CN102140137B - 一种与植物育性相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
一种与植物育性相关蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与植物育性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为MYB21CDS，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物育性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明提供了一个基因MYB21CDS，该基因经过超表达后导致植物雄性不育。在生产上，可以将该基因诱导超表达用于产生不育系作为母本与父本杂交产生杂交种。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种与植物育性相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
植物雄性不育，即由于植物花组织中雄蕊发育缺陷而引起的雄性不育。雄性不育关键基因的克隆对当前农业的生产应用有着非常重要的意义。雄性不育可以用于构建杂交种的母本自交系。在育种过程中，不育的母本自交系与可育的父本自交系杂交后可以得到高产优质的杂交种。当前育种过程中用到的是不育系、保持系和恢复系。保持系用于与不育系杂交，产生新的不育系作为母本自交系用于制种。而且目前生产中用到的不育系多为稳定遗传的不育基因所引起。传统的三系配套需要三个系，因此工作量大，制种相对繁琐。可调节不育基因的发现将有助于完善育种配套系统，实现两系配套。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)是现代国际和国内进行植株生物学研究的模式植物。拟南芥属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科。拟南芥作为模式植物广泛用于研究的主要优点有：植株小(高30cm左右)；世代时间短(大约2个月)；结子多(每棵植物可产约5000粒种子以上)；基因组小(5条染色体，小于1亿个碱基对，约24000个基因)；生活力强(用普通培养基就可作人工培养)。对拟南芥基因功能的深入研究将有助于作物性状的遗传改良。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植物育性相关蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白质，命名为MYB21CDS，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下1)或2)的蛋白质：
1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物育性相关的由1)衍生的蛋白质。
上述序列2由226个氨基酸组成。
所述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。
所述编码基因为如下1)、2)或3)的所示的基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码与植物育性相关蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有90％同源性且编码与植物育性相关蛋白的DNA分子。
序列表中的序列1所示的DNA由681个脱氧核糖核苷酸组成。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
含有所述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保护的范围。
所述重组载体为将所述编码基因插入载体pCambia 1301的XbaI和SacI识别位点得到的重组载体。
本发明的另一个目的是提供一种培育雄性不育的转基因植物的方法。
本发明提供的方法，是将所述的编码基因导入目的植物得到雄性不育的转基因植物。
所述雄性不育的转基因植物为下述3种中的至少一种：
1)所述转基因植物的花丝长度小于所述目的植物；
2)所述转基因植物的花粉囊不开裂，不能释放出花粉；
3)所述转基因植物的育性低于所述目的植物。
所述转基因植物的育性低于所述目的植物为所述转基因植物枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的百分含量小于所述目的植物枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的百分含量。
所述编码基因是所述重组载体导入所述目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥。
重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物。
本发明的实验证明，本发明提供了一个基因MYB21CDS，该基因经过超表达后导致植物雄性不育。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植作物遗传改造和育种提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景，可以将该基因诱导超表达用于产生不育系在农林花卉领域广泛应用。
附图说明
图1为MYB21CDS超表达载体构建的图谱
图2为转MYB21CDS植株的RT-PCR检测及表型图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1、MYB21CDS基因的获得
提取拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia-0生态型(Arabidopsis BiologicalResource Center(ABRC)，种子号：CS6673)花的RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板，以引物1：agctctagaatggagaaaagaggaggaggaag和引物2：atcgagctctcaattaccattcaataaatgca，进行PCR扩增。得到的PCR产物送去测序。结果为该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该PCR产物的基因命名为MYB21CDS，该基因编码区为序列表中序列1自5’末端第1-681位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为MYB21CDS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
