CN102807565B - 一种提取黄连素的改进方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物活性成分的提取领域，涉及采用纤维素酶去除植物细胞壁从而破碎细胞的一种提取纯化方法，具体为一种提取黄连素的改进方法。本改进方法的步骤为先将黄柏进行粉碎、然后冲蒸、再和酶反应、采用石灰乳浸提、然后沉淀结晶、干燥等步骤。本提取方法浸提率高、提取周期缩短、溶剂使用量较小。利用纤维素酶降解细胞壁，使细胞壁受到不同程度的破坏，以增加细胞的通透率，提高细胞中活性成分的浸提率，缩短提取时间，并相对减少了溶剂的使用量，提高了生产效率；节能环保、绿色安全。酶反应的条件温和，对工程设备要求不高，操作简捷；酶反应所需的物质不会给环境带来压力，从而降低对能源消耗、对环境的污染。

Description

一种提取黄连素的改进方法

技术领域

 本发明属于植物活性成分的提取领域，涉及采用纤维素酶去除植物细胞壁从而破碎细胞的一种提取纯化方法，具体为一种提取黄连素的改进方法。

背景技术    

黄皮树 ( Phellodendron chinense Schneid. ) 为芸香科 ( Rutaceae ) 黄柏属 ( Phellodendron Rupr. ) 植物。中药川黄柏为黄皮树的干燥树皮。黄柏的化学成分主要有生物碱类、黄酮类、内酯类、萜类、甾醇类及挥发油类等，其中主要以生物碱类的原小檗碱类中的小檗碱为主。主要药理作用：抗菌、抗炎，降血压、降血糖，抗肿瘤、镇咳、祛痰、抑制应激性溃疡，清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮等等。

    酶工程技术是近几年来发展起来的一项新型的工业技术，酶反应具有温和高效的优点。纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，而大部分中药材的细胞壁都是由纤维素构成，且有效成分往往被包裹在细胞壁内的细胞中，通过纤维素酶作用于中药材细胞壁，以不同程度地分解细胞壁，改变细胞壁的通透性，从而提高细胞内含物的提取率。从它被发现后，它的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，并取得了很大进展。目前，纤维素酶已广泛应用在农业、食品工业、发酵工业、医药、纺织、日用化工、造纸、石油开采、废水处理及饲料等各个领域。

    纤维素酶具有对天然活性成分破坏小、对设备要求不高、能源消耗低等的优点，故在植物天然产物的提取中具有不可比拟的优势。纤维素酶的在实际当中应用时，可缩短提取时间，减少溶剂使用量，节省资源能源，降低生产成本等。

 小檗碱，又称黄连素，已成为一种常用药，在临床上得到了广泛应用，关于小檗碱的提取已有诸多报道，目前几种主要的提取方法有酸提法、碱提法、醇提法、酸醇法以及一些辅助提取技术如超声波法、微波法等。申请号为200810069671.8，名称“一种黄连总生物碱提取工艺”以及申请号为200910191620.7，名称“黄连碱的提取方法”使用的都是是酸提法，但由于黄柏含有大量的粘液质，给操作带来了一些不方便；超声波法、微波法虽具有广阔的前景，但它对容器的要求较高，且可能会破坏有效成分等特点，故其对工程设备要求较高，要大规模用于生产，还要进一步解决工程设备等问题，如申请号为02103880.5，名称“黄连总生物碱的提取工艺及其新用途”；醇提法与酸醇法一般为回流提取，虽提取率高，但要消耗大量的能源，增加了生产成本，如申请号为200410065893.4，名称为“黄连、吴茱萸总生物碱的提取方法及其制剂”。   

发明内容

本发明正是针对以上技术问题，提供以纤维素酶去除植物细胞壁，增大活性物质的浸出速率和浸出量，尽可能地提高资源利用率，同时节省资源能源，降低生产成本、简便而高效的一种提取黄连素的改进方法。

