CN102138981A - 一种车前子多糖提取物的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种车前子多糖提取物的制备方法和医药用途。制备方法包括原料脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的车前子多糖提取物。本发明提取物中车前子多糖的含量以葡萄糖计，所述多糖的含量占车前子提取物重量百分比72％以上。本发明通过大量的药理学实验发现，车前子多糖提取物具有免疫抑制活性，可以用作制备各种剂型的免疫抑制剂或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，用于治疗与免疫炎性损伤相关的疾病：肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿，以及眼葡萄膜炎、角膜基质炎、角膜移植排异反应等眼部疾病的医药用途。

Description

一种车前子多糖提取物的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种中药车前子多糖提取物的制备方法和该车前子多糖提取物通过免疫抑制活性，用于治疗与免疫炎性损伤相关的疾病：肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿、以及眼葡萄膜炎、角膜基质炎、角膜移植排异反应等眼部疾病的医药用途。

背景技术

车前子为车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥成熟种子。性味甘、寒，入肾、膀胱经，具有利水、清热、明目，祛痰的功效，用于小便不通，淋浊带下，尿血，暑湿泻痢，咳嗽多痰，湿痹，目赤障翳等病，临床上应用广泛。现在化学研究普遍认为，车前子含多量黏液质、车前子酸、车前子甙、车前烯醇酸、琥珀酸、腺嘌呤、胆碱、梓醇、蛋白质及各种脂肪酸等成分，但已经发现的小分子化学成分很难解释车前子的临床效能，车前子的药效物质基础还不明确。本发明通过深入的化学、药理、药效学研究，发明了一种制备车前子多糖的新方法，该方法操作简单，经济节能，并且能得到较高纯度和较大含量的车前子多糖；同时首次发现车前子多糖具有免疫抑制活性，可用于治疗与免疫炎性损伤相关的各种疾病，包括肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿，以及眼葡萄膜炎、角膜基质炎、角膜移植排异反应等眼部疾病，车前子多糖应为车前子的重要药效物质基础，这是一直以来被研究者所忽视的，车前子多糖的效能可以解释车前子的传统药效和应用。目前，虽有关于车前子多糖抗氧化、清除自由基的发明报道，但与本专利在多糖的制备、精制工艺上，尤其是药效作用机制上、用途上均有较大不同；另外，车前子多糖用于补充膳食纤维的发明也与本发明截然不同。

发明内容

本发明目的之一是提供一种具有确切的免疫抑制活性，无毒副作用的车前子多糖提取物的制备方法。

本发明目的之二是将上述车前子多糖提取物制成各种剂型的免疫抑制剂或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，用于治疗与免疫炎性损伤相关的疾病：肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿、以及眼葡萄膜炎、角膜基质炎、角膜移植排异反应等眼部疾病的医药用途。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种车前子多糖提取物的制备方法，其特征在于：车前子原料药材脱脂后，再经过水提

取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的车前子多糖提取物。

一种车前子多糖提取物的制备方法，其包括以下具体步骤：

(1)将车前子用高浓度乙醇回流除去脂溶性杂质；

(2)残渣加水回流提取，滤液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；

(3)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；

(4)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，透析；

(5)透析液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；

(6)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；

(7)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去多糖中的色素和蛋白质，即得车前子多糖提取物。

为了达到更好的提取效果，优选的，步骤(1)中将车前子用6～12倍重量的80～95％乙醇回流脱脂2～3次，每次回流2～3h；步骤(2)中将残渣加6～12倍重量的蒸馏水回流提取2～3次，每次回流提取2～3h，将滤液浓缩至药材0.2～1.0体积，加入80～95％乙醇醇沉，离心得沉淀；步骤(3)、(6)中将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；步骤(4)中的沉淀以0.5～2倍重量的蒸馏水复溶，以分子量大小为3.0×10³-1.2×10⁴的透析袋透析24～72h。

将从车前子中分离出的多糖依次采用DEAE-Sepharose F.F和DEAE-52离子交换色谱柱(洗脱相为0.1-1mol/L的NaCl溶液)，收集液可以选择但不限于如下琼脂糖凝胶柱色谱做进一步纯化分离：Sephadex G50、Sephacryl S100、Sephacryl 200、Sephacryl S300和SephacrylS400(洗脱相为0.1-1mol/L NaCl溶液)。本发明车前子多糖提取物中总多糖的含量占提取物重量百分比的72％以上，进一步纯化甚至可以得到车前子单体多糖。