也可人工合成序列表中的序列1。
实施例2、转MYB21CDS拟南芥的获得
1、超表达载体pCambia 1301-MYB21CDS的获得
将上述PCR产物经过XbaI和SacI酶切，得到的片段与经过同样酶切的pCambia1301(GenBank号：AF234297，Gibberellin Acts through Jasmonate to Control theExpression of MYB21，MYB24 and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth inArabidopsis.Cheng Hui，Song Susheng，Xiao Langtao，Soo Hui Meng，Cheng Zhiwei，Xie Daoxin，Peng Jinrong.PLoS Genetics 5(3)：e1000440.2009，公众可从清华大学获得。)体大片段连接，得到的连接产物，转入大肠杆菌，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pCambia 1301的XbaI和SacI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pCambia 1301-MYB21CDS。该载体的结构示意图如图1所示。
2、转MYB21CDS拟南芥的获得
1)Agrobacterium tumefaciens GV3101/pCambia 1301-MYB21CDS
将pCambia 1301-MYB21CDS经电转法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciensGV3101，Gibberellin Acts through Jasmonate to Control the Expression of MYB21，MYB24 and MYB57 to Promote Stamen Filament Growth in Arabidopsis.Cheng Hui，Song Susheng，Xiao Langtao，Soo Hui Meng，Cheng Zhiwei，Xie Daoxin，PengJinrong.PLoS Genetics 5(3)：e1000440.2009，公众可从清华大学获得。)中，得到转化子。提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为pCambia 1301-MYB21CDS，将含有该质粒的转化子命名为Agrobacterium tumefaciens GV3101/pCambia 1301-MYB21CDS。
3)转MYB21CDS拟南芥
培养上述Agrobacterium tumefaciens GV3101/pCambia 1301-MYB21CDS，得到菌液，将拟南芥(Columbia-0)花浸在菌液中，培养，得到50株T0代转MYB21CDS拟南芥。
从T0代转MYB21CDS拟南芥上收获种子，播于含潮霉素(20mg/L)的MS筛选培养基上，得到55株具有潮霉素抗性的T1代转MYB21CDS拟南芥。待T1代转MYB21CDS拟南芥长至4-6叶时移到蛭石上生长60天，光照时间(24℃：16小时/光照+8小时/黑暗)。T1代转MYB21CDS拟南芥编号为1-55。
分别提取上述55株T1代转MYB21CDS拟南芥叶的DNA，用CaMV35S启动子上特异引物acagtggtcccaaagatggacc和MYB21CDS的一条反向引物tcaattaccattcaataaatgca进行PCR，结果为得到883bp片段的为阳性，共得到55株阳性T1代转MYB21CDS拟南芥。
采用同样的方法，将空载体pCambia 1301转入拟南芥Columbia-0中，得到T0代转空载体拟南芥，从T0代植株收获种子，播种，得到T1代转空载体拟南芥。提取T1代转空载体拟南芥叶的DNA，以用CaMV35S启动子上特异引物Acagtggtcccaaagatggacc和MYB21CDS的一条反向引物tcaattaccattcaataaatgca进行PCR，结果为没有目的基因的扩增，说明得到阳性T1代转空载体拟南芥。
3、转MYB21CDS拟南芥的功能鉴定
分别提取编号为4T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-4)和编号为5的T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-5)的RNA，反转录得到cDNA，用引物3：cactccagaagagcaacttatc和引物4：cgattgcttgatgtatttttgaa通过定量RT-PCR分析编号为4T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-4)和编号为5的T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-5)的MYB21CDS超表达的水平，以野生型拟南芥Col-0(Col-0)和T0代转空载体拟南芥为对照。
结果如图2的C所示，RT-PCR分析拟南芥Col-0野生型、MYB21CDS超表达植株MYB21OE-4、MYB21OE-5的MYB21CDS表达水平；野生型拟南芥Col-0(Col-0)的MYB21CDS的表达量为1.00；编号为4(MYB21OE-4)和5(MYB21OE-5)的T1代转MYB21CDS拟南芥的MYB21CDS的MYB21CDS的表达量分别为2.42和47.79。从图中看出，与野生型拟南芥Col-0相比，编号为4和5的T1代转MYB21CDS拟南芥的MYB21CDS的MYB21CDS表达水平明显提高。野生型拟南芥和转空载体拟南芥的结果无显著差异。
同样观察编号为4T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-4)和编号为5的T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-5)的花和枝条育性表型，以野生型拟南芥Col-0(Col-0)和T0代转空载体拟南芥为对照。每个株系检测10株，实验重复三次，结果取平均值。
结果如图2的A和B所示，A为野生型拟南芥Col-0、MYB21OE-4、MYB21OE-5的花表型；B为野生型拟南芥Col-0、MYB21OE-4、MYB21OE-5的枝条育性表型；
野生型拟南芥Col-0的花丝长度为1.99毫米；
MYB21OE-4的花丝长度为1.73毫米；
MYB21OE-5的花丝长度为1.05毫米；
