CN111333750B - 一种壳寡糖-n-香叶醇衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提壳寡糖‑N‑香叶醇衍生物及其制备方法和用途，其中，一种壳寡糖‑N‑香叶醇衍生物，取代度为0.26‑0.283；一种壳寡糖‑N‑香叶醇衍生物的制备方法，其包括，将壳寡糖溶解于二甲基亚砜，将香叶基溴溶解于二甲基甲酰胺，然后混合，加入催化剂搅拌，水浴反应后加入丙酮，离心收集所得沉淀，索氏抽提、真空干燥，即得壳寡糖‑N‑香叶醇衍生物。本发明制备方法简单，成本低、提纯方法简便、性质稳定，得到的壳寡糖衍生物具有良好水溶性和抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等各种细菌均具有很好的抗菌活性，在医药、食品、化妆品和农业等领域具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及一种壳寡糖-N-香叶醇衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
随着食品工业的发展，为延长食品的保质期限，抑制微生物的污染，传统的物理防腐方法已经不再满足需求，添加防腐剂的方法因其简单、持久、成本更低得到了快速应用。因化学防腐剂可能具有潜在的累积性毒性，滥用或过量使用都会造成食品安全问题。随着人们生活水平的提高和安全意识的增强，一些安全、无毒、绿色的天然防腐剂更受人们青睐。
壳寡糖是一种从动物相关的物质中提取的天然防腐剂，具有生物无毒性、可自然降解性、生物相容性好等特点，此外，壳寡糖还呈现出一定的抗菌活性，能够有效抑制多种微生物的生长繁殖。
香叶醇(反-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)是一种单萜烯醇，天然存在于植物精油，具有类似玫瑰花香，是香精的常用主香剂，广泛应用于药物、烟草、食品配料等领域。它展示一些非凡的属性如杀虫剂、抗菌、抗氧化、抗炎和抗癌作用。
然而，由于壳寡糖是天然大分子产物，当作为食品防腐抗菌剂使用时，与传统的常用化学防腐剂相比，仍有抗菌活性低等缺点，所以目前在食品工业中的应用并不是很普遍。研究者通过对壳寡糖进行结构改造，调节各分子因素，发现了很多具有更高抗菌活性的壳寡糖衍生物，由于壳寡糖分子链上具有化学反应活性的氨基和羟基，这些位点均为进行化学修饰的理想位点，可在其上修饰具有抗菌活性的小分子化合物来提高其抗菌活性。
鉴于上述的缺陷，本设计人积极加以研究创新，以期创设一种壳寡糖-N-香叶醇衍生物及其制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。本发明的一个目的是通过香叶基溴中的溴原子在壳寡糖的2位活性氨基上接枝香叶基，以增强壳寡糖的抗菌活性，得到溶解性好、相互增效的壳寡糖衍生物。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种壳寡糖-N-香叶醇衍生物及其制备方法和用途。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种壳寡糖-N-香叶醇衍生物，其化学结构式如下所示，其中，n为6-20，取代度为0.26-0.283；
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的优选方案，其中：所述壳寡糖为分子量为1000Da，脱乙酰度为90％的壳寡糖。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法，其包括，将壳寡糖溶解于二甲基亚砜，将香叶基溴溶解于二甲基甲酰胺，然后混合，加入催化剂搅拌，水浴反应后加入丙酮，离心收集所得沉淀，索氏抽提、真空干燥，即得壳寡糖-N-香叶醇衍生物。
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法的优选方案，其中：所述壳寡糖与所述香叶基溴的质量份比例为2：1～3。
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法的优选方案，其中：所述水浴反应其温度为50℃，反应时间为6h。
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法的优选方案，其中：所述催化剂为三乙胺。
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法的优选方案，其中：所述壳寡糖为分子量为1000Da，聚合度n为4～100。