本发明的技术方案为：

一种提取黄连素的改进方法，包括以下步骤：。

A. 粉碎：将黄柏进行粉碎；黄柏，为芸香科植物黄皮树或黄檗的干燥树皮，将其粉碎后的粉屑过20目筛或切成3—5 mm细丝；

B. 冲蒸：将步骤A中的黄柏粉屑采用蒸汽蒸煮，蒸煮的时间为10—30 min，蒸汽温度保持95—105℃；通过高温蒸汽对黄柏中可能存在的不利于纤维素酶酶反应的因子进行灭活，如一些抑制纤维素酶发挥作用的抑制因子，同时也杀灭可能分解氧化黄柏小檗碱的酶以提高提取速率与产品得率；

C. 冷却：将步骤B中的黄柏粉屑经自然冷却至30—50 ℃；较高的温度会影响酶的活性；

D. 溶酶：称取一定量的纤维素酶并溶于水中，配制成质量百分含量为10‰—20‰的纤维素酶溶液；

E. 浸泡：将步骤C中的黄柏粉屑与步骤D中的纤维素酶溶液按1:2—1:4的比例混合好，黄柏粉屑采用的是质量来进行比例混合的，其单位为g，纤维素酶溶液在比例中采用的是体积进行配比的，其单位为ml，混合后在30—50℃的温度下保温4—6h； 

F. 浸提Ⅰ：将步骤E中的黄柏粉屑与纤维素酶混合后的物料与澄清石灰水，按料液质量g与料液体积ml为 1:5—1:9的比例进行混合，浸提4—6 h后，经纱布过滤，进行固液分离，得黄柏残渣和含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅰ；

作为优选，此步骤中的黄柏粉屑与纤维素酶混合后的物料与澄清石灰水，料液质量g与料液体积ml的比例按1:6—1:8配比时为最佳，当料液比大于1:8时，其提取量切线斜率会变小，即在当下料液比，单位料液比的石灰水溶液所提的生物碱量最高，且所用溶剂的量最小；

G. 浸提Ⅱ：将步骤F中的黄柏残渣的质量g与澄清石灰水的体积ml，按1:5—1:9的比例进行混合，浸提6—8 h，经纱布过滤，再次进行固液分离，得黄柏残渣和含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅱ；

H. 浸提Ⅲ：将步骤G中的黄柏残渣的质量g与澄清石灰水的体积ml按1:4—1:7的比例进行混合，浸提4—6h，经纱布过滤，进行固液分离，弃黄柏残渣或用于别的用途，得含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅲ；

I. 将步骤F中的石灰水溶液Ⅰ和步骤G中的石灰水溶液Ⅱ进行混合，加入10%（W/V）固体工业食盐，搅拌溶解，冷藏6-10小时；

J. 取步骤I中的沉淀，加热水溶解，趁热过滤，滤液用2mol/L的HCl，调节其pH值为1—2，然后再加入10%（W/V）固体工业食盐，搅拌溶解，冷藏6-10小时；

K. 取J中的晶体，用少量蒸溜水冲洗并将pH值控制为5—6，这里的蒸馏水为冰水或冷水，然后在60 ℃以下干燥，即得盐酸小檗碱精品，小檗碱的含量在94%左右；干燥采用装置为真空干燥箱。

   步骤C和E中的30—50 ℃为纤维素酶的适应的反应温度，旨在提高反应速率，以缩短反应时间；

   步骤H中的H中的含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅲ，由于所含的生物碱的浓度较低，会给下一步的沉淀纯化带来麻烦，或浓缩会增加生产成本，其不利于沉淀结晶，同时也会消耗大量的工业食盐、盐酸，故将H中的石灰水溶液Ⅲ进入下一生产循环的步骤F，在步骤F中作为石灰水浸提液使用。

浸提是指将药材中的可溶物转移到适宜溶剂中的过程，本申请中的浸提是将黄柏中的小檗碱与Ca(OH)₂反应生成的盐溶于水溶液中的过程。

本提取方法通过高温蒸汽将可能存在的影响酶反应的因素和可能造成黄柏小檗碱的损失的因素去除，尽可能地提高资源利用率。

与现有技术相比，有益效果为：

（一）. 浸提率高、提取周期缩短、溶剂使用量较小。利用纤维素酶降解细胞壁，使细胞壁受到不同程度的破坏，以增加细胞的通透率，提高细胞中活性成分的浸提率，缩短提取时间，并相对减少了溶剂的使用量，提高了生产效率,较未使用酶处理提高了3—5个百分点。

