CN102123596B

CN102123596B - 控制植物病原体的新微生物

Info

Publication number: CN102123596B
Application number: CN200880126797.2A
Authority: CN
Inventors: J·A·克尔
Original assignee: AGRICULTURAL RESEARCH FOUNDATION
Current assignee: Wageningen Research Foundation
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CO6280445A2; PH12014501182B1; US8404254B2; BRPI0820858A2; PL2230918T3; EP2070417A1; WO2009078710A1; CL2008003723A1; US20130164320A1; CN102123596A; CR11487A; US20100291039A1; HUE025305T2; AR069766A1; EP2230918B1; US9340841B2; ZA201004135B; NZ586067A; PH12014501182A1; ES2539287T3

Abstract

本发明涉及通过用芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)的分离株处理植物以控制植物的叶、果实和穗上由病原体所引起的疾病，如苹果黑星病(苹果黑星菌(Venturia inaequalis))。所述处理在预防和治疗真菌感染中均有效。

Description

控制植物病原体的新微生物

发明领域

本发明涉及植物病原体控制领域，特别是在叶、果实或穗上，更特别在果实作物中，如苹果，以及特别涉及控制真菌性叶疾病苹果黑星病(苹果黑星菌(Venturia inaequalis))。

发明背景

苹果黑星病在苹果生长区有着主要的经济学重要性。如果不控制，该疾病在春季月份期间潮湿阴冷天气时可以引起广泛损失(70％或更大)。损失直接源自果实或花梗感染，或者间接来自重复脱叶，其可以降低树木生长和产量。

苹果黑星病(见图1)可以在叶、叶柄、花、萼片、果实、花梗上观察到，以及较低频率地在幼枝和芽鳞上观察到。第一个病斑经常在春季随着叶的发出以及暴露于感染而在叶的下表面上发现。随后，随着叶伸展，两个表面均暴露而可以被感染。新生病斑(Young lesions)是柔滑棕色(velvetybrown)至橄榄绿并具有羽毛状不清晰边缘。随着时间进行，该边缘变得清晰，但是如果若干病斑接合则它们可以是模糊的。随着受感染叶老化，相邻于病斑的组织变厚，并且叶表面变形。当感染为数众多时，幼叶可变得卷曲、萎缩和扭曲。所述病斑可在叶上下表面保持整个生长季；下面的细胞偶尔地变成棕色并死亡，从而棕色病斑在两个表面均可见。每片叶的病斑数可以从一或两个至100个以上。术语“片状黑星(sheet scab)”经常用于指整个表面均被斑点(scab)覆盖的叶。具有片状黑星的幼叶经常皱缩并从树上落下。叶柄和花梗的感染分别导致叶和果实未成熟脱落。在晚夏或早秋，病斑可以显得发白，这是由于在病斑表面上的次生真菌生长所致。

幼果实上的病斑显得与叶上那些类似，但是随着受感染果实增大，该病斑变成棕色并木栓质化(corky)。该季节早期的感染可以引起果实发育不均匀，因为未感染部分持续生长。然后果皮和果肉中出现裂缝，或者果实可以变形。整个果实表面易受感染，但是该季节早期的感染通常在萼端附近成簇。发生在晚夏或早秋的果实感染可能不是可见的，直至果实被储存。这种症状称为″针点(pin-point)″斑点，其具有大致圆形的黑色病斑，直径范围为0.004至0.16英寸(0.1-4mm)。

尽管在纽约的研究显示黑星病真菌(scab fungus)可以在树中作为芽鳞上的分生孢子而过冬，该病原体一般在果园地面上的叶和果实中过冬。子囊孢子是初次接种体的主要来源并且在假子囊果中产生，所述假子囊果在冬天期间于叶中发育。在大多数地点的典型年份中，最早成熟的子囊孢子能在大约芽裂时或其后不久引起感染。子囊孢子在5-9周的时间段内持续成熟并被排出(discharge)，其中峰值排出是在粉红色至花瓣落下的物候阶段。发生感染所需时间长度依赖于叶上连续湿润的小时数及湿润期间的温度。幼叶保持易感5至8天，但是它们的下表面可在晚夏被感染。对于果实，感染所需湿润期的持续时间随果实年龄而增加，其保持易感直至收获。当真菌在叶或果实中建立之后，分生孢子在病斑表面形成并且成为该季节剩余时间次生接种体的来源。分生孢子通过溅洒的雨和风而散布于发育中的叶和果实。分生孢子感染的若干次生循环可在生长季期间发生，其依赖于感染期频率和宿主组织的易感性。

苹果黑星病的管理防治是多方面的，有抗性栽培种、环境卫生和化学品，其全都根据所使用的果园系统及栽培者的目的而以某种程度来使用。

大多数主要苹果栽培种易感于所述真菌，尽管略有变化。已经发布了超过25个黑星病抗性栽培种，包括Prima、Priscilla、Jonafree、Redfree、Liberty、Freedom、Goldrush和Pristine。大多数适应于美国较北方的苹果生长区。所有黑星病抗性栽培种对其它早季疾病的易感性是变化的；并且所有均易感于夏季疾病。若干最近发布的未针对黑星病抗性进行特异性育种的苹果栽培种也显示不同水平的黑星病易感性。

对过冬苹果叶上假子囊果形成的预防将可能会消除作为苹果生产严重威胁的黑星病。不幸的是，假子囊果的完全消除在果园条件下用现有方法是不可能的。

苹果黑星病主要用杀真菌剂喷雾来控制。可以使用具有不同作用模式的各种杀真菌剂喷雾。何时及怎样使用依赖于其作用模式。保护性杀真菌剂阻止孢子萌发或穿透叶组织。为了有效，必须在感染发生之前将其应用于易感组织表面。感染的发生可以用精确天气预报而预测。保护性杀真菌剂通常以7-10天间隔应用或者根据预期感染时间而进行应用。

感染后杀真菌剂控制叶和果实内部的黑星病真菌。这些化学品可以穿透植物组织以消除或者抑制病斑发展。这些杀真菌剂停止感染的能力限于几个小时或者多至几天(取决于具体杀真菌剂)，并且其作用经常根据感染后最初24-48小时期间的温度而变化。一些杀真菌剂甚至在迟至潜伏期(感染和出现症状之间的时间)也可以抑制真菌。黑星病病斑出现后的根除通常不会发生，但是可以以某些杀真菌剂的适当比率和时机而实现。用于管理防治黑星病的杀真菌剂的选择基于若干因素，包括必须在该时间被控制的其它疾病的完整谱、黑星病真菌对所选择化学品抗性的潜力、特定果园中该疾病的历史、果实的最终市场及其它社会和经济因素。良好园艺实践，如适当地点的选择、树木间隔及年度修剪，通过提高喷雾覆盖范围及降低潮湿期长度而促进更好的化学控制。苹果黑星病的治疗或预防中使用的化学杀真菌剂包括代森锰(maneb)、代森锰锌(mancozeb)、克菌丹(captan)、嘧霉胺(pyrimethanil)和对甲抑菌灵(tolylfluanide)。

