发明内容
本发明克服现有技术的不足,第一目的在于提供一种具有抗菌药理活性的三七提取物,第二目的在于提供一种制备该三七提取物的方法,第三目的在于提供该三七提取物在药物制备上的应用,第四目的在于提供该三七提取物的药用制剂。
本发明的第一目的是这样实现的:具有抗菌药理活性的三七提取物,富含脂溶性成份,包含(重量比)22,23-二氢豆甾醇3~6%、豆甾醇2~4%、大香叶烯D0.5~1.0%、匙叶桉油烯醇3~5%、喇叭烯和双环大香叶烯1.0~2.5%。
所述的三七提取物还含有(重量比)挥发性蓝桉醇1~3%、δ-杜松醇0.2~1.0%、喇叭茶醇0.2~1.0%、绿花醇1~3%、异匙叶桉油烯醇0.5~1.5%、Tau-杜松醇0.5~1.5%、α-古芸烯2%~4%。
所述的三七提取物还含有(重量比)十六烷酸甲酯0.05~0.2%、十六烷酸0.1~0.5%、十六烷酸甘油酯1.0~2.5%、十六烷酸乙酯0.5~1.0%、十八碳二烯酸甲酯0.1~0.3%、十八碳二烯酸和十八碳烯酸1.0~2.5%、十八碳二烯酸乙酯和十八碳烯酸乙酯0.1~0.5%、十八碳二烯酸甘油酯和3-甲氧基-5-甲基-2-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯基)苯酚1.5~3.5%、4-甲氧基-6-戊基-5,6-二氢-2-吡喃酮0.1~0.5%。
本发明第二个目的是这样实现的:所述三七提取物的制备方法包括下列步骤,
A、将三七干燥根洗净干燥,然后粉碎成830-380μm的粗粉;
B、将粗粉加5~10倍重量的70%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,合并醇提液后回收乙醇,所得浓缩液经大孔吸附树脂柱吸附静置1~3小时后,用水对大孔吸附树脂柱洗脱,至流出水不出现紫环反应,然后用80%乙醇继续洗脱,得到三七总皂苷醇提液,浓缩后得到常规三七提取物。
C、用85%~95%高浓度乙醇再次对B步骤洗脱过的大孔吸附树脂洗脱2小时,收集洗脱液并回收乙醇后得到土黄色粘稠状液体,即为本发明所述的三七提取物。
上述制备方法中,所述的高浓度乙醇浓度为90%;所述的大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂、AB-8型大孔吸附树脂、LX68型大孔吸附树脂或DM130型大孔吸附树脂。
本发明第三个目的是这样实现的:本发明所述的具有抗菌药理活性三七提取物在制备抗乙型链球菌和/或绿脓杆菌和/或金黄色葡萄球菌药物上的应用。
本发明的第四目的是这样实现的:
以含有所述的具有抗菌药理活性三七提取物的药用制剂,含有治疗有效量的所述三七提取物和医药上可接受的辅料,制成任意适用的剂型。
以本发明所述制备方法制取的具有抗菌药理活性三七提取物的药用制剂,含有治疗有效量的所述三七提取物和医药上可接受的辅料,制成任意适用的剂型。
本发明三七提取物中含有植物甾醇类的豆甾醇和22,23-二氢豆甾醇,植物萜类的大香叶烯和双环大香叶烯,挥发性醇类的匙叶桉油烯醇、蓝桉醇、绿花醇、δ-杜松醇、异匙叶桉油烯醇和Tau-杜松醇,在组合作用下,使得该三七提取物具有更强的抗菌药理活性。尤其对乙型链球菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的繁殖抑制效果良好。本发明三七提取物可用于制备对抗上述病菌的各种剂型的药物。本发明三七提取物是从常规三七提取过程中丢弃的“废物”中经过优化方法,深度提纯后获得的,突破了传统的三七有效成分提取和利用的思维模式,变废为宝,大大提高了三七资源的利用率,同时为人类的健康提供一种安全的药物资源。
具体实施方式:
下面结合附图对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教导所作的任何变换,均落入本发明的保护范围。
实施例1
