CN102153674B - 对氨基苯甲酸壳聚糖酯及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对氨基苯甲酸壳聚糖酯，其结构为：

Description

对氨基苯甲酸壳聚糖酯及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖化学改性的功能衍生物，应用于食品行业，属于高分子化合物技术领域。

背景技术

食品防腐剂是抑制物质腐败的药剂，即对以腐败物质为代谢底物的微生物的生长具有持续的抑制作用，重要的是它能在不同情况下抑制最易发生的腐败作用，特别是在一般灭菌作用不充分时仍具有持续性的效果。食品防腐剂可以有效地解决食品在加工、储存过程中因微生物“侵袭”而变质的问题，使食品在一般的自然环境中具有一定的保存期。一般防腐剂在实际应用中存在很多问题：许多防腐剂并不能达到防腐效果，往往会影响食品的风味和品质；有的防腐剂的有效使用环境有限，酸性防腐剂只能在酸性环境中使用有强有效的防腐作用，但用在中性或偏碱性的环境中却没有多少作用；有些防腐剂只对细菌有效果，有的只对霉菌或酵母菌等真菌有效果；而有些防腐剂的溶解性不好，影响其均匀抗菌。将壳聚糖改性后制成的食品防腐剂具有抗菌能力及广谱抗菌性，抗菌效果持久、耐酸碱、耐洗涤、耐光耐热性好，易分散混合、不易变色，健康无害，对环境无二次污染，且不影响食品的保鲜和风味，对细菌和真菌杀灭效果明显。

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，其是生物界中大量存在唯一的一种碱性多糖。因分子内和分子间氢键的作用，壳聚糖只溶于酸和酸性水溶液。壳聚糖分子链上含有大量的羟基、氨基等可修饰的基团，可通过化学改性得到各种具有特殊功能的衍生物，因此可以扩大其应用范围。例如，壳聚糖具有优良的生物降解性、相容性、成膜特性和较强的抗菌防腐保鲜能力，在食品工业等领域得到广泛的应用。但壳聚糖仅能溶解于酸性介质中，限制了其应用范围。通常人们在壳聚糖分子上引入季铵盐、烷基、无机酸等，改进壳聚糖的溶解性或絮凝性。

发明内容

本发明的目的是要克服壳聚糖不溶于水的缺点，提供一种具有良好抗菌活性的壳聚糖衍生物—对氨基苯甲酸壳聚糖酯，可用作食品中抗菌防腐添加剂。

本发明的另一个目的是提供所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法。

本发明的目的是由以下技术方案完成的，研制了一种对氨基苯甲酸壳聚糖酯化合物，其特征在于：其结构为，

其中，X在0.65-0.95之间，分子量为70-80KD；该化合物的物化指标是：淡黄色粉末状固体，溶于水，微溶于乙醇和异丙醇。在壳聚糖分子链上引入对氨基苯甲酰基结构后，该化合物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的最低抑菌浓度分别达到0.1%和0.25%。

本发明通过对氨基苯甲酸与氯化亚砜反应，制备出对氨基苯甲酰氯，然后与壳聚糖席夫碱（由壳聚糖与苯甲醛反应得到）反应制备得到席夫碱化对氨基苯甲酸壳聚糖酯，最后水解去除氨基保护基得到对氨基苯甲酸壳聚糖酯。本发明涉及的主要反应为：

。

所述对氨基苯甲酰壳聚糖的制备方法，其制备步骤如下：

（1）将称量的对氨基苯甲酸溶于50-65℃蒸馏水中，热抽滤；滤液冷却到室温，在室温下抽滤；取滤饼，真空干燥，得到纯净的对氨基苯甲酸。

（2）取一定量已提纯的对氨基苯甲酸放入到三颈瓶中，以每克30ml比例加入一定体积无水乙醚，对氨基苯甲酸完全溶解，再加入过量的氯化亚砜，放入到水温为20-40℃的超声波清洗器中，超声振荡10-60分钟，反应产物为对氨基苯甲酰氯。

