CN112458131A - 一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：从啤酒废液中得到啤酒废酵母、种子培养、热处理、发酵培养、一次加压培养、离心过滤收集固形物和滤液、固形物二次加压培养、升降压破碎细胞、冻干后超声波破碎细胞、超滤后过酸碱柱及真空冷冻干燥。本发明提供的利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法利用生产啤酒过程中主要的副产物啤酒酵母发酵制备，减少能源消耗，减轻环境污染，保护生态平衡，废物利用，降低生产成本，经济效益可观，具有广泛而长远的社会效益；利用海藻糖特异的抗逆保护作用，施加胁迫条件使酵母产生应激反应，生产更多的应激代谢物‑海藻糖，海藻糖得率高。
Description
技术领域
本发明涉及糖工程技术领域，尤其涉及一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法。
背景技术
海藻糖是有两个葡萄糖分子通过α，α-1,1键结合而成的非还原性双糖。它广泛存在于细菌、真菌、藻类、低等植物及昆虫中。经研究发现，该糖具有独特的生物学功能，有保护生物大分子，保护细胞膜，保护蛋白质免受冷冻、干燥及渗透压变化等造成的破坏，广泛应用于食品、医药、化妆品、农业等领域。
海藻糖在酵母中的含量最大，因此传统的生产方法主要是从酵母中提取，活性干酵母中虽然海藻糖含量较高，且具有细胞活性，但由于其自身成本较高，限制了其应用。而啤酒废酵母成本较低，传统方法直接将废酵母泥，经除杂脱苦得干净酵母泥，干制酵母粉或将干净酵母泥加自溶剂(甚至强酸强碱)自溶，自溶后离心得沉淀用来生产以葡聚糖为主的多糖，自溶后离心的上清一般直接放掉，内含海藻糖，既浪费资源又造成了环境污染，有些虽然提取了海藻糖但得率较低。
酵母具有应激反应，当受到各种应激因子刺激时，会激活一些基因的表达，其细胞和生物体会本能的合成一套保护性的物质，从而保护生物面授应激胁迫的损害，海藻糖作为应激代谢物，可通过给酵母菌一定的胁迫条件，使其产生大量的海藻糖，同时抑制海藻糖酶的活性，提高海藻糖提取率。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，其利用胁迫条件使酵母产生应激反应，产生应急代谢物-海藻糖，从而提高海藻糖得率。
为达此目的，本发明提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
1)将啤酒废液加纯水稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度23～28℃，培养18～24h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将经过热处理的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量30％～50％，搅拌速度200r/min，30～35℃条件下培养36h，得到发酵培养液；
所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度30～35℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度10～15℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率为10MPa/min进行降压，使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液进行超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
发酵培养基中葡萄糖含量相较高于常规培养基，提供菌体在胁迫条件下对碳源需求，延长菌体存活期，生产更多海藻糖。步骤5)中离心过滤后的滤液中含有一定的菌体破裂后释放的海藻糖，在步骤8)中与上清液组合纯化，对滤液中的海藻糖进行回收，避免浪费，可提高海藻糖得率。
进一步优选的，步骤3)中的所述热处理为在100℃热处理30min。
进一步优选的，所述6)中以降压速率为10MPa/min进行降压后，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次。
进一步优选的，步骤8)中所述超滤为使用3KDa分子量的超滤膜超滤。
有益效果：本发明提供的利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，其利用生产啤酒过程中主要的副产物啤酒酵母发酵制备，减少能源消耗，减轻环境污染，保护生态平衡，废物利用，降低生产成本，经济效益可观，具有广泛而长远的社会效益。
利用海藻糖特异的抗逆保护作用，通过发酵前使用合适的高温和时间对酵母进行高温胁迫，及时抑制海藻糖酶的活性及促进生产更多的海藻糖，在发酵培养基中增加盐度刺激和轻度毒性刺激、一次压力刺激以及使酵母产生应激反应，生产更多的应激代谢物-海藻糖，压力刺激后调整升压速率、压力和温度，进行低温胁迫与二次压力刺激结合，给于一定应激刺激时间，使酵母产生应激反应，生产更多的应激代谢物-海藻糖的同时，防止酵母快速失活降低海藻糖的产量，另外一次压力刺激和二次压力刺激时高压CO2由于酸化作用是反应体系pH值降低及CO2的加入导致产生厌氧影响，给酵母以胁迫，生产更多的应激代谢物-海藻糖，海藻糖得率高。
二次压力刺激后快速降压以及循环快速升降压，升压使CO2进入细胞的通透力增强，降压时细胞内CO2膨胀，细胞破碎，并结合冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，从而使得海藻糖几乎全部流出，海藻糖得率高。
具体实施方式
下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
1)将啤酒废液500kg加纯水1500kg稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母184kg；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度25℃，培养20h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将在100℃热处理30min的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量50％，搅拌速度200r/min，30℃条件下培养36h，得到发酵培养液；所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度30℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度15℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率的为10MPa/min进行降压，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次，使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液使用3KDa分子量的超滤膜进行超滤，超滤透过液过酸碱柱后进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
制得海藻糖52.8kg，海藻糖得率为28.7％。
实施例2
本实施例提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
1)将啤酒废液1000kg加纯水3000kg稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母356kg；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度26℃，培养22h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将在100℃热处理30min的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量35％，搅拌速度200r/min，34℃条件下培养36h，得到发酵培养液；所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度34℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度10℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率为10MPa/min进行降压，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次，使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液使用3KDa分子量的超滤膜进行超滤，超滤透过液过酸碱柱后进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
制得海藻糖123.2kg海藻糖得率为34.6％。
实施例3
本实施例提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