本发明所述的具有抗菌药理活性的三七提取物,富含脂溶性成份,其包含(重量比)22,23-二氢豆甾醇3.5%、豆甾醇2.2%、大香叶烯D0.56%、匙叶桉油烯醇3.21%、喇叭烯和双环大香叶烯1.21%、蓝桉醇1.3%、δ-杜松醇0.25%、喇叭茶醇0.23%、绿花醇1.25%、异匙叶桉油烯醇0.59%、Tau-杜松醇0.66%、α-古芸烯2.65%、十六烷酸甲酯0.07%、十六烷酸0.15%、十六烷酸甘油酯1.3%、十六烷酸乙酯0.53%、十八碳二烯酸甲酯0.12%、十八碳二烯酸和十八碳烯酸1.2%、十八碳二烯酸乙酯和十八碳烯酸乙酯0.18%、十八碳二烯酸甘油酯和3-甲氧基-5-甲基-2-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯基)苯酚1.8%、4-甲氧基-6-戊基-5,6-二氢-2-吡喃酮0.17%。
实施例2
本发明所述的具有抗菌药理活性的三七提取物,富含脂溶性成份,其包含(重量比)22,23-二氢豆甾醇5.47%、豆甾醇3.58%、大香叶烯D0.91%、匙叶桉油烯醇3.94%、喇叭烯和双环大香叶烯2.35%、蓝桉醇2.65%、δ-杜松醇0.83%、喇叭茶醇0.48%、绿花醇2.83%、异匙叶桉油烯醇1.35%、Tau-杜松醇1.21%、α-古芸烯2.75%、十六烷酸甲酯0.15%、十六烷酸0.41%、十六烷酸甘油酯2.12%、十六烷酸乙酯0.76%、十八碳二烯酸甲酯0.25%、十八碳二烯酸和十八碳烯酸2.32%、十八碳二烯酸乙酯和十八碳烯酸乙酯0.42%、十八碳二烯酸甘油酯和3-甲氧基-5-甲基-2-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯基)苯酚3.15%、4-甲氧基-6-戊基-5,6-二氢-2-吡喃酮0.44%。
实施例3
本发明所述的具有抗菌药理活性的三七提取物,富含脂溶性成份,其包含(重量比)22,23-二氢豆甾醇4.75%、豆甾醇2.50%、大香叶烯D0.82%、匙叶桉油烯醇3.67%、喇叭烯和双环大香叶烯2.08%、蓝桉醇1.58%、δ-杜松醇0.64%、喇叭茶醇0.43%、绿花醇1.89%、异匙叶桉油烯醇0.80%、Tau-杜松醇0.79%、α-古芸烯2.15%、十六烷酸甲酯0.13%、十六烷酸0.27%、十六烷酸甘油酯1.24%、十六烷酸乙酯0.72%、十八碳二烯酸甲酯0.19%、十八碳二烯酸和十八碳烯酸1.34%、十八碳二烯酸乙酯和十八碳烯酸乙酯0.30%、十八碳二烯酸甘油酯和3-甲氧基-5-甲基-2-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯基)苯酚2.51%、4-甲氧基-6-戊基-5,6-二氢-2-吡喃酮0.22%。
实施例4
本发明所述的具有抗菌药理活性的三七提取物,富含脂溶性成份,其包含(重量比)22,23-二氢豆甾醇4.15%、豆甾醇3.17%、大香叶烯D0.65%、匙叶桉油烯醇4.65%、喇叭烯和双环大香叶烯2.3%、蓝桉醇2.22%、δ-杜松醇0.45%、喇叭茶醇0.91%、绿花醇2.25%、异匙叶桉油烯醇1.05%、Tau-杜松醇1.36%、α-古芸烯2.45%、十六烷酸甲酯0.11%、十六烷酸0.48%、十六烷酸甘油酯2.35%、十六烷酸乙酯0.85%、十八碳二烯酸甲酯0.21%、十八碳二烯酸和十八碳烯酸2.36%、十八碳二烯酸乙酯和十八碳烯酸乙酯0.45%、十八碳二烯酸甘油酯和3-甲氧基-5-甲基-2-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯基)苯酚3.31%、4-甲氧基-6-戊基-5,6-二氢-2-吡喃酮0.38%。
实施例5