（3）称取一定量壳聚糖，以每克20ml比例加至一定体积质量百分数3%冰醋酸溶液中溶胀30min，转移至三口烧瓶中，于烧瓶中加入1/2倍溶液体积量的无水乙醇，搅拌，并于恒压滴液漏斗中加入1.5倍壳聚糖摩尔量的苯甲醛，再加入20倍苯甲醛体积量的无水乙醇，，将苯甲醛/乙醇溶液缓慢滴入至三口烧瓶中，在30-50℃下反应5h，出现絮状固体，将固体转移至烧杯中，并以每克固体200ml比例加入一定体积量的无水乙醇，静置过夜，抽滤，以1/5滤液体积的乙醇和乙醚混合液洗涤，恒温真空干燥得到淡黄色固体即席夫碱。

（4）在250ml三口烧瓶中加入步骤（3）产物，并以每克产物30ml比例加入一定体积的异丙醇和吡啶混合液，微加热搅拌一段时间，搅拌下缓慢滴加已溶入异丙醇步骤（2）产物，转入一定温度水浴中反应3h，反应液用10%的Na₂CO₃调至中性，抽滤，固体样品用乙醇索氏提取，抽滤，得到淡黄色产物。

（5）将步骤（4）产物悬浮于0.25mol/L的HCl和乙醇体积比1：4的混合液中室温搅拌24h，加入Na₂CO₃调pH至中性，抽滤，用大量乙醇洗涤，真空干燥得产物对氨基苯甲酸壳聚糖酯。

所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于：所述的（1）步中抽滤的工艺条件是：用滤瓶和布氏漏斗在50-65℃烘箱中烘1-3小时，再在50-65℃下用水泵抽滤反应液，抽滤结束后，迅速把滤液倒入到干净的烧杯中。

所述步骤（3）、（4）和（5）中抽滤的工艺条件都是：用滤瓶和布氏漏斗在50-65℃烘箱中烘1-3小时，再在室温下用水泵抽滤反应液，抽滤结束后，洗涤并收集布氏漏斗中所得固体。

所述的壳聚糖：苯甲醛：对氨基苯甲酸的投料重量比为1:(1-3):(1-3)。

所述步骤（3）中无水乙醇和无水乙醚的混合体积比为1:(1-10)。

所述步骤（4）中异丙醇和吡啶的体积比为(1-5):1。

所述步骤（5）中索氏提取的工艺条件为： 65-75℃水浴加热，提取24-30小时。

所述步骤（1）、（3）和（5）中真空干燥的工艺条件为：30-50℃下，真空度为8×10⁴Pa，干燥12-24小时。

所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯作为制备食品防腐添加剂的应用。

本发明的积极效果在于：将对氨基苯甲酰基引入到壳聚糖分子上制备出新型的壳聚糖衍生物。该壳聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉具有良好的抗菌活性，扩大了壳聚糖的抑菌范围，可用作食品防腐添加剂。

附图说明

图1为壳聚糖的红外光谱图。

图2为所制备的对氨基苯甲酸壳聚糖酯的红外光谱图。

图3为壳聚糖的¹H NMR谱图。

图4为所制备的对氨基苯甲酸壳聚糖酯的¹H NMR谱图。

图5不同浓度壳聚糖及壳聚糖酯对金黄色葡萄球菌的抑菌率。

图6不同浓度壳聚糖及壳聚糖酯对黑曲霉菌的抑菌率。

分析图1和图2两红外谱图可见，壳聚糖红外谱图中1649 cm^-1处为酰胺Ι谱带，由于脱乙酰度较高，峰较小，1597 cm^-1处为强氨基-NH₂吸收带。1373 cm^-1为O-H弯曲振动，1159 cm^-1和893 cm^-1为壳聚糖糖基吸收带。壳聚糖酯的谱图在1712 cm^-1处的微弱峰是酯化物中C=O的伸缩振动，1610 cm^-1处的新峰是强氨基吸收带，它随取代度的增大而增大，1517cm^-1处为新引进基团中芳环骨架振动吸收峰，1245 cm^-1处为新合成壳聚糖酯中C-O-C的伸缩振动。证明成功合成了对氨基苯甲酸壳聚糖酯。