本发明中所述的车前子包括：车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥成熟种子。

所述的车前子多糖提取物，具有免疫抑制活性：对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能呈抑制作用，提示具有非特异性免疫抑制功能；降低绵羊红细胞所致实验大鼠溶血素生成的含量，表示具有体液免疫抑制功能。车前子多糖提取物通过免疫抑制机制，可用于治疗与免疫炎性损伤相关的疾病：肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿、以及眼葡萄膜炎、角膜基质炎、角膜移植排异反应等眼部疾病的医药用途。

车前子多糖提取物可以用作制备各种剂型的免疫抑制剂或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，该药物组合物由有效量的车前子多糖提取物与药学上可接受的载体、赋型剂或稀释剂配合而成，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂、口服制剂等。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

取车前子药材约2kg，90％乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，将滤渣晾干，残渣加蒸馏水12倍量，回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂至药材1倍体积，用95％乙醇调至含醇量为80％，静置过夜，2000rpm/min离心，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，得总多糖。取总多糖加水溶解，上清液用分子量为3500的透析袋透析48h，透析液减压浓缩至药材1体积，加入95％乙醇调含醇量为80％，静置过夜，2000rpm/min离心，沉淀用4倍量无水乙醇、丙酮依次洗涤，蒸馏水复溶，进行弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂(Amberlite FPA90Cl+Amberlite IRC84)脱去总多糖中色素和蛋白质，冷冻干燥，得精制车前多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm处，紫外分光光度法测定总多糖含量，以葡萄糖C₆H₁₂O₆计为75％。

实施例2

取车前子药材约3kg，80％醇回流提取2次，每次3h，过滤，将滤渣晾干，残渣加蒸馏水10倍量，回流提取2次，每次3h，过滤，合并滤液，减压回收溶剂至药材1倍体积，用95％乙醇调至醇含量为85％，静置过夜，2000rpm/min离心，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，得总多糖。取总多糖加水溶解，上清液用分子量为7000的透析袋透析48h，透析液减压浓缩至药材1体积，加入95％乙醇调含醇量为85％，静止过夜，2000rpm/min离心，沉淀用4倍重量无水乙醇、丙酮依次洗涤，蒸馏水复溶，进行弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂(Amberlite FPA90Cl+Amberlite IRC84)脱去总多糖中色素和蛋白质冷冻干燥，得精制车前子多糖。用苯酚-硫酸法，在500nm处，紫外分光光度法测定总多糖含量，以葡萄糖C₆H₁₂O₆计为72％。

实施例3制成输液剂

将总多糖经过琼脂糖凝胶柱Sephacryl S300、Sephadex G50色谱做进一步纯化分离：得到98％纯度以上的车前子多糖提取物，加入适量增溶剂，研磨，再加入少量注射用水进行稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加注射用水至规定量，滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例4制成片剂

取车前子多糖提取物适量，加入稀释剂、崩解剂等辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣或喷薄膜衣即得。

实验例1车前子多糖对小鼠溶血素抗体生成(比色法)的影响试验

取昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为4组，即空白对照组、模型对照组、多糖低剂量组和多糖高剂量组，每组10只。每日腹腔注射多糖1次，连续14天。除空白对照组外，其余各组每只小鼠给8次药后腹腔注射绵羊红细胞悬液0.2ml/只(约4亿个细胞)进行免疫，用生理盐水将血清按1∶300比例稀释，将稀释后的小鼠血清1.0ml，绵羊红细胞0.5ml，加入试管中，再加入经生理盐水1∶10稀释的豚鼠血清1.0ml，空白对照以等体积生理盐水代替小鼠血清，置试管于37度水浴10min，取出试管置于冰水浴中，以终止反应，冷却后离心。将离心后上清液1.0ml，都氏液3.0ml加入试管中，混匀后静止10min，在540nm处测定吸收度值。另在试管中加入0.25ml绵羊红细胞和都氏液3.75ml测定绵羊红细胞半数溶血时的吸收度值。实验结果见表1。

表1：车前子多糖对小鼠溶血素抗体生成的影响(

n＝10)