称取干燥10Kg三七粉碎成830μm的粗粉,将粗粉加5倍重量的70%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,合并醇提液后回收乙醇,所得浓缩液经、LX68型大孔吸附树脂柱吸附静置1小时后,用水对大孔吸附树脂柱洗脱,至流出水不出现紫环反应,然后用80%乙醇继续洗脱,得到三七总皂苷醇提液,浓缩后得到常规三七提取物。用85%高浓度乙醇再次洗脱大孔吸附树脂2小时,收集洗脱液并回收乙醇后得到土黄色粘稠状液体,为本发明所述的三七提取物0.28Kg。
实施例6
称取干燥10Kg三七粉碎成380μm的粗粉,将粗粉加10倍重量的70%乙醇回流提取2次,每次1.5小时,合并醇提液后回收乙醇,所得浓缩液经D101型大孔吸附树脂柱吸附静置2小时后,用水对AB-8型大孔吸附树脂柱洗脱,至流出水不出现紫环反应,然后用80%乙醇继续洗脱,得到三七总皂苷醇提液,浓缩后得到常规三七提取物。用95%高浓度乙醇再次洗脱大孔吸附树脂2小时,收集洗脱液并回收乙醇后得到土黄色粘稠状液体,为本发明所述的三七提取物0.298Kg。
实施例7
称取干燥10Kg三七粉碎成500μm的粗粉,将粗粉加6倍重量的70%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,合并醇提液后回收乙醇,所得浓缩液经DM130型大孔吸附树脂柱吸附静置3小时后,用水对大孔吸附树脂柱洗脱,至流出水不出现紫环反应,然后用80%乙醇继续洗脱,得到三七总皂苷醇提液,浓缩后得到常规三七提取物。用90%高浓度乙醇再次洗脱大孔吸附树脂2小时,收集洗脱液并回收乙醇后得到土黄色粘稠状液体,为本发明所述的三七提取物0.305Kg。
实施例8
称取干燥10Kg三七粉碎成600μm的粗粉,将粗粉加8倍重量的70%乙醇回流提取3次,每次1.5小时,合并醇提液后回收乙醇,所得浓缩液经D101型大孔吸附树脂柱吸附静置3小时后,用水对大孔吸附树脂柱洗脱,至流出水不出现紫环反应,然后用80%乙醇继续洗脱,得到三七总皂苷醇提液,浓缩后得到常规三七提取物。用90%高浓度乙醇再次洗脱大孔吸附树脂2小时,收集洗脱液并回收乙醇后得到土黄色粘稠状液体为本发明所述的三七提取物0.31Kg。
试验1:
对具有抗菌活性的三七提取物成份的分析鉴定
药物材料:采用85%乙醇提取的具有抗菌活性的三七提取物(由云南省云科药业有限公司提供)。
气相色谱条件:仪器为美国Agilent Technologies公司HP5890,HP-5石英毛细管柱(30mm×0.32mm×0.25μm);柱温80~280℃,程序升温5℃/min;柱流量为1.5ml/min;进样口温度250℃;氢火焰检测器温度250℃;进样量1.0μl;分流比50∶1;载气为高纯氮气。
气相色谱-质谱条件:HP6890GC/5973MS气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent Technologies公司生产)。
GC条件:HP-5MS石英毛细管柱(30mm×0.25mm×0.25μm);柱温100~260℃,程序升温5℃/min;柱流量为1.0ml/min;进样口温度250℃;柱前压100kPa;进样量0.30μl;分流比10∶1;载气为高纯氮气。
MS条件:电离方式EI;电子能量70;传输线温度250℃;离子源温度230℃;四级杆温度150℃;质量范围35~500;采用wiley7n.1标准谱库计算机检索定性。
试验结果:
用气相色谱法对用于抗菌的三七提取物进行鉴定,鉴定结果显示该提取物包含25种以上脂溶性成份(见表1),总含量约占全三七脂溶部分的28.38%(重量比),其主要成分为22,23-豆甾醇4.65%(重量比,下同)、豆甾醇2.49%、匙叶桉油烯醇3.26%、蓝桉醇1.50%、绿花醇1.75%,α-古芸烯2.67%、大香叶烯D0.78%。
表1具有抗菌活性的三七提取物(85%乙醇提取)成份鉴定结果及含量表
试验2:
对具有抗菌、抗癌活性的三七提取物成份的分析鉴定
药物材料采用95%乙醇提取的具有抗菌活性的三七提取物(由云南省云科药业有限公司提供),其他的试验条件同试验1。