图3和图4中将壳聚糖溶解于CD₃COOD和D₂O的混合物，对氨基苯甲酸壳聚糖酯溶于D₂O中进行核磁谱图测定。由图3表明，2.02ppm处的小峰是由于壳聚糖乙酰胺基中-CH₃的存在所引起的，由于脱乙酰度较高，峰较小；而2.96ppm处的独立峰归因于H₂的存在；从3.50-3.72ppm各样的峰与壳聚糖中H₃，H₄，H₅，H₆是完全一致的；在4.67ppm处的峰则是H₁的作用。在图4中，3.76-4.08ppm处的系列峰为对氨基苯甲酸壳聚糖酯中H₃-H₅的特征峰；在4.32ppm处的独立峰为-COOCH₂-中的质子峰；3.01ppm处峰归属于H₂的作用峰；7.40-7.74ppm处的多重峰为新引进双取代苯环中质子的特征峰，由峰的位移及新峰的产生证明了对氨基苯甲酰氯已被成功接枝到壳聚糖上生成了对氨基苯甲酸壳聚糖酯。

图5中不同浓度壳聚糖及对氨基苯甲酸壳聚糖酯对金黄色葡萄球菌均产生抑制作用，且壳聚糖酯的抑菌能力明显大于壳聚糖，其最低抑菌浓度为0.1%。

图6中壳聚糖溶液浓度低于0.5%时对黑曲霉菌的生长反而产生促进作用，随着浓度升高逐渐表现出抑制能力，且抑菌率逐渐提高，分析原因可能是黑曲霉属于真菌类，真菌的细胞壁中含有壳聚糖，而在黑曲霉中，就有较高的壳聚糖含量，因此，黑曲霉对低浓度壳聚糖的抑菌作用具有一定的抗性。壳聚糖酯对黑曲霉菌的抑制能力较强，最低抑菌浓度达到了0.25%。

具体实施方式

下面通过具体实施例来进一步说明本发明。

实施例1

取干燥过的对氨基苯甲酸1g放入三颈瓶中，加入30mL的无水乙醚，再加入2mL氯化亚砜，放入到水温30℃的超声波洗涤器中，反应10分钟，冷却，抽滤得对氨基苯甲酰氯。

1g壳聚糖加至20mL质量分数3%冰醋酸中溶胀30min，转移至250ml三口烧瓶中，加入10mL无水乙醇，搅拌，并于恒压滴液漏斗中加入1.5mL已溶在30ml无水乙醇中的苯甲醛，在40℃下反应5h，出现絮状固体，加入200mL乙醇静置过夜，抽滤，用20mL乙醇和20mL乙醚的混合液洗涤，恒温干燥得到淡黄色固体即席夫碱。

在250ml三口烧瓶中加入0.5g已制得的壳聚糖席夫碱，并加入15mL体积比1：1的异丙醇和吡啶混合液，微加热搅拌一段时间，搅拌下缓慢滴加0.2mL已溶入异丙醇的对氨基苯甲酰氯，转入30℃水浴中反应3h，反应液用10%的Na₂CO₃调至中性，抽滤，用乙醇索氏提取12h，抽滤，得到淡黄色产物。

将产品悬浮于30mL0.25mol/L的HCl和乙醇体积比1：4的混合液中室温搅拌24h,加入Na₂CO₃调pH至中性，抽滤，用大量乙醇洗涤，真空干燥得产物对氨基苯甲酸壳聚糖酯。

实施例2：

本发明所得产物对氨基苯甲酸壳聚糖酯和壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌效率（%）

实施例3：

本发明所得产物对氨基苯甲酸壳聚糖酯和壳聚糖对黑曲霉菌的抑菌效率（%）

上述抑菌效率的测定方法：配制不同质量分数的壳聚糖溶液和衍生物溶液（以0.5%的醋酸溶液为溶剂）。分别将0.1 mL菌悬液和0.1 mL不同浓度的样品溶液均匀涂布在培养基平板上，空白为不加样品溶液的菌悬液。所有平板在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，取出观察各个平板上的细菌生长情况，计算抑菌率：