（二）.节能环保、绿色安全。酶反应的条件温和，对工程设备要求不高，操作简捷；酶反应所需的物质不会给环境带来压力，从而降低对能源消耗、对环境的污染。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1 ：  

应用纤维素酶提取黄柏盐酸黄连素的方法：

步骤一：黄柏的粉碎、冲蒸；

将黄柏采用粉碎机进行粉碎，使粉碎后的粉屑过20目筛，然后将黄柏粉屑用温度为95℃的蒸汽蒸30 min；再将蒸煮后的黄柏粉屑经自然冷却至40℃；

步骤二：酶反应；

称取一定量的纤维素酶，使其与水溶液配制成质量百分含量为15‰的纤维素酶溶液；然后将冷却的黄柏粉屑的质量g与纤维素酶溶液的体积量ml按1:2的比例进行混合，同时在40 ℃的条件下保温5 h；

步骤三：石灰乳浸提；

F. 将步骤E中黄柏粉屑与纤维素酶溶液混合的物料的质量g与澄清石灰水的体积ml按1:8的比例进行混合，浸提6 h后，经纱布进行过滤后，进行固液分离，得黄柏残渣和含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅰ；

G. 浸提Ⅱ：将步骤F中黄柏残渣的质量g与澄清石灰水的体积ml按1:8的比例进行混合，然后浸提8 h，经纱布过滤，进行固液分离，得黄柏残渣和含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅱ；

H. 浸提Ⅲ：将步骤G中黄柏残渣的质量g与澄清石灰水的体积ml按1:6的比例进行混合，然后进行浸提4 h，经纱布过滤，进行固液分离，弃黄柏残渣或用于别的用途，得含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅲ；其中所述的石灰水溶液Ⅲ将进入下一个生产周期的F中的用于浸提用的石灰水溶液；

