CN102191305B - 一种蹄甲多肽的复合水解制备方法 - Google Patents
一种蹄甲多肽的复合水解制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102191305B CN102191305B CN 201110084644 CN201110084644A CN102191305B CN 102191305 B CN102191305 B CN 102191305B CN 201110084644 CN201110084644 CN 201110084644 CN 201110084644 A CN201110084644 A CN 201110084644A CN 102191305 B CN102191305 B CN 102191305B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- raw material
- hoof nail
- solution
- enzymolysis
- hydrolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 48
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 title claims abstract description 45
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 29
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 21
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 16
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 claims description 4
- 239000002893 slag Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 abstract description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 abstract 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 abstract 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 description 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 3
- 229940096978 oral tablet Drugs 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 206010013908 Dysfunctional uterine bleeding Diseases 0.000 description 1
- 208000019255 Menstrual disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001741 anti-phlogistic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明为一种蹄甲多肽的复合水解制备方法，是将经过干燥和粉碎后的蹄甲原料，在碱溶液中进行温和的部分水解；然后使用蛋白水解酶进一步水解；制得蹄甲多肽产品。本发明所制得的蹄甲多肽产品中，相对分子质量10000-3500的组分含量达50％；氨基氮含量不超过总氮含量的3％。与现有技术相比较其凝血、抗炎效果具有明显的提高。
Description
技术领域：
本发明属多肽类生物药物制备方法，特别涉及一种以猪蹄甲为原料，通过水解制备蹄甲多肽的方法。
背景技术：
蹄甲多肽是从猪蹄甲中经水解获取的具有生物活性的多肽组分，具有显著的止血、抗炎、调整内分泌、提高机体免疫等功能，对功能性子宫出血症、月经不调等妇科疾病，具有独特的治疗作用，而且未出现任何毒副作用，临床上已广泛应用。目前，生产蹄甲多肽的方法主要是酸水解法或碱水解法，碱水解法的报道占多数。
最近的相关报道为2010年5月19日中国专利CN 101709076A公开的“一种蹄甲多肽的制备方法”。该方法是一种改进的碱水解生产蹄甲多肽的方法，主要步骤是在pH为8-12、温度为90-100℃的NaOH水溶液中，对猪蹄甲进行水解，以期提高蹄甲多肽的收率和纯度。
但是，该方法与传统的酸或碱水解法相同，在单纯追求提高蹄甲水解率的同时，忽略了对药物组分和活性的综合考察，尽管水解率有一定的提高，但并没有带来药物效果的提高，相反，由于其产品中氨基氮占总氮含量高达4％以上，意味着过多的多肽分子被过度水解为对治疗效果没有多大贡献的氨基酸，反而对实际疗效不利。