1)将啤酒废液1500kg加纯水4500kg稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母539kg；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度23℃，培养24h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将在100℃热处理30min的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量45％，搅拌速度200r/min，31℃条件下培养36h，得到发酵培养液；所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度31℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度11℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率为10MPa/min进行降压，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次，使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液使用3KDa分子量的超滤膜进行超滤，超滤透过液过酸碱柱后进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
制得海藻糖141.8kg，海藻糖得率为26.3％。
实施例4
本实施例提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
1)将啤酒废液500kg加纯水1500kg稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母206kg；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度27℃，培养18h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将在100℃热处理30min的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量40％，搅拌速度200r/min，32℃条件下培养36h，得到发酵培养液；所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度32℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度12℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率为10MPa/min进行降压，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次，使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液使用3KDa分子量的超滤膜进行超滤，超滤透过液过酸碱柱后进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
制得海藻糖69.6kg，海藻糖得率为33.8％。
实施例5
本实施例提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
1)将啤酒废液1000kg加纯水3000kg稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母363kg；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度28℃，培养19h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将在100℃热处理30min的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量30％，搅拌速度200r/min，35℃条件下培养36h，得到发酵培养液；所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度35℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度14℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率为10MPa/min进行降压，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次，使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液使用3KDa分子量的超滤膜进行超滤，超滤透过液过酸碱柱后进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
制得海藻糖114.3kg，海藻糖得率为31.5％。
实施例6
本实施例提供一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，包括以下步骤：
1)将啤酒废液1500kg加纯水4500kg稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母542kg；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度24℃，培养23h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将在100℃热处理30min的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量35％，搅拌速度200r/min，33℃条件下培养36h，得到发酵培养液；所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度33℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度12℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率为10MPa/min进行降压，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次，使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液使用3KDa分子量的超滤膜进行超滤，超滤透过液过酸碱柱后进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
制得海藻糖161.5kg，海藻糖得率为29.8％。
以上所揭露的仅为本发明几种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (4)
1.一种利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将啤酒废液加纯水稀释，筛分，离心分离得到纯净的啤酒废酵母；
2)种子培养：将步骤1)得到的啤酒废酵母活化后，接种与装有种子培养基的发酵罐中，180r/min，培养温度23～28℃，培养18～24h，得到种子培养液；
3)发酵罐培养：将经过热处理的种子培养液按10％接种量于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量30％～50％，搅拌速度200r/min，30～35℃条件下培养36h，得到发酵培养液；
所述发酵培养基的组分以质量分数为：蛋白胨2.05％、葡萄糖1.85％、酵母粉2.05％、氯化钠1.5％、甲醇0.85％，pH5.5～6.0，121℃条件下灭菌20min；
4)将步骤3)得到的发酵培养液置于高压反应釜中，搅拌速度140r/min，温度30～35℃，然后通入CO2以升压速率为0.08MPa/min升压至0.8MPa，定压发酵培养2.5h，随后以降压速率为0.08MPa/min进行降压，取出得到第二发酵培养液；
5)将所述第二发酵培养液离心过滤收集固形物，得到酵母菌体，并收集滤液；
6)加入纯水以悬浮酵母菌体，得到酵母液，将酵母液置于高压反应釜中搅拌速度140r/min，温度10～15℃，然后通入CO2以升压速率为0.1MPa/min升压至1MPa，定压10min，随后以降压速率为10MPa/min进行降压使酵母细胞裂解，释放出海藻糖；
7)将步骤6)得到的液体进行冻干后超声波破碎，使酵母细胞完全裂解，释放出海藻糖；
8)将步骤7)得到的物质溶于水，离心所得上清液及步骤5)得到的滤液进行超滤，超滤透过液过酸碱柱，通过酸碱柱的液体进行真空冷冻干燥得到海藻糖。
2.如权利要求1所述的利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，其特征在于，步骤3)中的所述热处理为在100℃热处理30min。
3.如权利要求1所述的利用啤酒酵母制备海藻糖的方法，其特征在于，所述6)中以降压速率为10MPa/min进行降压后，再以升降压为10MPa/min，升压至2MPa后再降压，循环2次。
4.如权利要求1所述的利用啤酒废酵母制备海藻糖的方法，其特征在于，步骤8)中所述超滤为使用3KDa分子量的超滤膜超滤。
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2020
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