试验结果:用气相色谱法对具有抗菌活性的三七提取物进行鉴定,结果显示该提取物包含25种以上脂溶性成份(见表2),总含量约占全三七脂溶部分的29.92%(重量比),其主要成分为22,23-豆甾醇4.75%(重量比,下同)、豆甾醇2.50%、匙叶桉油烯醇3.67%、蓝桉醇1.58%、绿花醇1.89%,α-古芸烯2.75%、大香叶烯D0.82%。
表2具有抗菌活性的三七提取物(95%乙醇提取)成份鉴定结果及含量表
试验3:
对具有抗菌活性的三七提取物成份的分析鉴定
药物材料采用90%乙醇提取的具有抗菌活性的三七提取物(由云南省云科药业有限公司提供),其他的试验条件同试验1。
试验结果:用气相色谱法对具有抗菌活性的三七提取物进行鉴定,鉴定结果(见图2)显示该提取物包含25种以上脂溶性成份(见表3),总含量约占全三七脂溶部分的37.18%(重量比),其主要成分为22,23-豆甾醇5.47%(重量比,下同)、豆甾醇3.58%、匙叶桉油烯醇3.94%、蓝桉醇2.65%、绿花醇2.83%,α-古芸烯2.89%、大香叶烯D0.91%。
表3具有抗菌活性的三七提取物(90%乙醇提取)成份鉴定结果及含量表
试验4
具有抗菌活性的三七提取物体外抗菌活性筛选试验
1.试验材料、试剂和仪器
药物材料:采用85%乙醇提取的具有抗菌活性的三七提取物(由云南省云科药业有限公司提供)。
供试菌种:金黄色葡萄球菌(CMCC26001)、绿脓杆菌(ATCC27853)、痢疾杆菌、乙型链球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌(CMCC44103)。以上供试菌种由昆明医学院基础微生物基础研究实验室提供。
实验仪器:AL204型立式电子分析天平、HS-80型数显水浴恒温振荡器(金坛市双捷实验仪器厂制造)、立式压力灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂制造)、DT1000型电子天平、移液枪(5ml、1000μl、10μl、100μl、200μl),隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂生产)、超净工作台(珠海市再鑫仪器有限公司生产)。
试剂:MH肉汤培养基、琼脂培养基、血琼脂培养基(杭州天和微生物试剂有限公司生产),生理盐水、二甲基亚砜(DMSO)(广州新港化工厂),吐温-80,小牛血清。
2.方法采用肉汤稀释法中的常量稀释法药敏试验方法。
①即10支管中先各加1ml的肉汤培养基;②在1号管加1ml的药物,与肉汤混匀后移取1ml至2号管,在2中混匀后再移1ml到3号管,依次类推到9号管,从9号管移去1ml到废液缸,10号不加药物;③除9号外其余都再加0.1ml的3×106CFU/ml的细菌,混匀后,37℃恒温培养18-24小时。之后用接种环取培养后的各试管的试液,涂于培养皿上,看是否长菌。
其中,金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌和大肠杆菌的实验试管1~8号的药物含量分别为62.5mg/ml、31.25mg/ml、15.625mg/ml、7.8125mg/ml、4.9mg/ml、2.45mg/ml、1.225mg/ml、0.6125mg/ml,9号为不加菌阴性对照,10号加菌阳性对照。绿脓杆菌和乙型链球菌的实验试管1~8号的药物含量分别为1.95mg/ml、0.98mg/ml、0.49mg/ml、0.24mg/ml、0.12mg/ml、61.04μg/ml、30.52μg/ml、15.26μg/ml。9号为不加菌阴性对照,10号加菌阳性对照。其中链球菌的营养肉汤经121℃15min灭菌后放到室温时,向其中加入5%的小牛血清配成;平板培养基经灭菌放到50℃后加入5%小牛血清,混匀后制作培养皿。
3.试验结果