因此，改进和筛选优化猪蹄甲的水解工艺，使其在将大分子蛋白质水解为多肽的同时，能够有效控制多肽组分的过度水解，是当前蹄甲多肽生产过程中急需解决的技术难题。
发明内容：
为了克服现有蹄甲多肽生产技术中存在的不足，本发明提供了一种采用碱液和蛋白水解酶双重复合水解法生产蹄甲多肽的方法。
为了合理筛选工艺路线和工艺条件，本发明人参照前人对蹄甲多肽的药理研究，结合本发明人实际临床应用试验结果，进行综合分析对比后确认，蹄甲多肽成分中，具有药效功能的成分为多肽，特别是相对分子质量范围为10000～3500的多肽组分的实际临床应用试验效果最好，应尽力提高该相对分子质量范围内的多肽组分，同时，摒弃相对分子质量高于30000的组分，并控制其过度水解为相对分子质量低于3500的组分，以最大限度的提高产品药物的凝血、抗炎作用，降低其兴奋子宫的负面功能。
为了实现上述发明目的，本发明所提供的技术方案如下：
将经过干燥和粉碎后的蹄甲原料，先在碱溶液中进行温和的部分水解；然后使用蛋白水解酶进一步水解，并控制氨基氮含量不超过总氮含量的3％。
本发明所述方法的具体操作步骤和条件如下：
1.将原料蹄甲进行洗涤、热解、干燥和粉碎，制得原料粉末；
2.将原料粉末置于重量为原料干粉的20～22倍、pH为8.4～8.6的NaOH溶液中，在温度为84～86℃下，均匀搅拌，碱解11-12小时；
3.将水解混合液过滤滤出粗渣后，再将滤液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行超滤，两次滤出的滤渣返回NaOH溶液中再进行碱解；所得滤液进行酶解；
4.向超滤所得的滤液中，添加重量为原料干粉0.15～0.2％的木瓜蛋白酶(酶活1000μ/mg)和重量为原料干粉0.15～0.2％的枯草杆菌蛋白酶(酶活30万μ/g)，调整溶液pH为6.5～7，在温度为54～56℃下，酶解3.5～4小时，酶解终止时间以酶解液中氨基氮含量不超过总氮含量的3％为准；
5.将所得酶解液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行过滤，滤除酶等大分子杂质，所得滤液即为蹄甲多肽产品；经浓缩、干燥、粉碎，用于制备蹄甲多肽口服片剂；或将所得滤液经浓缩、醇提取、再浓缩后，用于制备注射水针剂或冻干粉针剂。
采用上述复合水解方法中制得的蹄甲多肽的收率为28％左右，产品中总氮含量为16.5-16.8％，与现有技术基本相近，但产品中氨基氮占总氮量的比例，仅为2.9-3.0％，远低于现有技术的4.2-4.3％，说明多肽的过度水解问题得到了有效地控制，有效多肽成分相对提高，相应的临床应用效果也相应提高。
采用高效液相色谱与质谱联用对本发明及现有技术(CN 101709076)所制得的蹄甲多肽分别进行分离、检测，所得的统计对比数据如下：
由上述分离检测结果可以看出，本发明所制得的蹄甲多肽中具有明显凝血、抗炎效果的多肽含量高于现有技术水平，特别是具有明显药效的相对分子质量10000-3500的组分含量高于现有技术50％，而过度水解所生成的氨基氮含量则低于现有技术的30％。本发明所述方法达到了预期的发明目的。
具体实施方式：
实施例1.
1)将原料蹄甲进行洗涤、热解、干燥和粉碎，制得原料粉末；
2)将原料粉末置于重量为原料干粉的20倍、pH为8.6的NaOH溶液中，在温度为86℃下，均匀搅拌，碱解11小时；
3)将水解混合液过滤滤出粗渣后，再将滤液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行超滤，所得滤液进行酶解；两次滤出的滤渣返回NaOH溶液中再进行碱解；
4)向超滤所得的滤液中，添加重量为原料干粉0.15％的木瓜蛋白酶(酶活1000μ/mg)和重量为原料干粉0.2％的沙雷肽酶(酶活30万μ/g)，调整溶液pH为7，在温度为54℃下，酶解4小时，酶解终止后，酶解液中氨基氮含量为总氮含量的2.9％；
5)将所得酶解液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行过滤，滤除酶等大分子杂质，所得滤液即为蹄甲多肽产品；经浓缩、醇提取、再浓缩后，用于制备注射液；或干燥、粉碎后，制备口服片剂。
采用上述复合水解方法中制得的蹄甲多肽的收率为28％，产品中总氮含量为16.8％，与现有技术基本相近，但产品中氨基氮占总氮量的比例，仅为2.9％，远低于现有技术的4.3％；，
采用高效液相色谱与质谱联用对本实施例所制得的蹄甲多肽分别进行分离、检测，其中相对分子质量为10000-3500的多肽组分含量为50％。
使用本实施例所制得的蹄甲多肽注射液与采用现有技术CN 101709076制得的蹄甲多肽所制成的同等剂量的注射液，分别给试验家兔注射用药三天，然后进行体外凝血试验对比，注射本发明蹄甲多肽的家兔的体外凝血时间，比现有技术缩短了30％。
实施例2.