注：△表示与空白组比较，P＜0.05，△△表示与空白组比较，P＜0.01；*表示与模型对照组比较，P＜0.05；**表示与模型对照组比较，P＜0.01

实验结果：模型组与空白对照组比较，具有极显著差异(P＜0.01)，表明造模成功。车前子多糖低剂量与模型组比较具有显著差异(P＜0.05)，车前子多糖高剂量与模型组比较具有极显著差异(P＜0.01)。试验结果表明车前子多糖对绵羊红细胞所致溶血素生成具有一定抑制作用，提示具有体液免疫抑制作用。

实验例2车前子多糖对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

取BALB/C雄性小鼠，随机分为空白组、香菇多糖组、地塞米松组和车前子高、中、低剂量等六组，每组15只，空白组给予生理盐水，其他各组给药见下表，均以灌胃方式给药，连续给药7d。末次给药24小时后，经小鼠尾静脉注入4倍1％明胶稀释的印度墨汁0.1ml/10g，分别于2min和6min眶后取血20μl，并将其加入到0.1％Na₂CO₃溶液2ml中摇匀，以0.1％Na₂CO₃做空白对照，在分光光度计600nm波长处测光密度值，OD₁表示2min的光密度值，OD₂表示6min的光密度值。根据公式计算廓清指数K，K值经体重及肝脾重量换算后，得吞噬指数α。廓清指数K＝lgOD₁-lgOD₂/t₂-t₁；吞噬指数α＝(体重/肝脾重)׳√K。实验结果见表2。

表2：车前子多糖对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响(

n＝15)

注：各组与空白对照组在相同时间比较^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01

实验结果：地塞米松组与空白组比较，廓清指数k值和吞噬指数α值均明显降低，且有极显著差异(p＜0.01)；车前子高剂量、车前子中剂量、车前子低剂量和空白组比较，廓清指数k值和吞噬指数α值均下降，且有极显著差异(p＜0.01)，实验结果表明，车前子多糖具有非特异性免疫抑制作用。

实验例3车前子多糖抗炎实验研究

ICR小鼠雄性80只，随机分成车前子高剂量、车前子低剂量、阳性对照地塞米松及空白对照组。称取各组小鼠体重，计算均值标准差确定无组间差异，空白组给予生理盐水，其它组给药见表3。连续灌胃给药三天，第三天于末次给药后50min，每鼠右耳涂致炎剂(二甲苯20μl)，左耳作为空白对照，3小时后将处死，剪下两耳并打下圆耳片，分析天平称重，计算小鼠耳朵肿胀度。比较4组肿胀度的差异性。实验结果表3。

表3：车前子多糖抗炎实验结果(

n＝10)

注：与空白组比较^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01

实验结果：各给药组同空白对照组比较，车前子高、低剂量组小鼠的耳差值重量减轻，出现极显著性差异(p＜0.01)。表明车前子多糖能降低小鼠耳肿胀程度，具有一定抗炎作用。

实验例4车前子多糖治疗大鼠肾炎实验研究

取SD大鼠，随机分为空白对照组、模型对照组、多糖低剂量组、多糖高剂量组，每组10只大鼠。取70mg兔IgG溶于10ml生理盐水中，与60ml不完全佐剂混匀，制成乳剂，除空白对照组外，每只大鼠给予1ml，多点皮下注射为预免疫。预免疫后第7天和第8天，尾静脉注射稀释一倍的自制的肾毒血清1mL/只，连续注射2天为致病免疫。致病免疫后每天检测尿蛋白，当尿蛋白呈阳性之后，空白对照组、模型对照组给予生理盐水，多糖低剂量组、高剂量组分别给予车前子多糖，剂量见表4。每日一次，均连续给药4周。实验室条件下检测尿蛋白。实验结果见表4.

