CN110720411B - 一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法，包括以下步骤：低渗处理、搅拌脱粘、孵化脱膜、卵膜收集，本发明的石斑鱼在孵化过程中去除卵膜的方法，科学调节pH值、水温及培养剂的比例，有效处理卵膜，在不避免影响水质的条件下达到最大脱膜率，分离出的相对比较完整卵膜已可以满足需求，对推动石斑鱼基于卵膜相关的研究具有积极重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物除膜领域，特别涉及一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法。
背景技术
卵膜是包裹动物卵细胞的非细胞性被膜的总称，不同动物的卵膜，其形态结构及组成也大不相同，卵膜在卵细胞的保护和精卵识别过程发挥重要的作用。软体动物作为仅次于节肢动物的最大无脊椎动物类群，其卵膜结构呈现多样化的结构，总体来看其卵膜较厚，不易分离。
石斑鱼卵和具卵膜丝鱼卵卵膜较厚，最外端具有一定厚度的复杂多层蛋白壳，并且卵膜和细胞质膜紧密贴合，分离和溶解也卵膜比较困难，这对石斑鱼卵膜结构研究带来诸多不便。目前，针对鱼卵除膜使用物理脱膜会破坏鱼卵，采用化学制剂会降低鱼卵的存活率，对石斑鱼卵膜分离效果都不好。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法：包括以下步骤：
S1、低渗处理：在孵化池中加入磷酸缓冲盐溶液进行漂洗，磷酸缓冲盐溶液与卵细胞的体积比为30～35：17～20，漂洗2～4次后浸泡卵细胞，在24～30℃混匀静置6～15min；
S2、搅拌脱粘：将鱼卵放入泥浆内进行搅拌10～30min脱粘后取出，泥浆为泥土和水按1:5～8的比例混合搅拌均匀，过80～100目筛，放入孵化池中，进行水流冲洗，水流速度为1～2.4m/s，水压为0.03～0.07MPa；
S3、孵化脱膜：加入孵化培养剂，调节pH值为5～8，水温28～34℃，孵化20～28h，再加入孵化培养剂，调整pH值为5.7～8.5，水温28～34℃，培养50～75h，所述孵化培养剂为质量浓度比(0.1～3)：(0.1～3)：(0.5～5)：(1～7)的丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、茶多酚、植酸；
S4、卵膜收集：将上述置于40～60um孔径的细胞筛上，用灭菌的过滤海水反复冲洗1～3次，灭菌海水的盐度为35～40‰，温度为20～28℃，除去卵黄物质，收集沉淀即为卵膜，吸取到离心管中2～4℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的石斑鱼在孵化过程中去除卵膜的方法较为温和，经低渗处理、搅拌脱粘、孵化脱膜、卵膜收集等方式，使用渗透原理，将卵细胞吸水膨胀，与卵膜脱离，使用泥浆进行搅拌，利用泥浆的粘性结合水流速度和水压控制，使具有弹性、韧性的卵膜在冲击强度的作用下将卵膜进一步自然脱落，同时，在孵化过程中加入培养剂，调节pH值，使鱼卵膜呈皱缩状态，不影响鱼卵孵化的条件下，加入具有抗氧化性的培养剂，防止卵膜发生氧化反应，增加脱膜的厚度，从而不易脱落；本发明分离出的相对比较完整卵膜可以满足需求，对推动石斑鱼基于卵膜相关的研究具有积极重要的意义。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法：包括以下步骤：
S1、低渗处理：在孵化池中加入磷酸缓冲盐溶液进行漂洗，磷酸缓冲盐溶液与卵细胞的体积比为30：17，漂洗2次后浸泡卵细胞，在24℃混匀静置6min；
S2、搅拌脱粘：将鱼卵放入泥浆内进行搅拌10min脱粘后取出，泥浆为泥土和水按1:5的比例混合搅拌均匀，过80目筛，放入孵化池中，进行水流冲洗，水流速度为1m/s，水压为0.03MPa；
S3、孵化脱膜：加入孵化培养剂，调节pH值为5，水温28℃，孵化20h，再加入孵化培养剂，调整pH值为5.7，水温28℃，培养50h，所述孵化培养剂为质量浓度比0.1：0.1：0.5：1的丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、茶多酚、植酸；
S4、卵膜收集：将上述置于40um孔径的细胞筛上，用灭菌的过滤海水反复冲洗1次，灭菌海水的盐度为35‰，温度为20℃，除去卵黄物质，收集沉淀即为卵膜，吸取到离心管中2℃保存。
实施例2
一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法：包括以下步骤：
S1、低渗处理：在孵化池中加入磷酸缓冲盐溶液进行漂洗，磷酸缓冲盐溶液与卵细胞的体积比为35：20，漂洗4次后浸泡卵细胞，在30℃混匀静置15min；
S2、搅拌脱粘：将鱼卵放入泥浆内进行搅拌30min脱粘后取出，泥浆为泥土和水按1:8的比例混合搅拌均匀，过100目筛，放入孵化池中，进行水流冲洗，水流速度为2.4m/s，水压为0.07MPa；
S3、孵化脱膜：加入孵化培养剂，调节pH值为8，水温34℃，孵化28h，再加入孵化培养剂，调整pH值为8.5，水温34℃，培养75h，所述孵化培养剂为质量浓度比3：3：5：7的丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、茶多酚、植酸；
S4、卵膜收集：将上述置于60um孔径的细胞筛上，用灭菌的过滤海水反复冲洗3次，灭菌海水的盐度为40‰，温度为28℃，除去卵黄物质，收集沉淀即为卵膜，吸取到离心管中4℃保存。
实施例3
