物对糖尿病大鼠空腹血糖的影响

##p＜0.01，与正常组比较；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组比较

表2药对提取物对糖尿病大鼠胰岛素与胰岛素敏感型指数的影响

#p＜0.05，##p＜0.01，与正常组比较；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组比较

实施例5药对提取物对糖尿病大鼠NO、ET及两者比值的影响：

取180g～200g雄性Wistar大鼠，高脂饲料喂养12周，一次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，筛选血糖值在7～20之间的大鼠作为糖尿病大鼠模型。灌胃给药12周。12周末，戊巴比妥钠麻醉后取血，制备血浆和血清。硝酸还原酶法测定血清中NO，放射免疫测定血浆中ET含量，计算两者比值。实验结果如表3所示。

表3药对提取物对糖尿病大鼠NO、ET及NO/ET的影响

#p＜0.05，与正常组比较；*p＜0.05，与模型组比较

实施例6药对提取物对糖尿病大鼠肾指标的影响：

取180g～200g雄性Wistar大鼠，高脂饲料喂养12周，一次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，筛选血糖值在7～20之间的大鼠作为糖尿病大鼠模型。灌胃给药12周。12周时，取大鼠24小时尿液，ELISA法检测尿中尿微量白蛋白(mALB)，放射免疫法检测β2微球蛋白(β2-MG)，按试剂盒说明书用比色法检测尿肌酐(UCr)与尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)。12周末，取血制备血清，试剂盒检测血清中尿素氮(BUN)。实验结果见表4、5。

表4药对提取物对糖尿病大鼠UCr及血清BUN的影响

##p＜0.01，与正常组比较；*p＜0.05，与模型组比较

表5药对提取物对糖尿病大鼠尿中NAG、β2-MG和mALB的影响

##p＜0.01，与正常组比较；*p＜0.05，与模型组比较

实施例7药对提取物对糖尿病大鼠肾脏和心脏组织形态学的影响：

取180g～200g雄性Wistar大鼠，高脂饲料喂养12周，一次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，筛选血糖值在7～20之间的大鼠作为糖尿病大鼠模型。灌胃给药12周。12周时，处死大鼠，迅速取出大鼠肾脏和心脏，称重，计算脏器系数。HE染色后，光学显微镜观察脏器的主要病变。实验结果如见表6、7。

脏器系数(mg/g)＝脏器重量(mg)/大鼠体重(g)

表6药对提取物对糖尿病大鼠肾脏和心脏系数的影响

##p＜0.01，与正常组比较；*p＜0.05，与模型组比较

表7药对提取物对糖尿病大鼠肾脏和心脏组织形态学的影响

##p＜0.01与正常组比较；**p＜0.01与模型组比较

该药对提取物经高脂饲料复合小剂量STZ致大鼠糖尿病模型的研究表明，该药对提取物有降糖作用，作用机制可能是保护胰岛细胞，刺激胰岛素分泌，并无改善胰岛素抵抗之功效；同一模型可证该药对提取物具有保护血管，改善血管内外因子水平，恢复NO/ET和TXB2/6-keto-PGF1α两者的动态平衡，保护肾脏、心脏等主要病变器官。因此本发明提供的新提取物可以作为制备降糖及治疗糖尿病血管病变的药物。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种药对的提取物，其特征在于该提取物由生地和山茱萸按重量比2：1提取制得。

2.一种药对提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取生地和山茱萸，按重量比2:1混匀，用药材量的8~12倍量蒸馏水提取2~3次，每次1~2小时；

（2）将上述药对水提液用纱布过滤，滤液离心，合并上清液，用旋转蒸发浓缩、水浴蒸干、减压干燥至恒重，制得药对提取物浸膏。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤（2）中离心采用的是3000~4000rpm离心，50~60℃旋转蒸发浓缩、80~90℃水浴蒸干、50~60℃减压干燥。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤（2）所得药对提取物浸膏得率为71.9%。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于步骤（2）所得药对提取物浸膏中总环烯醚萜苷含量为12.48%。

6.如权利要求1所述的药对提取物在制备降糖及保护糖尿病血管病变药物中的应用。

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