因此对于有效控制苹果黑星病，以及环境友好并对人类和/或动物无毒的天然杀真菌剂仍然是有需要的。

发明概述

本发明人发现了两株新的芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)分离株，即芽枝状枝孢菌H39，2007年12月13日保藏在荷兰Baarn的荷兰真菌保藏所(Centraal Bureau Schimmelcultures，Baarn，The Netherlands)，保藏号CBS 122244，及芽枝状枝孢菌R406，2007年12月13日保藏在荷兰Baarn的荷兰真菌保藏所，保藏号CBS 122243。所述分离株可在用来控制叶、果实和穗的植物病原体的组合物中使用。此组合物优选用于这样的疾病，其中所述植物病原体选自由如下所组成的组：苹果黑星病(苹果黑星菌)，梨黑星病(梨黑星菌(Venturia pirina))，叶斑病(Blumeriella jaapi)，玫瑰黑斑病(玫瑰双壳菌(Diplocarpon rosae)/蔷薇盘二孢菌(Marssonina rosae))，褐斑病(囊状匍柄霉菌(Stemphylium vesicarium))，白粉病(苹果白粉病柄球菌(Podosphaera leucotricha)/蔷薇单丝壳菌(Sphaerotheca pannosa))，秋海棠霉病(秋海棠叉丝壳菌(Microsphaera begoniae))，草莓白粉病(Sphaerothecamacularis)，黑点煤斑病(仁果粘壳孢菌(Gloeodes pomigena))，蝇粪病(Zygophalia jamaicensis)，桃缩叶病(畸形外囊菌(Taphrina deformans))，褐腐病/短枝溃疡(spur canker)(产果念珠霉菌(Monilia fructigena)，核果链核盘菌(M.laxa))，梨锈病(Gymnosporangium sabinae/欧洲胶锈菌(G.fuscum))，癌肿病(canker)(仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena))，玫瑰黑斑病(玫瑰双壳菌)，玫瑰锈病(小瘤多胞锈菌(Phragmidium tuberculatum)/多胞锈菌(Phragmidium spp.))，各种植物中的葡萄孢菌(Botrytis spp.)，甘蓝中的芸苔生球腔菌(Mycosphaerella brassicicola)，香蕉中的斐济球腔菌(Mycosphaerella fijiensis)，芸苔属(Brassica)、马铃薯和各种其它植物中的链格孢菌(Alternaria spp.)，镰孢菌(Fusarium spp.)，特别在谷类包括玉米中的，马铃薯的蔓延疫霉菌(Phytophthora infestans)及葡萄树中的葡萄生单轴霉菌(Plasmopara viticola)，更优选其中所述真菌叶病原体是苹果黑星病。

另外，在此组合物中，所述枝孢菌(Cladosporium)作为孢子存在，以及进一步包含用于枝孢菌孢子的载体，优选其中所述载体是葡萄糖。或者，该组合物可以包含本发明枝孢菌的提取物。

在另一个实施方案中，本发明包含控制植物中病原体的方法，包括用本发明组合物处理所述植物。优选地，将所述组合物喷雾在植物叶、果实或者穗上。此用于控制病原体的方法包括防止感染和/或减小由所述病原体引起的植物损害。所述方法可用于对抗任何上述病原体，优选对抗苹果黑星病。本发明进一步的实施方案是本发明枝孢菌分离株的应用，或者本发明用于预防或治疗感染植物叶、果实或者穗的病原体的组合物的应用。本发明中还包括本发明的枝孢菌菌株或组合物用于控制植物病原体感染。

附图描述

图1：叶(a)和果实(b)上由苹果黑星菌(Vi)引起的黑星病症状。

图2：在有机管理的果园中每周用芽枝状枝孢菌H39或R406(大约2x10⁶活孢子ml^-1)处理2次的苹果叶上Vi分生孢子的产生。Randwijk 2007。个别处理与对照处理相比在统计学上显著的作用在每个取样日分别用“*”指示；单侧无保护的LSD-检验；(α＝0.05)。N.s.：无显著差异；n.v.：无数值

图3：预测的感染期，喷雾应用芽枝状枝孢菌H39和硫的日期，及取样日期(L：标记新叶；S：取样)。

图4：用芽枝状枝孢菌H39的分生孢子或者硫处理对苹果黑星菌分生孢子产生的作用。具有共同字母的相同取样日期的条杆确实差异显著(LSD-检验；α＝0.05).

图5：用芽枝状枝孢菌H39的分生孢子或者硫处理对黑星病严重性的作用。具有共同字母的条杆确实差异显著(LSD-检验；α＝0.05)。

详细描述

如上所详述，苹果黑星病是对苹果栽培者具有巨大经济影响的疾病。这对于有极少或没有替代化学杀虫剂的有机农场主来控制苹果黑星病尤其如此，特别是现在一些通常使用的制剂由于环境和一般毒性的风险而趋于逐步淘汰。

正在寻找来自植物的提取物形式的替代物，因为植物提取物已被描述为是用于治疗真菌疾病的可能候选，并且因为它们符合有机生长的要求。最近，已记载了对来自丝兰属(Yucca)的提取物的使用(WO 2007/139382)。

然而，在植物提取物之外，天然发生的微生物也可用于控制植物病原体。特别是许多真菌由于其杀生物作用而已知，例如青霉菌(Penicillium)和木霉菌(Trichoderma)。更特别地，还存在对抗植物病原体而特别有用的真菌。在苹果黑星病的情况中，也已发现此类真菌，如球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)(Boudrau，M.A.et al.，1987，Phytopathol.77：1470-1475)，Microsphaeropsis ochracea(Carisse，O.et al.，2000，Phytopathol.90：31-37)，长喙壳菌(Ophiostoma sp.)和茎点霉菌(Phoma sp.)(Ouimet，A.，et al.，1997，Can.J.Bot.75：632-639)。一般综述可见于Burr，T.J.et al.，1996，Biol.Control6：151-157及Fiss，M.et al.，2003，Z.Pflanzenkrankh.Pflanzenschutz，110(6)：513-523。最近，已披露了(Ziedan，E.H.E.，2006，Res.J.Agric.&Biol.Sci.2(6)：262-267)衍生自葡萄树叶圈的芽枝状枝孢菌分离株与苯甲酸一起应用可有效的对抗引起葡萄树霜霉病的真菌葡萄生单轴霉菌。还发现芽枝状枝孢菌的特定分离株可以用于对抗葡萄孢菌和镰孢菌感染(Newhook，F.J.，1957，New Zealand Journal of Science and Technology 23：23-54.Eden et al.，1996，Plant Pathol.45：276-284)。

在本发明中，现已发现芽枝状枝孢菌的两个分离株有效对抗真菌叶病原性疾病如苹果黑星病。这两个分离株是芽枝状枝孢菌H39和芽枝状枝孢菌R406，2007年12月13日保藏于荷兰Baarn的荷兰真菌保藏所，保藏号分别为CBS 122244和CBS 122243。如在本说明书实验部分所示，这两个新分离株对于苹果黑星病发展有明确作用，而芽枝状枝孢菌的其它分离株没有任何作用。

芽枝状枝孢菌(Fresen.)de Vries属于半知真菌(Fungi imperfecti)群，并且其生长的特征在于当在马铃薯-右旋糖琼脂上于20℃生长7天时产生直径约3cm的菌落。芽枝状枝孢菌的菌落是弥散的，橄榄绿或者橄榄褐色(oliviceous brow)，柔滑(velvety)；倒置在麦芽琼脂上绿黑色。分生孢子梗是菌丝粗大的和菌丝细小的，有时长达350μ，但是一般短得多，2-6μ厚，浅至柔和橄榄褐色，平滑或者疣状。分枝分生孢子是0-1分隔的，长达30μ，厚2-5μ，平滑或者偶尔微小疣状的。分生孢子在长分支链中形成，大多数0-分隔，椭圆体或者柠檬状，3-11x2-5(大多数3-7x2-4)μ，浅橄榄褐色，最常见平滑，但是一些菌株中是疣状的(Ellis，M.B.，2001，DematiaceousHyphomycetes)。

据报道一种代谢物，枝孢菌素，起抗真菌作用。此枝孢菌素已被显示出具有抗生素性质(Scott，P.M.et al.，1971，J.Antibiotics 24：747-755)。但是，如上述讨论，在我们的实验中发现不是所有芽枝状枝孢菌分离株均具有对苹果黑星病感染的抑制作用。显然，或者枝孢菌素对抗苹果黑星菌是无功能的，或者，更可能的是该真菌的分离株在其枝孢菌素表达和分泌的表型中有差异。可能在H39和R406对苹果黑星菌及其它植物病原体的拮抗作用中也涉及其它作用模式的机制。