I = (n₁-n₂)/ n₁×100%

其中，n₁和n₂分别为空白和涂有样品的平板上的菌落数。

对于黑曲霉采用干重法测定壳聚糖和衍生物的抑菌效率。配制不同质量分数的壳聚糖溶液和衍生物溶液（以0.5%的醋酸溶液为溶剂）。分别将1 mL黑曲霉菌悬液和2 mL不同浓度的样品溶液添加到沙氏培养基中，空白为不加样品溶液的菌悬液，在28 ℃恒温振荡培养箱中培养48 h，抽滤，干燥并称菌体干重，计算抑菌率：

I = (m₁-m₂)/ m ₁×100%

其中，m₁和m₂分别为不加样品培养液中和添加样品培养液中的菌丝干重。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (7)

1. 一种对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯具有下式所示结构，

其中，X在0.65-0.95之间，分子量为70-80KD；

所述的制备步骤如下：

⑴ 将称量的对氨基苯甲酸溶于50-65℃蒸馏水中，热抽滤；滤液冷却到室温，在室温下抽滤；取滤饼，真空干燥，得到纯净的对氨基苯甲酸；

⑵ 取一定量的对氨基苯甲酸放入到三颈瓶中，以每克30ml比例加入一定体积无水乙醚，对氨基苯甲酸完全溶解，再加入过量的氯化亚砜，放入到水温为20-40℃的超声波清洗器中，超声振荡10-60分钟，反应产物为对氨基苯甲酰氯；

⑶ 称取一定量壳聚糖，以每克20ml比例加至一定体积质量百分数3%冰醋酸溶液中溶胀30min，转移至三口烧瓶中，于烧瓶中加入1/2倍溶液体积量的无水乙醇，搅拌，并于恒压滴液漏斗中加入1.5倍壳聚糖摩尔量的苯甲醛，再加入20倍苯甲醛体积量的无水乙醇，将苯甲醛/乙醇溶液缓慢滴入至三口烧瓶中，在30-50℃下反应5h，出现絮状固体，将固体转移至烧杯中，并以每克固体200ml比例加入一定体积量的无水乙醇，静置过夜，抽滤，以1/5滤液体积的乙醇和乙醚混合液洗涤，恒温真空干燥得到淡黄色固体即席夫碱；

⑷ 在三口烧瓶中加入步骤⑶产物，并以每克产物30ml比例加入一定体积异丙醇和吡啶混合液，微加热搅拌一段时间，搅拌下缓慢滴加已溶入异丙醇的对氨基苯甲酰氯，转入30-50℃水浴中反应3h，反应液用10%的Na₂CO₃调至中性，抽滤，固体样品用乙醇索氏提取，抽滤，得到淡黄色产物；

⑸ 将步骤⑷产物悬浮于0.25mol/L的HCl和乙醇体积比1：4的混合液中室温搅拌24h,加入Na₂CO₃调pH至中性，抽滤，用乙醇洗涤，真空干燥得产物对氨基苯甲酸壳聚糖酯。

2.根据权利要求1所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中抽滤的工艺条件是：用滤瓶和布氏漏斗在50-65℃烘箱中烘1-3小时，再在50-65℃下用水泵抽滤反应液，抽滤结束后，迅速把滤液倒入到干净的烧杯中；

所述步骤⑶、⑷和⑸中抽滤的工艺条件都是：用滤瓶和布氏漏斗在50-65℃烘箱中烘1-3小时，再在室温下用水泵抽滤反应液，抽滤结束后，洗涤并收集布氏漏斗中所得固体。

3.根据权利要求1所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖：苯甲醛：对氨基苯甲酸的投料重量比为1:(1-3):(1-3)。

4.根据权利要求1所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于所述步骤⑶中无水乙醇和无水乙醚的混合体积比为1:(1-10)。

5.根据权利要求1所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于所述步骤⑷中异丙醇和吡啶的体积比为(1-5):1。

6.根据权利要求1所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于所述步骤⑷中索氏提取的工艺条件为： 65-75℃水浴加热，提取24-30小时。

7.根据权利要求1所述对氨基苯甲酸壳聚糖酯的制备方法，其特征在于所述步骤⑴，⑶和⑸中真空干燥的工艺条件为：30-50℃下，真空度为8×10⁴Pa，干燥12-24小时。

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