1)将原料蹄甲进行洗涤、热解、干燥和粉碎，制得原料粉末；
2)将原料粉末置于重量为原料干粉的22倍、pH为8.4的NaOH溶液中，在温度为84℃下，均匀搅拌，碱解12小时；
3)将水解混合液过滤滤出粗渣后，再将滤液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行超滤，所得滤液进行酶解；两次滤出的滤渣返回NaOH溶液中再进行碱解；
4)向超滤所得的滤液中，添加重量为原料干粉0.2％的木瓜蛋白酶(酶活1000μ/mg)和重量为原料干粉0.15％的沙雷肽酶(酶活30万μ/g)，调整溶液pH为6.5，在温度为56℃下，酶解3.5小时，酶解终止后，酶解液中氨基氮含量不超过总氮含量的3.0％；
5)将所得酶解液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行过滤，滤除酶等大分子杂质，所得滤液即为蹄甲多肽产品；经浓缩、醇提取、再浓缩后，用于制备注射液；或干燥、粉碎后，制备口服片剂。
采用上述复合水解方法中制得的蹄甲多肽的收率为29％，产品中总氮含量为16.5％，与现有技术基本相近，但产品中氨基氮占总氮量的比例，仅为2.8％，远低于现有技术的4.3％，
采用高效液相色谱与质谱联用对本实施例所制得的蹄甲多肽分别进行分离、检测，其中相对分子质量为10000-3500的多肽组分含量为51％，
使用本实施例所制得的蹄甲多肽注射液与采用现有技术CN 101709076制得的蹄甲多肽所制成的同等剂量的注射液，分别给血小板减少的试验用小鼠注射用药七天，然后分别进行血小板数量检测，注射本发明蹄甲多肽的小鼠的血小板数量，与使用现有技术的小鼠的血小板数量均有增加，但使用本发明蹄甲多肽的小鼠的血小板所增加的数量比现有技术高出了50％。
Claims (1)
1.一种蹄甲多肽的复合水解制备方法，其特征在于采用先在碱溶液中进行水解，然后使用蛋白水解酶进一步水解的双重复合水解方法，并控制氨基氮含量不超过总氮含量的3％；
具体操作步骤和条件如下：
1)将原料蹄甲进行洗涤、热解、干燥和粉碎，制得原料粉末；
2)将原料粉末置于重量为原料干粉的20～22倍、pH为8.4～8.6的NaOH溶液中，在温度为84～86℃下，均匀搅拌，碱解11-12小时；
3)将水解混合液过滤滤出粗渣后，再将滤液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行超滤，两次滤出的滤渣返回NaOH溶液中再进行碱解；所得滤液进行酶解；
4)向超滤所得的滤液中，添加重量为原料干粉0.15～0.2％的木瓜蛋白酶，酶活1000u/mg，以及重量为原料干粉0.15～0.2％的枯草杆菌蛋白酶或沙雷肽酶，酶活300000u/g，调整溶液pH为6.5～7，在温度为54～56℃下，酶解3.5～4小时，酶解终止时间以酶解液中氨基氮含量不超过总氮含量的3％为准；
5)将所得酶解液用分子量不大于30000道尔顿的超滤膜进行过滤，所得滤液即为蹄甲多肽液体产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110084644 CN102191305B (zh) | 2011-04-06 | 2011-04-06 | 一种蹄甲多肽的复合水解制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201110084644 CN102191305B (zh) | 2011-04-06 | 2011-04-06 | 一种蹄甲多肽的复合水解制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102191305A CN102191305A (zh) | 2011-09-21 |
| CN102191305B true CN102191305B (zh) | 2013-10-30 |
Family
ID=44600172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201110084644 Expired - Fee Related CN102191305B (zh) | 2011-04-06 | 2011-04-06 | 一种蹄甲多肽的复合水解制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102191305B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102081709B (zh) * | 2009-12-01 | 2017-05-24 | 联想(北京)有限公司 | 一种浏览器插件的禁用方法、装置和终端 |
| EP2832237A1 (en) * | 2013-07-30 | 2015-02-04 | Tessenderlo Chemie NV | Method for producing hydrolysed keratinaceous material |
| CN104531813B (zh) * | 2014-11-23 | 2018-05-11 | 内蒙古天奇生物科技有限公司 | 一种山羊角活性多肽的制备方法 |
| CN105949275A (zh) * | 2016-06-21 | 2016-09-21 | 赤峰学院 | 一种简便提取动物蹄甲多肽的方法 |