从图中看出，与野生型拟南芥Col-0相比，MYB21OE-4、MYB21OE-5的花丝均较短，花粉囊均不能开裂、均不能释放出有活性花粉；野生型拟南芥和转空载体拟南芥的结果无显著差异。
根据枝条上结种子的角果衡量植物的育性；枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重越大，育性越高；
MYB21OE-4的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为82.1％；
MYB21OE-5的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为0％；
野生型拟南芥Col-0的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为99.2％；
从上述可以看出，MYB21OE-4枝条上部分角果内结有种子，MYB21OE-5枝条上所有角果内均没有种子，为完全不育。野生型拟南芥和转空载体拟南芥的结果无显著差异。
再采用同样的方法检测编号为5、15、18、23、33、46、55的T1代转MYB21CDS拟南芥，以野生型拟南芥Col-0(Col-0)和T0代转空载体拟南芥为对照。结果如图2的D所示，RT-PCR分析拟南芥Col-0野生型、MYB21CDS超表达植株MYB21OE-15、-18、-23、-33、-46、-55的MYB21CDS表达水平；编号为5、15、18、23、33、46、55的T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-5、MYB21OE-15、MYB21OE-18、MYB21OE-23、MYB21OE-33、MYB21OE-46、MYB21OE-55)的MYB21CDS的表达量分别为47.79、42.82、31.03、16.59、8.94、4.97和3.39；野生型拟南芥Col-0的MYB21CDS的表达量为1.00；野生型拟南芥和转空载体拟南芥的结果无显著差异。
同样观察编号为5、15、18、23、33、46、55的T1代转MYB21CDS拟南芥(MYB21OE-5、MYB21OE-15、MYB21OE-18、MYB21OE-23、MYB21OE-33、MYB21OE-46、MYB21OE-55)的花和枝条育性表型，以野生型拟南芥Col-0(Col-0)和T0代转空载体拟南芥为对照。每个株系检测10株，实验重复三次，结果取平均值。
野生型拟南芥Col-0的花丝长度为1.99毫米；
MYB21OE-5的花丝长度为1.05毫米；
MYB21OE-15的花丝长度为1.09毫米；
MYB21OE-18的花丝长度为1.17毫米；
MYB21OE-23的花丝长度为1.24毫米；
MYB21OE-33的花丝长度为1.38毫米；
MYB21OE-46的花丝长度为1.61毫米；
MYB21OE-55的花丝长度为1.69毫米；
结果如图2的E所示，拟南芥Col-0野生型、MYB21CDS超表达植株MYB21OE-15、-18、-23、-33、-46、-55的枝条育性表型；与野生型拟南芥Col-0(Col-0)相比，MYB21OE-5、MYB21OE-15、MYB21OE-18、MYB21OE-23、MYB21OE-33、MYB21OE-46、MYB21OE-55的花的花丝长度较短，不能伸长、花粉囊均不能开裂、均不能释放出有活性花粉。野生型拟南芥和转空载体拟南芥的结果无显著差异。
根据枝条上结种子的角果衡量植物的育性；枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重越大，育性越高；
MYB21OE-5的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为0％；
MYB21OE-15的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为0％；
MYB21OE-18的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为0％；
MYB21OE-23的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为3.6％；
MYB21OE-33的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为7.1％；
MYB21OE-46的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为11.5％；
MYB21OE-55的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为41.7％；
野生型拟南芥Col-0的枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重为99.2％；
野生型拟南芥和转空载体拟南芥的结果无显著差异。
从上述可以看出，MYB21CDS超表达，花丝均不能伸长、花粉囊均不能开裂、均不能释放出有活性花粉，MYB21CDS超表达水平越强，植株育性就越低(育性越低，枝条上结种子的角果就越少，育性高低指枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的比重)；当MYB21CDS的超表达是野生型的30倍以上时(编号为5、15、18)，T1代转MYB21CDS植株表现为完全雄性不育(完全雄性不育的标准表型为枝条不结种子)。
Claims (4)
1.一种培育雄性不育的转基因植物的方法，是将由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的植物得到雄性不育的转基因植物；
所述目的植物为拟南芥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述雄性不育的转基因植物为下述3种中的至少一种：
1）所述转基因植物的花丝长度小于所述目的植物；
2）所述转基因植物的花粉囊不开裂，不能释放出花粉；
3）所述转基因植物的育性低于所述目的植物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述转基因植物的育性低于所述目的植物为所述转基因植物枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的百分含量小于所述目的植物枝条上结种子的角果占枝条上总角果数的百分含量。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子。
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