枝孢菌是叶表面常见的附生于植物的群落建立者，经常以高密度被发现(Dickinson，1981)。也报道枝孢菌附生于植物的群落建立是在苹果叶(Fisset al，2000)和果实上(Teixido et al.，1999)。枝孢菌这种附生于植物的种群可以有助于天然发生的内在生物控制。在这种情况中，保护生物控制(Eilenberget al.，2001)通过避免对非目标种群具有副作用的杀真菌剂而保护这种有益种群(Teixido et al.，1999；(Walter et al.，2007)或者甚至选择性刺激这种天然发生的有益种群例如通过应用特定的营养素从而可有助于黑星病的预防。

如实施例中所述，本发明的两个分离株显示出控制苹果黑星病的明确作用。另外也提出了不仅苹果黑星病，还有叶、果实或穗的任何真菌植物病原体均可被所述分离株控制。所述真菌叶病原体选自如下所组成的组：苹果黑星病(苹果黑星菌)，梨黑星病(梨黑星菌)，叶斑病(Blumeriella jaapi)，玫瑰黑斑病(玫瑰双壳菌/蔷薇盘二孢菌)，褐斑病(囊状匍柄霉菌)，各种植物如草莓、玫瑰和苹果的白粉病，黑点煤斑病(仁果粘壳孢菌)，蝇粪病(Zygophalia jamaicensis)，桃缩叶病(畸形外囊菌)，褐腐病/短枝溃疡(产果念珠霉菌，核果链核盘菌)，梨锈病(Gymnosporangium sabinae/欧洲胶锈菌)，癌肿病(仁果干癌丛赤壳菌)，玫瑰黑斑病(玫瑰双壳菌)，玫瑰锈病(小瘤多胞锈菌/多胞锈菌)，各种植物中的葡萄孢菌，甘蓝中的芸苔生球腔菌，香蕉中的斐济球腔菌，芸苔属、马铃薯和各种其它植物中的链格孢菌，特别是在谷类包括玉米中的镰孢菌，马铃薯的蔓延疫霉菌和葡萄树中的葡萄生单轴霉菌，优选其中所述真菌叶病原体是苹果黑星病。

在H39情况中看起来该真菌的培养和配制方式对抑制作用有显著影响。在燕麦粉琼脂上产生的芽枝状枝孢菌H39的分生孢子在果园条件下无效，但是在发酵罐中燕麦上产生的那些持续显示中等效力。显微镜观察显示在发酵罐中燕麦上产生的分生孢子比在燕麦粉琼脂上产生的那些更大。生长培养基对拮抗物孢子质量的作用导致在环境应激条件下更好的表现，这已在若干其它抗病原体真菌中得到证实，例如在低a_w-修饰培养基上产生的清酒假丝酵母菌(Candida sake)细胞(Teixido et al.，1999)。导入真菌在苹果叶上的群落建立依赖于导入物种的生物学(Kinkel et al.，1989)。在他们的案例研究中，与出芽短梗霉菌(A.pullulans)种群相反，导入的球毛壳菌种群在几天内显著降低。在下述实验中，抑制组合物以3-4天间隔应用以保证在叶上的高种群水平。但是，芽枝状枝孢菌种群动力学的最初结果表明在应用H39之后，此种群增加，并且这种处理作用甚至在几周后仍发现(见实施例2)。

真菌的配制方式对于应用于植物的组合物中所含有的真菌孢子的生存力很重要。看起来用葡萄糖作为枝孢菌孢子载体的配制方式比未经配制的真菌表现更好。

或者，本发明的抗真菌组合物可以含有本发明的一或两个枝孢菌分离株的提取物。该两个分离株的提取物可以按照其它枝孢菌提取物的文献所述来获得，并且本领域技术人员可以轻易地获得(参见例如Ding，L.et al.，2008，Current Microbiol.，56：229-235)。

此外，所述组合物可以含有喷雾溶液中常用的另外的化合物，如防腐剂、表面活性化合物、湿润剂等。组合物中还可以进一步包括抗真菌化合物或生物体以增强抑制作用。在这种情况中，可以使用较低水平的传统化学杀真菌剂，由此使得杀真菌剂的量获得所期望的降低。如上所述，化学杀真菌剂降低植物病原体真菌的生长，并由此使得枝孢菌实现其作用的机会延长。因此提出，本发明分离株与适合的化学杀真菌剂的组合将协同抑制真菌叶病原体，由此超出了各个作用的简单加合。本发明的分离株与任何其它微生物真菌叶病原体拮抗物的组合也可用于本发明。

本发明另一实施方案是控制叶、果实和穗上真菌病原体的方法，包括用本发明组合物处理所述植物。

在这种方法中，植物在被植物叶病原体感染之前或之后用本发明组合物进行喷雾。感染之前喷雾将可用于预防感染。尽管，如果分离株的孢子不是完全有活性的，这种过敏性喷雾应定期重复进行。如果孢子有足够活性，则枝孢菌分离株将能够在植物的叶圈中生长，由此通过预防感染及减少病原体孢子形成而提供持久保护，因此而减缓流行病。另外，所述枝孢菌分离株会减少过冬苹果叶中子囊孢子产生及减少其它植物病原体残余物中孢子的子囊孢子产生，从而导致接下来季节中较少的疾病。

一旦发生感染，喷雾应定期进行以有效控制该疾病。

用本发明组合物进行的处理即可以在收获前进行，即当果实仍在植物上时，也可以在收获后进行。实验部分显示收获后处理也能有效对抗真菌感染。

本发明另一实施方案是本发明的枝孢菌菌株或者本发明的组合物在预防或治疗真菌叶病原体感染中的应用。

本发明另一个实施方案是上述枝孢菌菌株或者本发明的组合物用于控制真菌叶病原体感染。

实施例

实施例1体外及田间试验2006

材料和方法

候选拮抗物收集

2004年9月从荷兰、比利时以及德国西北部和中部的216处地点收集黑星病感染的苹果叶。取样地点由GPS记录。大多数样品由10-50片叶子组成，源自老的标准枝条(old standard tress)或者没有任何种植管理的废弃果园。从每个样品中，将具有形成孢子的苹果黑星病菌菌落的绿叶在保湿室中于20℃温育3天。之后，将苹果黑星病菌菌落以10-60倍放大进行视觉观察不同于苹果黑星菌的真菌发育。用无菌针从菌落的地上部分分离真菌菌丝体或孢子并转移至燕麦粉琼脂(20g燕麦粉、15g琼脂、1000ml自来水)和V8琼脂(200ml V8汁、3g CaCO₃、20g琼脂、1000ml自来水)，二者均含有100mg l^-1链霉素和15mg l^-1四环素。从发育中的菌落制备纯培养物。

候选拮抗物的预筛选

使用快速通量系统首先检查候选拮抗物的潜在风险及开发生物控制产品的经济可行性。弃用属于曲霉菌属、青霉菌属或镰孢菌属的真菌，因为这些属中各种物种产生真菌毒素的潜力。将菌丝真菌的其余分离株在培养皿中燕麦粉琼脂上于18℃培养21天，并且每天12小时不可见光；将酵母在基础酵母琼脂(10g细菌蛋白胨、1g酵母提取物、20g葡萄糖、20g琼脂、1000ml自来水)上于18℃培养5天。对于每种分离株，在用含有0.01％Tween80的无菌自来水制备悬液后，用血球计辅助确定每个平板孢子或酵母细胞的产生。每个平板产生少于1x10⁵个孢子或酵母细胞的分离株被丢弃。将10μl所述悬液一式二份铺板于含有1.5ml麦芽琼脂(1g麦芽提取物、15g琼脂、1000ml自来水)直径16mm的无菌孔中。将具有经接种孔的不同平板在5、18和36℃于黑暗中温育14天。将另一具有含麦芽琼脂的孔的平板在18℃温育14天，所述麦芽琼脂通过加入KCl₂调节至大约-10和-7MPa。检查孔的真菌生长，并丢弃在36℃产生菌落的真菌及在5℃或者在-10或-7MPa不产生菌落的真菌。将其余分离株在马铃薯右旋糖琼脂上(Oxoid，39g，1000ml自来水)于4℃储存备用。