一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法：包括以下步骤：
S1、低渗处理：在孵化池中加入磷酸缓冲盐溶液进行漂洗，磷酸缓冲盐溶液与卵细胞的体积比为32：18，漂洗3次后浸泡卵细胞，在27℃混匀静置10min；
S2、搅拌脱粘：将鱼卵放入泥浆内进行搅拌20min脱粘后取出，泥浆为泥土和水按1:6的比例混合搅拌均匀，过90目筛，放入孵化池中，进行水流冲洗，水流速度为1.7m/s，水压为0.05MPa；
S3、孵化脱膜：加入孵化培养剂，调节pH值为6，水温30℃，孵化24h，再加入孵化培养剂，调整pH值为8，水温30℃，培养65h，所述孵化培养剂为质量浓度比1.3：1.3：2.9：4的丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、茶多酚、植酸；
S4、卵膜收集：将上述置于50um孔径的细胞筛上，用灭菌的过滤海水反复冲洗2次，灭菌海水的盐度为38‰，温度为24℃，除去卵黄物质，收集沉淀即为卵膜，吸取到离心管中3℃保存。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于：S1步骤中所述磷酸缓冲盐溶液与卵细胞的体积比为25：10。
实施例5
本实施例与实施例3的区别在于：S3步骤中所述孵化培养剂为质量浓度比4：4：0.3：0.2的丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、茶多酚、植酸。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于：在S1步骤中未加入磷酸缓冲盐溶液进行漂洗。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于：在S2步骤中未进行水流冲洗。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于：在S3步骤中未加入孵化培养剂。
对比例4
本对比例与实施例3的区别在于：在S3步骤中在pH值为6，水温30℃，孵化24h即进行卵膜收集。
一、实验验证
| 样品 | 除膜率(％) |
| 实施例1 | 88.4 |
| 实施例2 | 90.0 |
| 实施例3 | 90.3 |
| 实施例4 | 87.6 |
| 实施例5 | 88.4 |
| 对比例1 | 60.7 |
| 对比例2 | 64.4 |
| 对比例3 | 63.7 |
| 对比例4 | 64.8 |
由上表可知，本发明的石斑鱼在孵化过程中去除卵膜的方法，除膜率高，实施例1～5中，经低渗处理、搅拌脱粘、孵化脱膜、卵膜收集等方式，科学调节pH值、水温及培养剂的比例，有效处理卵膜，在不避免影响水质的条件下达到最大脱膜率；对比例1～4中，表明在本发明的处理方法中，每一步骤环环相扣，缺少一个步骤则达不到最佳的效果，而本发明提供的方法可以高效去除的卵膜，这对石斑鱼的卵膜分离具有重要参考意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、低渗处理：在孵化池中加入磷酸缓冲盐溶液进行漂洗，漂洗2~4次后浸泡卵细胞，在24~30℃混匀静置6~15min；
S2、搅拌脱粘：将鱼卵放入泥浆内进行搅拌10~30min脱粘后取出，所述泥浆为泥土和水按1:5~8的比例混合搅拌均匀，过80~100目筛放入孵化池中，进行水流冲洗，水流速度为1~2.4m/s，水压为0.03~0.07MPa；
S3、孵化脱膜：加入孵化培养剂，所述孵化培养剂为质量浓度比(0.1~3)：(0.1~3)：(0.5~5)：(1~7)的丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、茶多酚、植酸，调节pH值为5~8，水温28~34℃，孵化20~28h，再加入孵化培养剂，调整pH值为5.7~8.5，水温28~34℃，培养50~75h；
S4、卵膜收集：将上述S3处理后的卵细胞置于40~60um孔径的细胞筛上，用灭菌的过滤海水反复冲洗1~3次，除去卵黄物质，收集沉淀即为卵膜，吸取到离心管中2~4℃保存。
2.如权利要求1所述的一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法，其特征在于：S1步骤中所述磷酸缓冲盐溶液与卵细胞的体积比为30~35：17~20。
3.如权利要求1所述的一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法，其特征在于：S4步骤中所述灭菌的过滤海水的盐度为35~40‰，温度为20~28℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Method for Removing Egg Membrane during the Hatching Process of Grouper Effective date of registration: 20230526 Granted publication date: 20211112 Pledgee: Agricultural Development Bank of China Lingshui Li Autonomous County sub branch Pledgor: HAINAN CHENHAI AQUATIC Co.,Ltd. Registration number: Y2023980041931 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |