CN102174506B - 一种快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是公开一种快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，属于农副产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，特别涉及一种利用高压脉冲电场技术抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，是利用流动式高压脉冲电场装置，选用长度与半径均适宜的电极，控制高压脉冲电场装置中的电场强度和频率在其适宜范围内，将适宜浓度和适宜pH的啤酒酵母细胞悬浮液以定的恒流速度泵入高压脉冲电场电极处流处理后收集于成品罐中。本技术制备方法包括啤酒酵母细胞悬浮液的制备、悬浮液酸度的调配、高压脉冲电场参数的调控、悬浮液恒流泵料速度的调控工艺过程，优势体现于在60μs的时间内啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上，不仅为快速提取海藻糖生产工艺研究提供了技术支撑，也可为啤酒酵母泥变废为宝综合开发奠定一定基础。

Description

一种快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法

技术领域

本发明属于农副产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，涉及一种利用高压脉冲电场技术快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法。 

背景技术

海藻糖已被认定为21世纪生命之糖，目前其提取分离技术与其应用领域已被国内外学者认定为热点问题与焦点问题。海藻糖是一种由两个葡萄糖分子通过糖苷键连接的非还原性双糖。随着海藻糖在冻结、干燥、高渗透压等特殊环境下，能对生物膜、膜蛋白质、核酸类等发挥保护效果的这种特殊功能的发现和认识的增进，以及对海藻糖性质研究的深入，促使科技工作者争先进行对海藻糖生产技术的研究开发。海藻糖目前作为一种良好的生物保护剂已引起产业界人士的高度重视。同时海藻糖作为一种应急代谢物，能赋予动物、植物和微生物等抵抗营养缺乏、高温、低温、干燥、高渗透压、有毒物质等恶劣环境的能力，因而在食品、医药、化妆品等领域具有广阔的应用前景。 

啤酒酵母细胞因富含海藻糖而被认为是极具发展前景的重要海藻糖源。啤酒酵母细胞在一些极端环境(冷冻、干燥、热处理等)下，可以通过调节海藻糖的合成来抵御外界的不良伤害，积累大量的海藻糖，海藻糖含量被认为是酵母耐性的重要鉴定指标。 

啤酒酵母泥目前仍然是啤酒生产企业的污染物与废弃物，若能深入研究并从中开发海藻糖产品，将有利于解决啤酒生产企业的环境污染问题。啤酒废酵母是啤酒生产中的主要副产物，是指啤酒酿造后沉降在发酵罐底部的酵母泥，主要是仍具有活性的酵母细胞和酒花碎片及少量死细胞弱细胞组成。据估算，每生产100吨啤酒大约产生啤酒废酵母1.5～2.0吨(含水75％～80％)，折合干酵母(含水8％-10％)约为0.35～0.4吨，目前我国啤酒年产量已达到4000万吨，如此推算，全国啤酒行业一年可排放啤酒废酵母60～80万吨左右，约占啤酒厂总污染的1/3。目前，废酵母的主要去向是随废水排弃或用作饲料，仍以废弃物排放，不 但对生产企业环境造成严重污染，而且对营养价值相当丰富的啤酒废酵母资源的造成巨大浪费。因此如果能够合理利用这一资源进行广泛而深入地研究和开发海藻糖产品，既可减少环境污染，又可创造极其可观的经济效益，还可以为啤酒废酵母泥综合开发成高附加值产品提供一种可行的技术路线，对发展啤酒废酵母的资源化利用具有重要的意义。 

啤酒酵母细胞中海藻糖分解酶活性直接影响海藻糖提取率及其技术开发。啤酒酵母细胞中存在海藻糖分解酶，其活性高低是影响海藻糖在细胞中积累量的主要因素，也将直接影响到海藻糖的生产成本和提取率以及啤酒酵母泥增值效益。 

高压脉冲电场技术抑制啤酒酵母泥中酸性海藻糖分解酶技术，有利于啤酒酵母泥中海藻糖的提取技术的可行性、高效性、环保性。高压脉冲电场(High-Voltage Pulsed Electrc Field，简称PEF)技术是一项处于国际研究热点的非热加工高新技术。通过增加细胞膜通透性，减弱细胞膜强度，最终导致细胞膜破坏，膜内细胞物质外流，膜外物质渗入，具有耗能少、处理时间短、效率高、不易引起蛋白质和核糖核酸变性的优点。 

此外，相关研究发现，PEF技术对不同的生物酶有快速激活或抑制作用，本发明专利是再大量实验研究的基础上，优化获得高压脉冲电场快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性技术参数。 

言而总之，本发明专利要求保护的是一种以啤酒酵母细胞为原料，利用流动式高压脉冲电场装置，安装长度与半径均适宜的电极，控制高压脉冲电场装置中的电场强度和频率在其适宜范围内，将适宜浓度和适宜pH值的啤酒酵母细胞悬浮液以一定的恒流速度泵入高压脉冲电场电极处流处理后收集于成品罐中，实现了在60μs的时间内啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的技术突破，其优势主要体现在以下两个方面： 