真菌接种体的产生

苹果黑星菌单孢子分离株MB 363B的分生孢子得自M.Bengtsson，Royal Veterinary and Agricultural University，Frederiksberg C，Denmark，将其根据Williams的方法(1976)产生。具有40ml马铃薯右旋糖培养液(24g l^-1)的Duran培养瓶(500ml)，瓶内表面上铺有大小为10x25cm的干酪布纱布(wick)，其下部接触培养基，将所述培养瓶高压灭菌并用250μl苹果黑星菌菌丝体片段悬液接种，该悬液通过用无菌水将在马铃薯右旋糖琼脂上生长的真菌培养物淹没并轻轻用无菌橡胶抹刀摩擦而制备。将经过接种的瓶在18℃于黑暗中温育。在最初4天，将瓶以水平姿态温育，从而使大部分纱布被培养液所覆盖，之后将培养瓶以直立姿态温育。在第2、7和11天小心地转动瓶以将具有生长中菌丝体的培养液分布在整个纱布表面上。14天后，将营养培养液倒出，并加入200ml无菌自来水，用手充分摇动瓶几分钟。将所得分生孢子悬液通过具有200μm筛孔(mesh)的无菌尼龙网过滤，并以5800g在6℃离心30分钟。将具有分生孢子的沉淀重悬于自来水中；用血球计辅助确定分生孢子浓度并通过加入无菌自来水将其调节至5x10⁵个孢子ml^-1。将悬液储存在-18℃备用。产量大约为每瓶3x10⁶个分生孢子。

对于筛选实验，将菌丝真菌的候选分离株在燕麦粉琼脂上于18℃生长28天，并且每天12小时不可见光；将酵母在基础酵母琼脂上于18℃生长5天。孢子或酵母细胞的悬液如下制备：用含有0.01％Tween 80的无菌自来水将培养物淹没，轻轻用无菌橡胶抹刀摩擦，并通过具有200μm筛孔的无菌尼龙网过滤。用血球计辅助确定悬液浓度，并通过加入含有0.01％Tween80的无菌自来水将浓度调节至1x10⁶个孢子或细胞ml^-1。

为在果园中进行应用，以相同方式产生真菌，但是将浓度调节至2x10⁶孢子ml^-1。2个分离株的分生孢子也在发酵罐中产生，干燥并配制成可湿性粉剂并在5℃储存。经干燥的分生孢子的生存力在开始田间实验之前在琼脂上确定。将分生孢子悬液的浓度调节至2x10⁶活分生孢子ml^-1。应用到田间的悬液中孢子的生存力总是通过将悬液喷雾在补加了15mg l^-1四环素和100mg l^-1氯霉素的麦芽提取物琼脂(每升1g麦芽提取物)上来进行再次检查，并在20℃温育24小时后评估萌发孢子的百分比。

幼苗测验

将苹果栽培种Golden Delicious的种子(G.J.Steingaesser & Comp.GmbH，Miltenberg，Germany)播种在潮湿沙土中并在4℃于黑暗中进行层积(stratified)6周。之后，使种子进一步在潮湿沙土中于室温和日光下生长。大约14天后，将幼苗移植到盆装土壤中，每盆(6cm见方，8cm高)1个幼苗。使幼苗以18℃、16小时光照和12℃、8小时黑暗的循环生长28天。用于实验中的植物具有至少4片完全展开的叶子。

将幼苗用苹果黑星菌分生孢子悬液(1x10⁵ml^-1)喷雾直至流出(run-off)并将其置于保湿室中，该保湿室由透明塑料盖密封的塑料盘组成。在15℃具漫射光温育2天后，将盖子从盘移除，并将幼苗进一步在85％RH、15℃及每天16小时光照条件下温育3或4天。之后，将经过苹果黑星菌接种的幼苗用上述所找到的分离株悬液或者作为对照的含有0.01％Tween 80的水进行喷雾。每样处理的每份重复中使用2个幼苗。将有2个经接种幼苗的组置于模块设计(block design)中的聚乙烯棚内，该模块设计具有6个模块(重复)及模块内完全随机化。避免与相邻植物叶或聚乙烯接触。使幼苗在15℃生长9-12天，每天16小时138μEs^-1m^-2光照。

从每个重复的两个幼苗上小心地取下最低的5片真叶(实验1-5)或者在实验开始时最幼的刚刚展开的叶(用金属环标记；“幼叶”)及3片仅次的较老叶(实验6-14；“老叶”)。将叶的每个重复组合中的叶汇集起来，放入Duran瓶中(100ml)，对于含有2片最幼叶的样品所述Duran瓶含有15ml具有0.01％Tween 80的自来水，而对于含有10片(实验1-5)或者6片(实验6-14)叶的样品所述Duran瓶含有30ml。用摇床以700OCS min^-1摇动瓶。用血球计辅助确定每个悬液中苹果黑星菌分生孢子的浓度。叶的每个重复组中叶表面用面积计量仪(Li-COR Biosciences，model 3100，Lincoln，U.S.A.)测量。

果园测验

在荷兰Randwijk有机管理的果园内的几排var.Jonagold在2006年春天和夏天进行了修剪，从而使树木长出新枝，所述新枝上具有高度易感于苹果黑星菌的幼叶。根据树木发育和生长条件，在一组树木用于实验前大约3-5周对树木进行修剪。树上大部分幼果实也被移除以刺激新枝发育。用于早夏实验(实验1-4)中的树木在2006年未进行黑星病控制处理。用于7月中之后晚期实验的树木用有机果园在早季常用的硫磺方案处理以减缓黑星病流行，但是在实验前至少3周和实验过程中保持未被处理。

进行了一系列8个实验，每个实验基于不同树木组。对于每个实验，根据每棵树新产生枝的数目，选择2-6棵树用于6个模块(重复)的每一个。在每个模块内，进行7个处理。对于每个处理(每个重复)，使用在同一分枝上产生的3个枝。枝用有色金属环标记，从而使得在第一次处理当天完全展开的2个最幼叶后来能够与该枝的其它叶区分开。处理由以下组成：将作为对照的含有0.01％Tween 80的自来水或者拮抗物芽枝状枝孢菌H39新产生孢子的悬液进行喷雾。用发酵罐所产生的孢子进行独立处理，所述孢子被配制成干粉并重悬于含有0.01％TWEEN 80的自来水中。用压缩式气动背负式喷雾器在250kPa进行喷雾直至流出。在2006年6月22日至9月28日期间进行了不同实验。对于在苹果黑星菌感染期之后1-3天由第一次处理而开始的实验已根据Mills表格基于叶湿润期和温度而进行了预测。8个实验的开始日期为2006年6月22日，6月29日，7月6日，7月31日，8月3日，8月7日，8月21日，8月24日，和8月24日。在实验8中，将预期的感染期与第一次应用之间的时间延长至10天，但是叶在预期的感染期后1-3天已经进行了标记，与其它实验中一样。在所有实验中，后续处理以3-4天间隔来进行。在前3个实验中，在第一次处理后18天(因此是在预期的感染期后19-21天)对叶进行了取样。在实验4-7中，在第一次处理后24-25天(因此是在预期的感染期后25-28天)对叶进行取样以增加苹果黑星菌孢子形成的时间及可能的拮抗相互作用的时间。在实验8中，在第一次应用后24天并因而在预期的感染期后34天对叶进行取样。

在每个实验中，对属于同一个重复的3个枝，将在实验开始时完全展开的2片最幼叶与2片仅次的更幼的叶(在实验期间展开)一起进行汇集，从而使样品由12片叶组成(“幼叶”)。从同一枝，根据枝大小还取样了仅次的较老的3-12片叶并汇集起来，从而使样品由9-36片叶组成(“老叶”)。在不同实验中取样的老叶的平均数是21.8。将幼叶样品置于250ml玻璃瓶中。在2小时内，加入100-150ml(根据叶的数量)含有0.01％Tween 80的自来水，并将瓶用摇床以700OCS min^-1摇动10分钟。老叶样品以相同方式处理，其使用在摇动前加入150-350ml(根据叶的数目)自来水的1000ml塑料瓶。从获得的悬液中，将6ml子样品储存在-18℃。对于每个悬液的苹果黑星菌分生孢子浓度用血球计来辅助确定。用面积计量仪测量每个样品的所有叶的叶表面。