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法的优选方案，其中：还包括纯化步骤，其为真空干燥后将产物用水溶液透析24h，再冷冻干燥，最终得到经纯化的壳寡糖-N-香叶醇衍生物。
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法的优选方案，其中：所述香叶基溴的制备方法为，将香叶醇溶于无水乙醚中，加入吡啶作催化剂，搅拌得到澄清溶液；冰浴搅拌反应溶液，15min内将三溴化磷的乙醚混合液滴入所述反应溶液；洗涤、干燥、旋转蒸发，即得到香叶基溴。
作为本发明所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法的优选方案，其中：获得的壳寡糖-N-香叶醇衍生物在医药、食品、化妆品和农业等领域具有很好的应用前景。
本发明的有益效果：
本发明制备方法简单，成本低、提纯方法简便、性质稳定，得到的壳寡糖衍生物具有良好水溶性和抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等各种细菌均具有很好的抗菌活性，在医药、食品、化妆品和农业等领域具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为壳寡糖的红外光谱图；
图2为本发明实施例中制备的壳寡糖衍生物的红外光谱图；
图3为壳寡糖的1H核磁共振图；
图4为本发明实施例中制备的壳寡糖衍生物的1H核磁共振图；
图5为壳寡糖、壳寡糖-N-香叶醇衍生物、香叶醇对金黄色葡萄球菌的抑制表观对比图，其中a.空白对照b.壳寡糖c.香叶醇d.壳寡糖-N-香叶醇1e.壳寡糖-N-香叶醇12f.壳寡糖-N-香叶醇3；
图6为壳寡糖、壳寡糖-N-香叶醇衍生物、香叶醇对大肠杆菌的抑制表观对比图，其中a.空白对照b.壳寡糖c.香叶醇d.壳寡糖-N-香叶醇1e.壳寡糖-N-香叶醇12f.壳寡糖-N-香叶醇3；
图7为壳寡糖-N-香叶醇衍生物的合成路线图；
图8为壳寡糖和壳寡糖-N-香叶醇在不同pH下的溶解性；图片中为壳寡糖(A)，香叶醇(B)壳寡糖-N-香叶醇1(C)在水中溶解后状态，A(COS)、C(COS-N-Ger1)均为黄色澄清透明溶液，；B(Ger)溶液出现分层；其中衍生物C的颜色比A深。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
具有良好水溶性和抗菌活性的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法如下：采用三溴化磷和香叶醇为原料，首先经取代反应得到香叶基溴，然后与壳寡糖的2位氨基发生烷基化反应，再经纯化得到壳寡糖-N-香叶醇衍生物，其合成路线如图7。
实施例1：
壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法包括以下几个步骤：
1.香叶基溴的制备
将香叶醇溶解在无水乙醚中，加一定量吡啶作催化剂，搅拌得到澄清溶液；冰浴搅拌下，15min内将三溴化磷乙醚混合液滴入反应溶液；反应结束后，使用分液漏斗将上层有机层分别用水、碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤；有机层用无水硫酸钠干燥过夜；旋转蒸发获得黄色糖浆状产物，即得到香叶基溴。
2.壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备
选用分子量为1000Da，聚合度n为4～7的壳寡糖，壳寡糖和香叶基溴的摩尔比为1:1。
将壳寡糖溶解在二甲基亚砜中，并滴加一定量的三乙胺作为催化剂，搅拌得到澄清溶液；将香叶基溴溶解在二甲基甲酰胺中，在不断搅拌下使用恒压滴定漏斗滴加至壳寡糖溶液中；混合物在水浴中在50℃下搅拌反应6h；反应完成后，向混合物中倒入丙酮使产品沉淀，通过离心收集沉淀；沉淀物用石油醚在索氏抽提装置中抽提12h以除去其中的有机溶剂，干燥后得到粗品。
将粗品在超纯水中透析24h，冷冻干燥得到纯品壳寡糖-N-香叶醇衍生物。
使用红外光谱和核磁共振氢谱对其进行表征。
图1为壳寡糖的红外光谱图，其中，3378cm-1为O-H与N-H的伸缩振动吸收峰，2962–2881cm-1为C-H伸缩振动的吸收峰，1616cm-1为C＝O的伸缩振动吸收峰，1519cm-1为NH2的弯曲振动吸收峰，1556cm-1与1071cm-1为C-O伸缩振动的吸收峰，893cm-1为环伸缩振动吸收峰。
图2是本实施例中壳寡糖衍生物的红外光谱图，其中1516cm-1处的吸收峰明显减小，且1616cm-1的吸收峰转移至了1625cm-1，并且吸收峰变宽，这是由于NH2被香叶醇取代，香叶醇中的C＝C和壳寡糖中C＝O振动重合导致，证明了目标产物成功合成。
图3是本实施例中壳寡糖的1H NMR图，化学位移出现在2.07ppm处的峰对应的是乙酰氨基残基上的-CH3的质子峰。化学位移出现在3.08-3.15ppm处的峰对应的是氨基葡萄糖N的质子峰，多重峰出现在3.32-4.09ppm是氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖上的次甲基氢。
图4是本实施例中壳寡糖衍生物的1H NMR图，在5.15和5.28ppm处出现了香叶醇-C＝C-H的化学位移值；2.149和2.071ppm为香叶醇的亚甲基质子的化学位移值；1.731，1.696和1.624ppm为香叶醇CH3的化学位移值，证明了目标产物成功合成。
实施例2：
壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法包括以下几个步骤：
1.香叶基溴的制备
将香叶醇溶解在无水乙醚中，加一定量吡啶作催化剂，搅拌得到澄清溶液；冰浴搅拌下，15min内将三溴化磷乙醚混合液滴入反应溶液；反应结束后，使用分液漏斗将上层有机层分别用水、碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤；有机层用无水硫酸钠干燥过夜；旋转蒸发获得黄色糖浆状产物，即得到香叶基溴。
2.壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备
选用分子量为1000Da，聚合度n为4～7的壳寡糖，壳寡糖和香叶基溴的摩尔比为1:2。
将壳寡糖溶解在二甲基亚砜中，并滴加一定量的三乙胺作为催化剂，搅拌得到澄清溶液；将香叶基溴溶解在二甲基甲酰胺中，在不断搅拌下使用恒压滴定漏斗滴加至壳寡糖溶液中；混合物在水浴中在50℃下搅拌反应6h；反应完成后，向混合物中倒入丙酮使产品沉淀，通过离心收集沉淀；沉淀物用石油醚在索氏抽提装置中抽提12h以除去其中的有机溶剂，干燥后得到粗品。
将粗品在超纯水中透析24h，冷冻干燥得到纯品壳寡糖-N-香叶醇衍生物。
实施例3：
壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法包括以下几个步骤：
1.香叶基溴的制备
将香叶醇溶解在无水乙醚中，加一定量吡啶作催化剂，搅拌得到澄清溶液；冰浴搅拌下，15min内将三溴化磷乙醚混合液滴入反应溶液；反应结束后，使用分液漏斗将上层有机层分别用水、碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤；有机层用无水硫酸钠干燥过夜；旋转蒸发获得黄色糖浆状产物，即得到香叶基溴。
2.壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备
使用分子量为1000Da，聚合度n为4～7的壳寡糖，壳寡糖和香叶基溴的摩尔比为1:3。
将壳寡糖溶解在二甲基亚砜中，并滴加一定量的三乙胺作为催化剂，搅拌得到澄清溶液；将香叶基溴溶解在二甲基甲酰胺中，在不断搅拌下使用恒压滴定漏斗滴加至壳寡糖溶液中；混合物在水浴中在50℃下搅拌反应6h；反应完成后，向混合物中倒入丙酮使产品沉淀，通过离心收集沉淀；沉淀物用石油醚在索氏抽提装置中抽提12h以除去其中的有机溶剂，干燥后得到粗品。
将粗品在超纯水中透析24h，冷冻干燥得到纯品壳寡糖-N-香叶醇衍生物。
实施例4：
溶解性研究中发现壳寡糖在常用有机溶剂DMSO中完全溶解，在DMF部分溶解因此选取该试剂。
表1产物在有机溶剂中的溶解性
注：+溶；±微溶；-不溶；
壳寡糖衍生物的抗菌活性：
选择革兰氏阴性和革兰氏阳性生物(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)作为测试生物。挑取菌株至LB培养基中生长并培养至二代，使细菌生长处于对数期，用生理盐水稀释至所需要的水平(105CFU/mL)的细菌悬液。在无菌条件下，将菌液、抗菌物质溶液(5μL菌液和5mL含1mg/mL抗菌物质的LB液体培养基混合)加入培养基中混匀，未加抗菌物质的作为空白对照，将平板在37℃下培养24h，观察细菌的生长情况。
COS、Ger和COS-N-Ger对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性，分别在图5、6中显示。COS(b),Ger(c)and COS-N-Ger(d,e,f)与对照相比，可以不同程度抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌，证明了改性的材料具有较好的抗菌活性。
表2产物的产率和取代度
抗菌衍生物对细菌的敏感性测试
如上描述制备105CFU/mL的细菌悬液；100μL菌液与20-25mL冷却至50℃的固体培养基混合，常温下冷却凝固；用打孔器(9mm)在培养基上打孔，并作标记；将200μL含各种浓度(1-8mg/mL)的抗菌物质溶液加入孔内，在4℃冰箱预扩散两小时；然后转移至37℃培养箱培养24h后,测定各孔抑菌圈直径，每个孔测三次。
从抑菌圈数据可发现衍生物对金黄色葡萄球菌更加敏感，且随着取代度的增加，抗菌性逐渐增加。
表3不同浓度抗菌物质对微生物的抑菌圈直径
实施例5
香叶基溴的制备
将香叶醇溶解在无水乙醚中，加一定量吡啶作催化剂，搅拌得到澄清溶液；冰浴搅拌下，15min内将三溴化磷乙醚混合液滴入反应溶液；反应结束后，使用分液漏斗将上层有机层分别用水、碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤；有机层用无水硫酸钠干燥过夜；旋转蒸发获得黄色糖浆状产物，即得到香叶基溴。
壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备
使用分子量为1000Da，聚合度n为4到7的壳寡糖，壳寡糖和香叶基溴的摩尔比为1:2。
将壳寡糖溶解在二甲基亚砜中，并滴加一定量的吡啶作为催化剂，搅拌得到澄清溶液；将香叶基溴溶解在二甲基甲酰胺中，在不断搅拌下使用恒压滴定漏斗滴加至壳寡糖溶液中；混合物在水浴中在25℃下搅拌反应6h；反应完成后，向混合物中倒入丙酮使产品沉淀，通过离心收集沉淀；沉淀物用石油醚在索氏抽提装置中抽提12h以除去其中的有机溶剂，干燥后得到粗品。
将粗品在超纯水中透析24h，冷冻干燥得到纯品壳寡糖-N-香叶醇衍生物。
本发明提供了一种壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法，属于食品添加剂技术领域。制备方法包括以下步骤：(1)香叶醇通过溴化反应进行活化，生成香叶基溴；(2)香叶基溴与壳寡糖2位的氨基发生烷基化反应生成壳寡糖-N-香叶醇衍生物；(3)利用红外光谱和核磁共振氢谱对衍生物进行分析确证，香叶醇与壳寡糖的氨基有效结合，通过元素分析得到衍生物的取代度为0.26-0.283。本发明制备方法简单，成本低、提纯方法简便、性质稳定，得到的壳寡糖衍生物具有良好水溶性和抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等各种细菌均具有很好的抗菌活性，在医药、食品、化妆品和农业等领域具有很好的应用前景。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法，其特征在于：包括，
将壳寡糖溶解于二甲基亚砜，将香叶基溴溶解于二甲基甲酰胺，然后混合，加入催化剂搅拌，水浴反应后加入丙酮，离心收集所得沉淀，索氏抽提、真空干燥，即得壳寡糖-N-香叶醇衍生物；其中，
所述壳寡糖与所述香叶基溴的质量份比例为2：1～3；
所述水浴反应其温度为50℃，反应时间为6h；
所述催化剂为三乙胺；
所述壳寡糖-N-香叶醇衍生物的化学结构式如下所示，其中，n为6-20，取代度为0.26-0.283；
。
2.如权利要求1所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法，其特征在于：所述壳寡糖为分子量为1000Da，脱乙酰度为90％的壳寡糖。
3.如权利要求1所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法，其特征在于：还包括纯化步骤，其为真空干燥后将产物用水溶液透析24h，再冷冻干燥，最终得到经纯化的壳寡糖-N-香叶醇衍生物。
4.如权利要求1～3中任一所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法，其特征在于：所述香叶基溴的制备方法为，将香叶醇溶于无水乙醚中，加入吡啶作催化剂，搅拌得到澄清溶液；冰浴搅拌反应溶液，15min内将三溴化磷的乙醚混合液滴入所述反应溶液；洗涤、干燥、旋转蒸发，即得到香叶基溴。
5.如权利要求4所述的壳寡糖-N-香叶醇衍生物的制备方法，其特征在于：获得的壳寡糖-N-香叶醇衍生物在医药、食品、化妆品和农业领域中的应用。
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