步骤四：沉淀结晶

I. 将F中的石灰水溶液Ⅰ和G中的澄清石灰水溶液Ⅱ合并，加入10%（W/V）固体工业食盐，搅拌溶解，冷藏8h；

J. 取I中的沉淀，加热水溶解，趁热过滤，滤液加浓HCl调pH=2，同时增加10%（W/V）固体工业食盐，搅拌溶解，冷藏8h；

步骤五：干燥

K. 取J中的晶体，用少量蒸溜水洗将含晶体的溶液的pH值调节至6，然后在60℃以下干燥，即得盐酸小檗碱精品。

实施例二：

应用纤维素酶提取黄柏盐酸黄连素的方法：

步骤一：与实施例一中步骤一相同；

步骤二：与实施例一中步骤二相同；

步骤三： 

F. 浸提Ⅰ：将E中黄柏粉屑与澄清石灰水按料液比1:8混合，浸提8 h；

G. 浸提Ⅱ：将F中黄柏残渣与澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提8 h；

H. 浸提Ⅲ：将G中黄柏残渣与澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提5h；

其余与与实施例一中步骤三相同；

步骤四：与实施例一中步骤四相同。

实施例三：

应用纤维素酶提取黄柏盐酸黄连素的方法：

步骤一：与实施例一中步骤一相同；

步骤二：

D. 溶酶：称取纤维素酶加水溶液配制成10‰的酶溶液；

E. 浸泡：将C中的黄柏粉屑与D中的纤维素酶溶液按1:3混合好，同时在40℃时保温4 h；

其余与实施例一中步骤二相同；

步骤三： 

F. 浸提Ⅰ：将E中黄柏粉屑与澄清石灰水按料液比1:7混合，浸提7 h；

G. 浸提Ⅱ：将F中黄柏残渣与澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提7 h；

H. 浸提Ⅲ：将G中黄柏残渣与澄清石灰水按料液比1:5混合，浸提4 h；

其余与与实施例一中步骤三相同；

步骤四：与实施例一中步骤四相同。

实施例四：

应用纤维素酶提取黄柏盐酸黄连素的方法：

步骤一：与实施例一中步骤一相同；

步骤二：与实施例三中步骤二相同；

步骤三：与实施例一中步骤三相同；

步骤四：与实施例一中步骤四相同。

实施例五：

应用纤维素酶提取黄柏盐酸黄连素的方法：

步骤一：与实施例一中步骤一相同；

步骤二：

D. 溶酶：称取纤维素酶配并制成10‰的酶溶液；

E. 浸泡：将C中的黄柏粉屑与D中的纤维素酶溶液按1:4混合好，同时在40 ℃保温4 h；

其余与实施例一中步骤二相同；

步骤三： 

F. 浸提Ⅰ：将E中黄柏粉屑与澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提7 h；

G. 浸提Ⅱ：将F中黄柏残渣与澄清石灰水按料液比1:8混合，浸提7 h；

H. 浸提Ⅲ：将G中黄柏残渣与澄清石灰水按料液比1:6混合，浸提4 h；

其余与与实施例一中步骤三相同；

步骤四：与实施例一中步骤四相同。

检测结果（以盐酸黄连素计）如下

注：盐酸小檗碱（黄连素）的测定方法为2010中国药典第二部639页；

提取率= ；其中α：粗提物盐酸黄连素含量；β：黄柏中小檗碱的含量；m：粗提物的质量；M：样品（黄柏）的质量。 

Claims (6)

1.一种提取黄连素的改进方法，其特征在于包括以下步骤：

A. 粉碎：将黄柏进行粉碎；

B. 冲蒸：将步骤A中的黄柏粉屑采用蒸汽蒸煮；

C. 冷却：将步骤B中的黄柏粉屑经自然冷却至30—50 ℃；

D. 溶酶：称取纤维素酶并溶于水中，配制成质量百分含量为10‰—20‰的纤维素酶溶液；

E. 浸泡：将步骤C中的黄柏粉屑的质量g与步骤D中的纤维素酶溶液体积ml按1:2—1:4的比例混合好，同时在30—50℃的温度下保温4—6 h；

F. 浸提Ⅰ：将步骤E中的黄柏粉屑与纤维素酶混合后的物料与澄清石灰水，按物料质量g与料液体积ml为 1:5—1:9的比例进行混合，浸提4—6 h后，经纱布过滤后，再进行固液分离，得黄柏残渣和含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅰ；

G. 浸提Ⅱ：将步骤F中的黄柏残渣的质量g与澄清石灰水的体积ml，按1:5—1:9的比例进行混合，浸提6—8 h，经纱布过滤，再次进行固液分离，得黄柏残渣和含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅱ；

H. 浸提Ⅲ：将步骤G中的黄柏残渣的质量g与澄清石灰水的体积ml按1:4—1:7的比例进行混合，浸提4—6h，经纱布过滤，进行固液分离，弃黄柏残渣或用于别的用途，得含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅲ；

I. 将步骤F中的石灰水溶液Ⅰ和步骤G中的石灰水溶液Ⅱ进行混合，加入W/V 浓度 10%的固体工业食盐，搅拌溶解，冷藏6-10小时进行沉淀；

J. 取步骤I中的沉淀物，加60—80℃热水溶解，趁热过滤，滤液加浓HCl，然后调节滤液的pH值为1—2，然后再加入W/V 浓度 10%的固体工业食盐，搅拌溶解，冷藏6-10小时进行结晶；

K. 取J中的晶体，用少量蒸溜水冲洗并将pH值控制为5—6，然后在60 ℃以下干燥，即得盐酸小檗碱精品。

2. 根据权利要求1所述的提取黄连素的改进方法，其特征在于：步骤A中的黄柏粉屑过20目筛或切成3—5 mm细丝。

3. 根据权利要求1或权利要求2所述的提取黄连素的改进方法，其特征在于：所述的步骤J中加入的浓HCl的浓度为2mol/L。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的提取黄连素的改进方法，其特征在于：所述的步骤H中的含黄柏总生物碱的石灰水溶液Ⅲ将进入下一个生产周期的F步骤中，用于F步骤中浸提用的石灰水溶液。

5. 根据权利要求1或权利要求2所述的提取黄连素的改进方法，其特征在于：所述的步骤K中的蒸馏水为冰水或冷水，干燥采用的装置为真空干燥箱。

6. 根据权利要求1或权利要求2所述的提取黄连素的改进方法，其特征在于：所述的步骤B中蒸汽蒸煮的时间为10—30 min，蒸汽温度保持在95—105℃。