统计学

计算每个重复的cm^-2叶所产生的苹果黑星菌分生孢子数。如果未检测到分生孢子，则设定检测极限为分生孢子悬液中计数1个分生孢子，导致各种实验的平均检测极限为大约100个分生孢子cm^-2，例如根据各个重复的叶表面，对于在控制条件下进行的前3个实验，其范围为74-212cm^-2之间。

将2个不同叶年龄所获得的数据进行自然对数转换，并用ANOVA对每个叶龄单独分析。在控制条件下进行的实验用下述方法单独分析，即用未保护LSD-检验(α＝0.05)来比较对照处理和个别的拮抗物处理的平均值。由于ANOVA的P-值经常大于P＝0.05，未进行拮抗物处理之间进一步的多重比较(Ott and Longnecker，2001)。对于田间实验，将针对2个不同叶龄所获得的经自然对数转换的数据用模块设计经ANOVA来对每个叶龄进行单独分析，其中个别实验被认为是主模块，而各处理在每个实验的6个重复模块中是随机化的。指示出了统计学上显著的处理作用(保护LSD-检验；α＝0.05)。

结果

从苹果黑星菌菌落分离真菌及预筛选

不同于苹果黑星菌的真菌的生长经常在病原体正形成孢子的菌落中观察到，并获得了几百个真菌分离株。根据菌落外观分组分离株，并且在预筛选中总共对148个代表各种菌落类型的分离株进行了测试。148个分离株中的131个在每个平板产生超过1x10⁵个孢子或酵母细胞并且在不同温度及水势下生长。从这剩余的131个分离株中，所有均能够在5℃生长；16个在-10MP不生长。14个在36℃生长且其中一个分离株在WP＝-10MPa不生长。因为许多这类具有优选特征组合的分离株属于枝孢菌，所以仅在幼苗上测试了这组中随机选择的分离株的亚集。总共102个分离株中的63个进一步在苹果幼苗的生物测验中进行了测试。

幼苗测试

在幼苗上进行了14个实验。在前5个实验的对照处理中，该幼苗的5片最幼叶上产生的分生孢子是平均3596个分生孢子cm^-2，并且在不同实验中范围为1339和10509个分生孢子cm^-2(逆转换(backtransformed)值)之间。由于分生孢子的产生在最幼叶上很高，而在老叶上少得多，所以决定在后续实验中对此类叶单独进行取样。在实验6-14中，幼叶上的平均分生孢子接合为2896个分生孢子cm^-2并且对于不同实验其范围介于728和6186个分生孢子cm^-2(逆转换值)之间。对于老叶，平均分生孢子接合是453个分生孢子cm^-2并且对于不同实验其范围介于144和1313个分生孢子cm^-2(逆转换值)之间。分生孢子接合中的差异不仅在实验之间很高，而且在试验内重复幼苗组之间也很高。

在幼苗上测试的80个候选分离株的大多数不在统计学上显著降低苹果黑星菌的分生孢子接合。一个分离株，芽枝状枝孢菌H39，引起幼叶或老叶上苹果黑星菌的显著降低，这可在后续独立实验中重复。然而，芽枝状枝孢菌H39这种拮抗物的功效(基于幼叶的逆转换值计算)在测试其的实验中在55-79％之间变化，并且在一些情况中分生孢子接合降低在统计学上不显著(表1)。还有几个分离株在一个实验中显示出强的统计学显著性拮抗作用，但是此作用不能重复。此类分离株属于出芽短梗霉菌、芽枝状枝孢菌、豌豆脚腐病菌(P.pinodella)和枝孢菌。在应用候选分离株后无一例观察到苹果黑星菌分生孢子接合的显著增强。

果园测试2006

在6月22日开始第一个实验之前，果园中苹果黑星病温和发展。在6月和7月上半月，干燥条件伴随白天温度经常超过30℃不利于苹果黑星病进一步发展。之后，下雨及阴冷天气对于苹果黑星病是非常有利的，直至实验结束。

在干燥及温暖条件下进行的前3个实验期间，在水处理的对照样地(plot)中，在幼叶上发现2.1-12.8x1000个分生孢子cm^-2(逆转换值)，在老叶上发现9.5-40.3x1000个分生孢子cm^-2(表2A、B)。在7月中天气变得潮湿和阴冷之后，在实验4中幼叶上发现46.3x1000个分生孢子cm^-2及在来自对照处理的叶上发现9.8x1000个分生孢子cm^-2。在后续实验期间，在实验8中分生孢子数增加到在幼叶上227.3x1000个分生孢子cm^-2和老叶上132.1个分生孢子cm^-2。

对于每个悬液，在田间喷雾的一个琼脂平板上评估了在所述系列实验过程中25个应用日所应用的孢子生存力。枝孢菌H39的生存力是92％(范围为82-99％)。芽枝状枝孢菌H39经配制孢子的生存力在实验开始时是大约47％。当制备孢子悬液用于田间应用时，芽枝状枝孢菌H39经配制的孢子在喷雾悬液中形成由大约5-50个孢子组成的簇，从而不可能精确确定孢子萌发。在11个应用中喷雾的悬液的大多数簇显示了真菌生长。8月10日和8月29日之间应用的孢子簇仅有几个显示了真菌生长。可以推定在实验4期间最后一次处理及实验5和6期间所有处理中，使用了在储存期间丧失其活力的储存的经配制孢子。从8月末起，使用了新的一批配制孢子，其中大多数孢子簇显示了真菌生长。当对每个实验单独分析数据时未发现显著的处理作用。对于整体分析，实验1、5和6被排除，因为在实验1期间没有存活的配制芽枝状枝孢菌H39，而在实验5和6期间生存力低。对于用配制的芽枝状枝孢菌H39进行的处理在幼叶和老叶上均发现了分生孢子数cm^-2的显著降低(表2B)。分生孢子产生平均在幼叶上降低42％，而在老叶上降低38％。这种趋势在低疾病压力下进行的前3个实验期间以及在极高疾病压力下进行的最后2个实验期间均有发现。该分离株未配制的孢子未降低苹果黑星菌的分生孢子接合。当含有很少或甚至没有活分生孢子的芽枝状枝孢菌H39配制物在实验5和6期间被应用时，未发现配制物本身对分生孢子接合具有任何降低作用的趋势(表2A)。

实施例2果园测试2007

材料和方法

真菌接种体

芽枝状枝孢菌H39如实施例1产生。配制的产品含有2.0x10⁹个孢子g^-1，生存力为20％。在实验期间，将配制的H39批次在4℃、黑暗中储存在塑料袋中。悬液通过将经配制的颗粒加入到Tween水(0.01％)中并搅拌而进行制备，无任何进一步预处理。终浓度是1x10⁷个孢子ml^-1，等价于2x10⁶活孢子ml^-1。

芽枝状枝孢菌R406的孢子在培养皿中燕麦粉琼脂(20g燕麦粉、15g琼脂、1000ml自来水)上于20℃、每天12小时不可见光而产生。温育2周后，将孢子悬浮于含有0.01％Tween 80的自来水中，并加到平板中。该悬液经纱布(200μm筛孔)过滤以除去菌丝体细胞，而孢子数用血球计计数。孢子产量是每个琼脂平板(90mm直径)8-30x10⁸个孢子，平均生存力为93％，对不同日期制备的悬液范围为73-97％。应用到田间的悬液中的孢子的生存力总是通过以下方法进行检查：将悬液喷雾到果园中的麦芽提取物琼脂(1g麦芽提取物、15g琼脂、1000ml自来水，补加15mg l^-1四环素和100mg l^-1链霉素)上并在18℃温育24小时后评估萌发孢子的百分率。