如表2所示,本试验使用金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、乙型链球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌为测试菌株,采用氨苄西林作为阳性对照(A),空白作为阴性对照(B),表中数字为药液中最小抑菌浓度的药物含量(单位为mg/ml)。
结果显示,提取物体外试验对乙型链球菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌效果,对痢疾和伤寒杆菌的作用不是太明显,对大肠杆菌无作用。
表4具有抗菌活性的三七提取物(85%乙醇提取)体外抗菌活性对比表
受试菌种 |
氨苄青霉素(mg/ml) |
提取物(mg/ml) |
大肠杆菌 |
12.5 |
>125 |
金黄色葡萄球菌 |
<0.39 |
78.1 |
绿脓杆菌 |
0.021875 |
0.98 |
乙型链球菌 |
<0.39 |
0.24 |
痢疾杆菌 |
<0.39 |
31.25 |
伤寒杆菌 |
<0.39 |
31.25 |
试验5
具有抗菌活性的三七提取物体外抗菌活性筛选试验
药物材料是采用95%乙醇提取的具有抗菌活性的三七提取物(由云南省云科药业有限公司提供),其他试验条件与试验4均相同。
试验结果:如表5所示,本试验使用金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、乙型链球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌为测试菌株,采用氨苄西林作为阳性对照(A),空白作为阴性对照(B),表中数字为药液中最小抑菌浓度的药物含量(单位为mg/ml)。
结果显示,提取物体外试验对乙型链球菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌效果,对痢疾和伤寒杆菌的作用不是太明显,对大肠杆菌无作用。
表5具有抗菌活性的三七提取物(95%乙醇提取)体外抗菌活性对比表
受试菌种 |
氨苄青霉素(mg/ml) |
提取物(mg/ml) |
大肠杆菌 |
12.5 |
>125 |
金黄色葡萄球菌 |
<0.39 |
3.91 |
绿脓杆菌 |
0.021875 |
0.12 |
乙型链球菌 |
<0.39 |
0.12 |
痢疾杆菌 |
<0.39 |
31.25 |
伤寒杆菌 |
<0.39 |
31.25 |
试验6
具有抗菌活性的三七提取物体外抗菌活性筛选试验
药物材料是采用90%乙醇提取的具有抗菌、抗癌活性的三七提取物(由云南省云科药业有限公司提供),其他试验条件与试验4均相同。
试验结果:如表6所示,本试验使用金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、乙型链球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌为测试菌株,采用氨苄西林作为阳性对照(A),空白作为阴性对照(B),表中数字为药液中最小抑菌浓度的药物含量(单位为mg/ml)。
结果显示,提取物体外试验对乙型链球菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌效果,对痢疾和伤寒杆菌的作用不是太明显,对大肠杆菌无作用。
表6具有抗菌活性的三七提取物(90%乙醇提取)体外抗菌活性对比表
受试菌种 |
氨苄青霉素(mg/ml) |
提取物(mg/ml) |
大肠杆菌 |
12.5 |
>125 |
金黄色葡萄球菌 |
<0.39 |
3.91 |
绿脓杆菌 |
0.021875 |
0.49 |
乙型链球菌 |
<0.39 |
0.12 |
痢疾杆菌 |
<0.39 |
31.25 |
伤寒杆菌 |
<0.39 |
31.25 |