第一，本专利技术是以高压脉冲电场技术为核心技术。PEF技术优势具体体现在：(1)PEF处理通常是选取室温、低于室温、或稍微高于室温等温度条件下进行操作，因此，对食品质量属性来说，PEF技术避免或很大程度上减少了食品感官和物理特性的有害变化；(2)PEF技术具有处理时间非常短(小于1s)，传递快速，适合工业化生产。(3)PEF技术具有处理均匀、安全等特点。特别强调的是，将高压脉冲电场技术应用于抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的研 究中，其技术优势突出体现在：(1)PEF法抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性，抑制率达到95％以上；(2)PEF法处理时间短，仅为60μs以内，并可以进行连续工业化生产；(3)高压脉冲电场能耗较低，更适合啤酒酵母细胞高附加值产品开发的绿色低碳主题。 

第二，本专利技术是以啤酒酵母细胞为原料，可以由啤酒酵母泥经除杂、脱苦处理(专利发明人已公开发表论文中具体优化获得最佳技术参数)制备啤酒酵母细胞，具有来源广泛，原料成本低廉，适于啤酒工业的副产物增值增效技术应用。 

本专利发明人公开发表论文《废弃啤酒酵母泥除杂、脱苦工艺条件的筛选与其RNA提取技术的优化》[J].食品科学，2008，29(10)：404-407.，公开了一种利用啤酒废酵母泥经除杂和脱苦处理后制备啤酒酵母细胞的工艺流程：啤酒废弃酵母泥→8％酵母悬液→过80目筛2次→加5％酒石酸，沉降30min→4℃，3600r/min，离心10min→弃上清液→啤酒废酵母细胞→冷藏备用。本专利技术能够为啤酒生产工业实现蛋壳资源的综合利用开辟了一个新途径。 

综上所述，纵观国内外相关研究与技术报道，未见利用利用高压脉冲电场技术快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，实现了在60μs的时间内啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的技术突破。 

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是：公开一种利用高压脉冲电场技术快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法。 

本发明的技术方案是： 

一种采用啤酒酵母细胞为原料，利用高压脉冲电场技术快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，包括啤酒酵母细胞悬浮液的制备、悬浮液酸度的调配、高压脉冲电场参数的调控、悬浮液恒流泵料速度的调控工艺过程。 

所述的啤酒酵母细胞悬浮液的制备过程，倘若以活的啤酒酵母细胞为原料，则是按照啤酒酵母细胞∶水＝1∶10～1∶100(g/mL)混合均匀即为啤酒酵母细胞悬浮液；倘若以啤酒酵母泥为原料，则是先将啤酒废弃酵母泥配制成8％混合液，过80目筛2次，再加5％酒石酸后自然沉降30min后，进行低温离心处理(4 ℃，3600r/min，10min)，弃上清液，获得啤酒废酵母细胞；而后再按照啤酒酵母细胞∶水＝1∶10～1∶100(g/mL)混合均匀即为啤酒酵母细胞悬浮液，即可进行酸度的调配处理。 

所述的酸度的调配过程，是将啤酒酵母细胞悬浮液即刻放置于在5～20℃温度环境下进行机械或者磁力搅拌，时间控制在1～5min范围内，并再搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至1.5～5.5后，即可进行高压脉冲电场参数的调控处理。 

所述的高压脉冲电场参数的调控过程，是选用长度为0.5～3.5mm、半径为0.5～0.8mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、酸性去离了水(利用0.1M盐酸溶液利0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至1.5～5.5)分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2～3次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为10～45kV/cm和频率为1000～3000Hz后，即可进行物料恒流泵调控处理。 

所述的恒流泵料速度的调控过程，是将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为10～45mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。 

本发明技术效果如下： 

(1)本发明是以啤酒酵母细胞或者啤酒酵母泥为原料，采用高压脉冲电场技术，仅经60μs的时间内即可获得酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液，能够为综合开发啤酒酵母泥资源开辟一条新的途径。 

(2)本发明设计的工艺路线简捷，设备投入少，工业化推广可行，是一种啤酒工业生产企业废弃物——啤酒酵母泥的综合利用和减少排污的有效方法。 

(3)在本发明的制备方法中，所获得的酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液，可以进行后续的海藻糖提取与分离，海藻糖得率提高至97.6％。 

总之，本发明是以啤酒酵母细胞为主要原料，经过高压脉冲电场处理后，实现了在60μs的时间内啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上，不仅为快速提取海藻糖生产工艺研究提供了技术支撑，也可为啤酒酵母泥变废为宝综合开发技术研发奠定一定基础。。 

具体实施方式

实施例1： 

以活酵母细胞为原料，按照啤酒酵母细胞：水=1：10g/mL混合均匀后，即刻放置于在5℃温度环境下进行机械搅拌5min，并再搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至1.5；选用长度为0.5mm、半径为0.5mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、酸性去离子水(利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至1.5)分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为45kV/cm和频率为3000Hz后，再将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为45mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。 