果园

实验在荷兰Randwijk有机管理果园内的3排var.Jonagold中进行。实验目的是通过在6月末开始应用拮抗物来控制苹果黑星菌(Vi)的夏季流行。因此，重要的是允许在主要季节(primary season)期间果园中开始轻度至中度流行。应用硫的时机以这样方式预见，即可以发生子囊孢子初次感染但是可以控制流行进展。5月末之后未计划硫磺的应用。2007年主要季节期间的异常天气条件即4周无雨非常不利于Vi子囊孢子的释放和感染。在4月后天气变得更有助后，发展出了轻度苹果黑星病流行直至实验开始。未进行硫处理以降低流行进展。

实验设计、处理及评估

在具有6个模块的设计中进行实验，在3排树的每排中有2个模块。每个模块由4块样地组成，每块样地有4棵树。在样地之间，2棵未处理的树作为缓冲。不同处理随机分配给这些样地。计划用如下处理对每块样地的4棵树进行喷雾，速率为每块样地2升，每周两次：(1)作为对照的补加了Tween 80(0.01％)的自来水；(2)配制的H39悬液(2x10⁶个孢子ml^-1)；(3)配制的R406悬液(2x10⁶个孢子ml^-1)。在6月28日和8月20日之间的16个日期每周进行2次应用，该应用使用具有2m悬臂和一个喷嘴(Birchmeier helico saphir 1.2，2F-0.6；压力250kPa)由压缩空气操作的手持式喷雾器(AZO，Edecon，Ede，The Netherlands)。因为在实验开始时没有配制的R406孢子可用，处理(3)用在实验室新产生的孢子进行每次应用。R406每周应用2次延迟到7月12日开始，从而此真菌只在12个日期应用。因为未产生足够的孢子，因此只有经选择和标记的嫩枝获得了多次喷雾，而非对整棵树处理。

评估

分生孢子产生.分生孢子产生在实验过程期间发育出来的易感幼叶上进行评估，对于作为对照的经Tween-水处理或者经H39的分生孢子悬液处理的叶在3个取样日进行评估，而对R406则在2个取样日进行评估。选择取样日从而使得在预期的感染期间呈现的易感叶组在感染期后大约5周进行取样。基于叶湿润期和温度的Mills表被用于预测感染期。对于每个取样，在每块样地中属于同棵树的一组3个嫩枝上刚刚展开的第二最幼叶在预期的感染期后1-3天被标记。5周后，在标记日刚刚展开的2片叶及在标记后展开的仅次的2片更幼叶被取样，产生由每块样地12片叶组成的样品。将叶样品置于250-ml玻璃瓶中。在2小时内加入100-150ml(根据叶的数量)含有0.01％Tween 80的自来水，并将瓶用摇床(Stuart Scientific SF1，UK)以700 OCS min^-1摇动10分钟。从所获得的悬液，将6ml子样品储存在-18℃，并且每个悬液的Vi分生孢子的浓度后来用血球计辅助确定。用面积计量仪(Li-COR Biosciences，model 3100，Lincoln，U.S.A.)测量每个样品所有叶的叶表面。

取样日是8月6日(叶标记在7月2日)、8月16日(叶标记在7月12日)和8月20日(叶标记在7月16日)。

附生于植物和内生于植物的群落建立.在10月4日从每块样地收集20片经标记的叶，所述叶来自用Tween-水(对照)或H39的孢子悬液处理过的树以及用R406的孢子悬液处理过的嫩枝。所有取样的叶均在6月28日和8月20日期间在树上长出，期间进行了所述的系列喷雾应用。因此可以推定所有叶在幼年发育阶段均获得一或几次孢子应用。

用corkbohrer从每片叶切下一个叶盘(leaf disc)(直径9mm)。将每个样品所得的20个叶盘汇集在含有10ml无菌Tween-水(0.01％)的无菌50ml小瓶中，并将小瓶用摇床以高速(700 OCS min^-1)摇动10分钟。从所得悬液制备系列稀释液(1∶10)并将100μl未稀释和稀释的悬液铺板在2个琼脂平板的每一个上，所述琼脂平板含有麦芽琼脂(10g麦芽提取物、15g琼脂、1000ml自来水)并补加了100mg l^-1链霉素和15mg l^-1四环素。将平板在20℃黑暗中温育，并在4、7和11天后计数枝孢菌、其它菌丝真菌及酵母的菌落。从所述菌落计数计算每个样品cm^-2叶表面的菌落形成单位(CFU)数。

在摇动叶盘除去以附生于植物而存在的真菌后，将所汇集的每个样品20个叶盘进行表面无菌化并在5ml无菌水中用研钵匀浆。为进行表面无菌化，将叶盘浸入96％乙醇，接着在0.5％次氯酸钠中浸没1分钟，随后用无菌水清洗3次。从所得匀浆在无菌水中制备系列稀释液(1∶10)并将100μl未稀释和稀释的悬液铺板在2个麦芽琼脂平板的每一个上，所述平板含有100mg l^-1链霉素和15mg l^-1四环素。如上所述温育平板并评估内生真菌菌落。

统计学

计算每个重复样品的每cm²叶表面产生的Vi分生孢子数。针对两种叶龄，用单侧未保护LSD-检验(α＝0.05)将对照处理经自然对数转换的值分别与个别的拮抗物处理进行比较。经对数转换的每cm²叶表面的CFU数用ANOVA及随后的双侧LSD-检验(α＝0.05)分析。

结果

实验期间经常下雨及适中温度的天气条件对于苹果黑星病是非常有利的。在实验开始时，果园中仅存在轻微症状。在结束时在实验样地中及相邻区域的树叶上观察到重黑星病症状。

对于每个应用日新鲜产生的R406的孢子具有高萌发率，一般在80％以上(表3)。H39配制的孢子在实验第一周萌发20-30％，但是最后4次处理萌发降至4-16％。在第一个喷雾日例外的76％的高孢子萌发值可以由实验差异解释，该实验差异是由于在果园条件下仅喷雾1个平板的小样品量所致。

在8月6日、8月16日和8月20日从经水处理的树木所取样的叶上平均产生77,200(13,900-139,800)、45,300(35,200-55,200)和32,200(8,800-111,800)个分生孢子cm^-2(逆转换的平均值，括号中为6个重复的范围；图2)。重复之间的差异因此是相当高的。在用H39处理的树木的叶上，孢子数在统计学上显著较低，在第一个取样日为24,200个分生孢子cm^-2(降低69％)，在第二个取样日为22,000个分生孢子cm^-2(降低51％)。对于最后一个取样日，H39未观察到处理作用。对于可获得用R406处理的叶的取样日，用R406处理的叶在8月16日的分生孢子计数是24,300个分生孢子cm^-2，导致分生孢子在统计学上显著降低46％。8月20日仅观察到15％的降低，并且计数与对照处理无差异。

未观察到对叶发育或植物毒性症状的处理作用。

接近落叶时，对叶的内生于植物和附生于植物的群落建立进行评估，其是通过将叶洗涤液和表面无菌化的叶匀浆铺板在琼脂上并计数菌落形成单位(CFU)而进行的。枝孢菌内生于植物的群落建立显著更高，而枝孢菌附生于植物的群落建立对于在夏季已用H39处理的叶趋于更高。其他菌丝真菌在经H39处理的叶的内生于和附生于植物的群落建立趋于比未处理叶更低。酵母附生于植物的群落建立在经H39处理叶中显著更低。