| CN108504711B (zh) * | 2018-04-08 | 2021-09-10 | 山东鲁北药业有限公司 | 蹄甲多肽的制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT177077B (de) * | 1951-02-07 | 1953-12-28 | Bayerische Motoren Werke Ag | Gabelfuß für Teleskopgabel von Krafträdern |
| AT352511B (de) * | 1977-03-15 | 1979-09-25 | Gonzalez Sicilia Moreno Enriqu | Verfahren zur gewinnung hochwertiger und leichtverdaulicher proteine aus tierhorn, t erhufen, tiernaegeln, tierhaaren, federn und/oder tierblut |
| CN100391474C (zh) * | 2006-06-13 | 2008-06-04 | 卢建军 | 用于治疗血小板减少的注射用药物 |
| CN101709076A (zh) * | 2009-11-27 | 2010-05-19 | 山东鲁北药业有限公司 | 一种蹄甲多肽的制备方法 |
| CN101979656B (zh) * | 2010-11-11 | 2012-06-06 | 武汉远城科技发展有限公司 | 一种蹄甲肽的提取方法 |
-
2011
- 2011-04-06 CN CN 201110084644 patent/CN102191305B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102191305A (zh) | 2011-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102191305B (zh) | 一种蹄甲多肽的复合水解制备方法 | |
| CN108341887B (zh) | 一种霍山石斛多糖的制备方法 | |
| CN101736065B (zh) | 一种利用啤酒麦糟制备多肽的方法 | |
| US10052368B2 (en) | Pegylated tissue kallikrein, and preparation method therefor and uses thereof | |
| WO2009140833A1 (zh) | 霞水母来源有免疫增强活性的胶原蛋白肽及制备和应用 | |
| CN104004806A (zh) | 一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用 | |
| CN103087152B (zh) | 一种缩宫素溶液的提取工艺 | |
| CN105087724A (zh) | 酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法 | |
| CN101584853B (zh) | 一种地龙蛋白多肽制剂 | |
| CN101041692A (zh) | 蝎镇痛抗菌活性肽及其制备方法 | |
| CN102925421B (zh) | 一种蚓激酶的制备方法 | |
| CN110734472B (zh) | 一种具有二肽基肽酶-4抑制活性的寡肽及其应用 | |
| CN110734475B (zh) | 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的寡肽及其应用 | |
| CN101126105A (zh) | 一种用大米分离蛋白制备降血压肽的方法 | |
| CN103060297A (zh) | 一种分离纯化胰蛋白酶的方法 | |
| CN112342260A (zh) | 一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法及其产品 | |
| CN107494886A (zh) | 一种利用鱼溶浆生产的蛋白粉产品 | |
| CN101798587B (zh) | 玉米降血压肽的分离纯化方法 | |
| CN108079022A (zh) | 一种水蛭提取物及其制备方法与应用 | |
| CN109628523A (zh) | 枸杞多糖提取分离和纯化方法、枸杞糖肽及降血糖药物 | |
| CN111920059B (zh) | 一种大豆ace抑制肽及其制备方法和应用 | |
| CN100390199C (zh) | 从鲜鹿茸中提取胰岛素样生长因子-1的方法 | |
| CN112048417A (zh) | 一种活性小分子阿胶膏及其制备方法 | |
| CN110734471B (zh) | 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的七肽及其应用 | |
| CN101307105B (zh) | 一种能串联表达和同步酸水解释放的人甲状旁腺素1-34肽类似物及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131030 |