实施例2： 

以啤酒酵母泥为原料，则是先将啤酒废弃酵母泥配制成8％混合液，过80目筛2次，再加5％酒石酸后自然沉降30min后，进行低温离心处理(4℃，3600r/min，10min)，弃上清液，获得啤酒废酵母细胞；而后再按照啤酒酵母细胞：水=1：20g/mL混合均匀，即刻放置于在18℃温度环境下进行磁力搅拌3min，并再搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至2.5；选用长度为1.5mm、半径为0.5mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、酸性去离子水(利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至2.5)分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为35kV/cm和频率为2500Hz后，再将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为35mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。 

实施例3： 

以活酵母细胞为原料，按照啤酒酵母细胞：水=1：100g/mL混合均匀后，即刻放置于在10℃温度环境下进行磁力搅拌5min，并再搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至3.5；选用长度为 3.5mm、半径为0.8mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、酸性去离子水(利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至3.5)分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路3次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为10kV/cm和频率为2000Hz后，再将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为25mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。 

实施例4： 

以啤酒酵母泥为原料，则是先将啤酒废弃酵母泥配制成8％混合液，过80目筛2次，再加5％酒石酸后自然沉降30min后，进行低温离心处理(4℃，3600r/min，10min)，弃上清液，获得啤酒废酵母细胞；而后再按照啤酒酵母细胞：水=1：60g/mL混合均匀，即刻放置于在20℃温度环境下进行机械搅拌5min，并再搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至4.5；选用长度为2.5mm、半径为0.8mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、酸性去离子水(利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至4.5)分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路3次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为15kV/cm和频率为3000Hz后，再将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为35mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。 

实施例5： 

以活酵母细胞为原料，按照啤酒酵母细胞：水=1：40g/mL混合均匀后，即刻放置于在15℃温度环境下进行磁力搅拌1min，并再搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至5.5；选用长度为2.0mm、半径为0.6mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、酸性去离子水(利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至5.5)分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为10kV/cm和频率为1200Hz后，再将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为45mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未 经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。 

实施例6： 

以啤酒酵母泥为原料，则是先将啤酒废弃酵母泥配制成8％混合液，过80目筛2次，再加5％酒石酸后自然沉降30min后，进行低温离心处理(4℃，3600r/min，10min)，弃上清液，获得啤酒废酵母细胞；而后再按照啤酒酵母细胞：水=1：80g／mL混合均匀，即刻放置于在5℃温度环境下进行机械搅拌4min，并再搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至5.5；选用长度为3.5mm、半径为0.7mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、酸性去离子水(利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至5.5)分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路3次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为25kV/cm和频率为1000Hz后，再将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为10mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。 

Claims (1)

1.一种快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶活性的方法，其特征在于，采用啤酒酵母活细胞或者啤酒酵母泥为原料，利用高压脉冲电场技术快速抑制啤酒酵母细胞酸性海藻糖分解酶，包括啤酒酵母细胞悬浮液的制备、悬浮液酸度的调配、高压脉冲电场参数的调控、悬浮液恒流泵料速度的调控工艺过程；

1)所述的啤酒酵母细胞悬浮液的制备过程，倘若以啤酒酵母活细胞为原料，则是按照啤酒酵母活细胞：水=1：10～1：100g/mL混合均匀即为啤酒酵母细胞悬浮液；倘若以啤酒酵母泥为原料，则是先将啤酒废弃酵母泥配制成8％混合液，过80目筛2次，再加5％酒石酸后自然沉降30min后，进行低温离心处理，其中离心温度为4℃，转速选定为3600r/min，离心时间为10min，弃上清液，获得啤酒废酵母细胞；而后再按照啤酒废酵母细胞：水=1：10～1：100g／mL，混合均匀即为啤酒酵母细胞悬浮液，即可进行酸度的调配处理；

2)所述的悬浮液酸度的调配过程，是将啤酒酵母细胞悬浮液即刻放置于5～20℃温度环境下进行机械或者磁力搅拌，时间控制在1～5min范围内，并在搅拌过程中利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配啤酒酵母细胞悬浮液pH值至1.5～5.5后，即可进行高压脉冲电场参数的调控处理；

3)所述的高压脉冲电场参数的调控过程，是选用长度为0.5～3.5mm、半径为0.5～0.8mm的适宜电极，而后依次选用75％乙醇、去离子水、利用0.1M盐酸溶液和0.1M氢氧化钠溶液调配pH值至1.5～5.5的酸性去离子水，分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2～3次后，再调整设定高压脉冲电场装置的电场强度为10～45kV/cm和频率为1000～3000Hz后，即可进行物料恒流泵调控处理；

4)所述的悬浮液恒流泵料速度的调控工艺过程，是将物料恒流泵调控至啤酒酵母细胞悬浮液流量为10～45mL/min，按照高压脉冲电场电极处理前的管路溶液体积，进行核算未经电场处理样液体积所需历经时间后再进行收集酸性海藻糖分解酶活性抑制率达到95％以上的啤酒酵母细胞悬浮液于成品罐中。