表4：车前子多糖对大鼠肾炎的治疗作用

注：△△表示与空白组比较，P＜0.01；P＜0.05；**表示与模型对照组比较，P＜0.01

实验结果：模型组与空白对照组比较，均具有极显著差异(P＜0.01)，表明造模成功。车前子多糖低剂量、高剂量组与模型组比较24h尿蛋白具有显著差异(P＜0.01)，表明车前子多糖对肾毒血清型肾小球肾炎大鼠具有治疗作用，呈量效关系。

实验例5车前子多糖对大鼠淋巴性水肿的实验研究

取雄性Wister大鼠，体重180-220g，随机分为模型组、阳性对照组(地塞米松)、车前子多糖高剂量(440mg/kg)和车前子多糖低剂量组(110mg/kg)。将大鼠异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，于股中部将皮肤连同皮下组织及肌表筋膜环行切除0.5cm宽皮肤，解剖分离出股血管神经束避免结扎损伤，将肌肉组织与股骨干分离，用7号丝线将肌组织连同收集淋巴管结扎，阻断远侧端淋巴循环。术后立即给药，给药剂量见表5。均灌胃给药，每天2次，术后96h处死，用微型电锯平膝关节离断，用精密电子称测量离体的正常侧和手术侧后肢重量。

实验结果见表5。

表5：车前子多糖对大鼠急性淋巴水肿的治疗作用(n＝10)

注：与模型组比较^＊＊p＜0.01

比率＝(g)水肿侧肢重-正常侧肢重(g)/正常侧肢重(g)

实验结果：阳性对照组与模型组比较，肿胀比率降低，且具有极显著差异(P＜0.01)。车前子多糖低剂量、高剂量组与模型组比较肿胀比率降低，具有极显著差异(P＜0.01)，与阳性对照组比较无显著性差异。表明车前子多糖对大鼠急性淋巴水肿有治疗作用。

实验例6车前子多糖治疗大鼠眼葡萄膜炎的实验研究

取SD大鼠随机分成4组：模型组、地塞米松组、车前子多糖低剂量组、车前子多糖高剂量组。将各组实验大鼠制成内毒素诱导的葡萄膜炎模型：用无菌生理盐水稀释内毒素脂多糖(LPS)为2μg/ml，将50μl分别注射于大鼠的后足底部。注射LPS后立即给药。空白组给予生理盐水，其他组剂量见表6。均腹腔注射给药，每日1次，连续给药7天后，从大鼠角膜边缘后3mm抽出房水立即送检，检测房水白细胞及蛋白含量。实验结果见表6。

表6：大鼠房水中白细胞、蛋白比较结果

注：各组与模型组在相同时间比较^＊＊p＜0.01

实验结果：模型组白细胞、蛋白含量明显升高，表明大鼠眼葡萄膜炎造模成功。多糖低剂量组和高剂量组均明显降低炎性所致的白细胞、蛋白的含量，高剂量组优于低剂量组，说明车前子多糖具有抗葡萄膜炎作用。

Claims (6)

1.一种车前子多糖提取物的制备方法，其特征在于：所述车前子多糖提取物中总多糖的含量占提取物重量百分比的72％以上。

2.一种车前子多糖提取物的制备方法，其特征在于：车前子原料药材脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的车前子多糖提取物。

3.一种权利要求1、2所述的车前子多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将车前子用高浓度乙醇回流除去脂溶性杂质；

(2)残渣加水回流提取，滤液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；

(3)沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；

(4)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，透析；

(5)透析液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得多糖沉淀；

(6)多糖沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤；

(7)洗涤后的沉淀用蒸馏水复溶，采用弱酸弱碱型阴、阳离子交换树脂串联法脱去多糖中的色素和蛋白质，即得车前子多糖提取物。

4.按照权利要求2、3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中将车前子用6～12倍重量的80～95％乙醇回流脱脂2～3次，每次回流2～3h；步骤(2)中将残渣加6～12倍重量的蒸馏水回流提取2～3次，每次回流提取2～3h，将滤液浓缩至药材0.2～1.0体积，加入80～95％乙醇醇沉，离心得沉淀；步骤(3)、(6)中将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇，丙酮分别洗涤；步骤(4)中的沉淀以0.5～2倍重量的蒸馏水复溶，以分子量大小为3.0×10³-1.2×10⁴的透析袋透析24～72h。

5.按照权利要求1、2、3所述的车前子多糖提取物，具有免疫抑制活性，可以用作制备各种剂型的免疫抑制剂或作为制备其他免疫抑制药物的原料药，用于治疗与免疫炎性损伤相关的疾病：肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、水肿、以及眼葡萄膜炎、角膜基质炎、角膜移植排异反应等眼部疾病的医药用途。

6.按照权利要求1、2、5所述的车前子多糖提取物，其特征在于，所述的车前子包括：车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥成熟种子。