实施例3田间试验2005/2006

材料和方法

实验设计和处理

在2005年秋天，将包括芽枝状枝孢菌R406的属于不同物种的25个真菌分离株应用于来自荷兰Randwij有机管理的果园的苹果树叶，并将经过处理的叶置于果园地面直至下一个春天。候选者的选择是基于针对经济可行性和可能风险所进行的预筛选的结果(见实施例1)。分离株R406的孢子在燕麦粉琼脂上产生(在18℃温育28天)。通过用含有0.01％Tween 80的无菌水淹没琼脂上的培养物来制备孢子悬液(每个分离株500ml)。轻轻用橡胶抹刀摩擦以从真菌培养物中移出孢子后，将悬液通过200μm筛孔的无菌尼龙网过滤。用血球计帮助确定悬液浓度并调节至2x10⁶个孢子ml^-1。用加压空气操作的手持式喷雾器进行喷雾应用。10月17日从树上收集延伸枝(extension shoots)的叶以在温室隔间中在控制条件下进行喷雾应用。在摘取叶和将叶再次固定在果园地面上的网中之间的期间，将叶储存在5℃。10月18和19日将叶固定在网中，每个具有40片随机选择的叶。10月20日用孢子悬液或水喷雾具有每个处理的每个重复的叶的4个网，两面大约20ml悬液(或者对照处理中用水)。各含40片叶的两个网指定用于确定苹果黑星菌的潜在子囊孢子产生，另外两个网用于经TaqMan-PCR确定苹果黑星菌种群密度。在应用后，在大约30分钟内再次干燥叶。具有经处理叶的网在10月21日固定在Randwijk有机果园内果园地面上的裸露土壤上。在果园不同排中有6个模块(重复)。

还将每个孢子悬液喷雾在琼脂平板上(1/10麦芽琼脂)。将平板在18℃温育2天，并确定萌发率。R406的孢子具有＞90％的生存力。

评估

2006年1月23、24、25、30和31日分别在果园中收集指定用于经TaqMan-PCR对苹果黑星菌种群密度进行定量的重复1-6的网，小心用自来水清洗以除去附着的土壤并在室温干燥过夜。将每个处理的每个重复的2个网的叶残余物从网中取出，切成1-2cm小片，将5-10g样品冻干并随后在具有1mm目筛(mash sieve)的实验室磨中研磨成粉。粉末化样品储存在-18℃。提取DNA并用物种特异性实时PCR(TaqMan-PCR)对苹果黑星菌DNA进行定量。

在3月20日(模块A)、3月22日(模块B)、3月27日(模块C)、3月29日(模块D)、4月3日(模块E)和4月5日(模块F)，收集果园中的网以在水中通过空气鼓泡提取子囊孢子后定量潜在子囊孢子产生。将每个处理的每个重复的2个网的叶残余物风干(20℃，70％RH，2天)，并确定重量。随后，将每个样品经风干的叶残余物最多7-17g的子样品铺在塑料盘中的湿滤纸上。盘用塑料袋覆盖，并将叶残余物在这些保湿室内于黑暗中、20℃温育7天，随后每天12小时光照在20℃温育14天以使子囊(大部分)成熟。使用不同气候室进行温育，但是属于同一模块的叶总是在相同室中温育。

温育后，将叶残余物转移至根据叶残余物的量含有150-350ml水的1000ml塑料瓶中。将空气(每小时250升)鼓泡通过水而在2小时期间产生大量湍流。之后，将所得悬液过筛(1mm筛孔)以除去叶碎片。该悬液的2个子样品(8ml)储存在-20℃。悬液中的子囊孢子浓度用血球计经显微镜确定。子囊孢子产生表示为(在秋天原始固定在果园地面上的)每80片叶的产量或者每克春天取样日所存在的风干叶残余物的产量。每80片叶的子囊孢子产量是对分解和子囊孢子产生进行处理的可能作用的结果。

统计学

子囊孢子数所获得的数据经对数转换(log₁₀)。所有数据均经ANOVA分析。将对照处理及个别拮抗物处理的平均值用LSD-检验(α＝0.05)进行比较。由于ANOVA的P值经常大于P＝0.05，所以没有进一步进行拮抗物处理之间的多重比较。

结果

通过使用物种特异性引物对和探针的实时PCR(TaqMan-PCR)对在2006年1月末取样的叶残余物中的苹果黑星菌DNA量进行定量。计算了来自80片叶所留下的总残余物中的苹果黑星菌-DNA总量。用芽枝状枝孢菌R406处理的叶残余物与未处理对照相比具有显著更低的苹果黑星菌-DNA(表6)。

在春天叶上产生的子囊孢子数很高，来自对照处理的80片叶的残余物平均为7.5x10⁵(逆转换值)(表7)。对照处理中每克叶残余物产生3.4x10⁴个子囊孢子(表8)。对于用分离株芽枝状枝孢菌R406处理的叶残余物，子囊孢子计数要低大约70％。对照处理和用R406处理之间的这些不同对于80片叶残余物上产生的子囊孢子数及每克叶残余物产生的子囊孢子数均是在统计学上显著的(表7和8)。没有其他用不同候选拮抗物进行的处理是趋于导致子囊孢子降低的。

实施例4在果园条件下芽枝状枝孢菌H39对苹果黑星菌分生孢子产生的作用

目的

在2006和2007年条件下进行的实验中，中试配制为水可分散粒剂(WG)的拮抗物芽枝状枝孢菌H39分生孢子的应用在果园条件下降低苹果黑星病病原体苹果黑星菌的分生孢子产生(见实施例1和2)。2008年进行的实验的目的是在另一个季节中证实这些结果以及对于在苹果黑星菌预期的感染期后应用拮抗物的最佳时机获得最初的深入了解。

H39的分生孢子的产生

为了在果园中应用，在德国PROPHYTA Biologischer PflanzenschutzGmbH的Solid-State Fermentation(SSF)系统中产生芽枝状枝孢菌H39的分生孢子。将所收获的分生孢子配制成水可分散粒剂(WG)。为保持产物质量，将最终产物储存在4℃。干燥的分生孢子的生存力在田间实验开始前在麦芽提取物琼脂上(1g麦芽提取物l^-1)确定。在20℃温育24小时的分生孢子具有比分生孢子最小直径一半要长的芽管则被认为是存活的。

果园测验

实验在荷兰Randwijk的Applied Plant Research的有机管理果园中于8年树龄的cv Jonagold树木上进行。该实验目的是通过应用拮抗物来控制苹果黑星病的夏季流行。因此，重要的是允许在主要季节果园中流行病起始。2008年主要季节的天气条件有利于黑星病发展，而许多黑星病症状在6月初在果园中发现。6月22日一场严重冰雹严重损坏了果园。6月24日和26日，在整个果园及相邻果园中以每100升水140ml的比率应用Topsin-M(a.i.500g甲基硫菌灵l^-1，Certis Europe B.V.，Maarsen，荷兰)(以1000l ha^-1应用)以预防由欧洲果树癌肿病(仁果干癌丛赤壳菌)导致的伤口感染。在实验之前或期间未再进一步进行降低黑星病流行进展的杀真菌处理。在接下来几周中，树木产生大量具有新叶的新枝。将这些新形成的未被冰雹损坏或者未接触杀真菌剂喷雾的叶用于实验中。

将实验安排在具有6个模块的设计中，其中在同一排树中有2个模块。每个模块由3块样地组成，每块有4棵树。在样地之间，2棵未处理的树作为缓冲。下述3种不同处理随机分配给所述样地：(1)未处理的作为对照；(2)经配制的H39分生孢子悬液(2x10⁶个活分生孢子ml^-1；每块样地2升)。以2ml l^-1比率将喷雾添加剂Trifolio S-forte(Trifolio-M GmbH，Lahnau，德国)加入到悬液中以改善叶表面上的喷雾层。在7月22日、7月24日、7月28日、7月31日、8月5日、8月7日、8月11日和8月18日进行每周两次的H39应用。(3)第三种处理由以0.4％(400g/100l水，1000l ha^-1)比率每周应用硫(Thiovit-Jet，Syngenta Crop Protection B.V.，Roosendaal，荷兰；a.i.80％硫磺)所组成。硫处理在7月22日、7月28日、8月5日和8月11日应用。

在6月11日实验开始前，评估每块样地4棵树中每棵树的10个枝上叶中黑星病叶数和每片叶黑星病斑点数。每块样地总共检查227-239片叶。在9月19日，对每块样地177-232片叶上在实验开始后产生的黑星病症状进行评估。疾病严重性(由黑星病症状覆盖的％叶表面)用如下类别进行评价：1：无黑星病；2：1-10％覆盖；3：11-50％覆盖；以及4：51-100％覆盖。用下述公式计算严重性指数：

DS＝(0xN₁+1xN₂+2xN₃+3xN₄)/N_total*100

其中N₁，N₂，N₃和N₄分别是归类于1、2、3和4类的叶的数目，而N_total是每块样地评估的总叶数。

在3个取样日对易感幼叶上在实验期间发展的苹果黑星菌分生孢子产生进行评估。对取样日进行选择从而使得预期的感染期期间存在的易感性叶组在感染期后大约5周被取样。使用基于叶潮湿润期和温度的Mills表来预测感染期。在每块样地中属于同棵树的一组3个嫩枝上的刚刚展开的第二最幼叶在预期的感染期后1-3天被标记。预测感染与第一次应用芽枝状枝孢菌H39之间的期间以及喷雾数和喷雾的保护期对每个取样日均不同(图3)。35天后，在标记日刚刚展开的2片叶及在标记后展开但在实验过程中扩展的2片仅次的更幼叶被取样，产生每块样地12片叶组成的样品。取样日是8月22日(7月18日标记的叶)，8月26日(7月22日标记的叶)和9月4日(8月1日标记的叶)。将所述每个样品的12片叶汇集并置于250ml玻璃瓶中。在2小时内加入100-150ml(根据叶的质量)含有001％Tween 80的自来水，并将瓶用摇床以700 OCS min^-1摇动10分钟。从所获得的悬液中将6ml子样品储存在-18℃。对每个悬液的苹果黑星菌分生孢子的浓度用血球计辅助进行确定。用面积计量仪测量每个样品所有叶的叶表面。

结果和讨论

将2008年春天产生的芽枝状枝孢菌H39的分生孢子根据中试实验方案配制成水可分散粒剂，并储存在5℃，其在实验开始时具有65％生存力。生存力保持稳定直至实验结束。

实验开始前，属于不同处理的样地的叶上黑星病发生率没有不同。在用作对照的样地中平均发生率是81.7％，在后来用H39处理的样地中是84.6％，在后来用硫处理的样地中是84.3％。每片叶的叶斑点数也无统计学不同，因此可以推定在实验开始前不同样地中的黑星病发展是相似的。

在8月22日、8月26日和9月4日从未处理树上取样的叶上平均产生35,242(11,447-74,870)、30,242(18,926-59,497)和32,533(19,698-46,350)个苹果黑星菌分生孢子·cm^-2叶表面(逆转换平均值，在括号中是6个重复的范围)(图4)。在用芽枝状枝孢菌H39处理的树叶上，孢子数在统计学上显著更低，在第一个取样日为11,499个苹果黑星菌分生孢子·cm^-2叶表面(基于逆转换值降低67％)，在第二个取样日为15,139个分生孢子·cm^-2叶表面(降低50％)。对于最后一个取样日，未观察到应用芽枝状枝孢菌H39的显著作用，经处理的叶上有21,163个分生孢子·cm^-2叶表面(降低35％)。应用硫磺导致每cm²叶表面产生的苹果黑星菌分生孢子数在不同取样日降低2％、16％和26％(图4)。用H39最后一次处理后一个月即9月19日对黑星病严重性进行了评估，对照处理是2.2，H39处理的样地在统计学上显著更低，为1.8(图5)。在硫处理的样地中，黑星病严重性是2.0，与其它处理无显著不同。

在果园实验期间，环境条件导致很高的感染期数目，并有利于黑星病发展。冰雹事件后新枝例外地发育也支持了夏季流行。在这种严重疾病压力下，用硫处理经常不足以实现疾病控制，在我们的实验中也发现这一点。用拮抗物H39处理在这种严重条件下降低了苹果黑星菌分生孢子产生，证实了2006年和2007年进行的果园实验结果。最强作用在第一个取样日发现，其中H39处理在预期的感染后开始但是持续直至取样前4天。对于第三个取样日，在预期的感染期之前已用H39进行了多重处理，但是最后一次处理在取样前17天被应用。在这种情况中，苹果黑星菌的分生孢子产生仅降低35％。由于拮抗物的作用可能也依赖于环境因素，环境因素在不同取样日前不同，因此需要更多来自重复的果园实验的数据才能得出拮抗物应用最佳时机的结论。

还首次评估了在用拮抗物H39处理后黑星病严重性。在果园中观察到的在高黑星病水平降低的黑星病严重性证明了芽枝状枝孢菌H39具有控制黑星病流行的高潜力。

实施例5.2007/2008年果园测试：在夏季用芽枝状枝孢菌H39和R406处理对过冬后经处理的叶上的苹果黑星菌子囊孢子产生的作用

目的

夏天用拮抗物芽枝状枝孢菌H39和R406的分生孢子悬液处理苹果叶导致在果园条件下经处理的苹果叶上黑星病真菌苹果黑星菌分生孢子产生降低(见实施例1和2)。

在2007年实验期间在果园中经处理的叶上所进行的另一项评估的目的是研究用该拮抗物在夏季对发育中的幼叶进行这种处理对于过冬后经处理的叶中苹果黑星菌子囊孢子产生的作用。

实验设计.实验在荷兰Randwijk，Applied Plant Research的有机管理果园中进行。该实验目的是评估应用拮抗物以控制苹果黑星病的夏季流行以及降低过冬苹果叶中产生的苹果黑星菌的接种体负荷的潜力。因此，重要的是允许在主要季节果园中开始轻度至中度流行病。2007年主要季节的异常天气条件即4周无雨对于苹果黑星菌子囊孢子的释放和感染非常不利。在4月之后气候变得更有帮助，并且当应用第一次拮抗物悬液时已发展出了轻度苹果黑星病流行。在实验之前或期间未进行降低流行的杀真菌处理。

实验在具有6个模块的设计中的8年龄树cv Jonagold上进行，在同一排树中有2个模块。每个模块由3块样地组成，每块有4棵树。在样地之间，2棵未经处理的树作为缓冲。3种不同处理随机分配给样地。以每块样地2l，每周两次的比率用下述处理来处理树木：(1)作为对照的补加了Tween 80(0.01％)的自来水；和(2)经配制的H39分生孢子悬液(2x10⁶个分生孢子ml^-1)。在6月28日至8月20日之间16个日期每周进行2次应用。(3)第三种处理由多重的芽枝状枝孢菌R406分生孢子悬液的喷雾应用所组成。在7月12日和8月20日之间的12个日期将在每个应用日新鲜产生的分生孢子每周两次应用在每块重复样地的4棵树上。

夏季苹果黑星菌的分生孢子产生.处理对苹果黑星菌的分生孢子产生的作用已作为实施例2进行了报道。

在过冬苹果叶中苹果黑星菌的子囊孢子产生.在2007年7月12日，在每块样地的25个嫩枝上对刚刚展开的次最幼叶进行了标记。在一些样地中，可用的嫩枝较少。在2007年10月4日，对叶进行取样，所述的叶是在标记日刚刚展开的叶，以及仅次的2片在标记后展开更幼叶。根据取样日叶的可用性，在每块样地收集16-65片叶。对每块样地取样的叶进行称重并固定在50x50cm大小的两个铁丝网(15x20mm筛孔)之间，从而使叶互相不接触。将具有叶的网置于Randwijk的有机果园苹果树排内果园地面上裸露的土壤上并用金属钉固定，从而使大部分网表面接触土壤。有6个模块(重复)含有来自不同处理(在夏季应用)的叶的网在模块内随机分配。

2008年2月26日，收集网。将每个重复的两个网的叶残余物汇集，风干(20℃，70％RH，2天)并称重。随后，将每个样品经风干的叶残余物铺在分开的塑料盘(50x30x6cm)中的湿滤纸上。盘用塑料袋覆盖，并在这些保湿室中于黑暗、20℃将叶残余物温育7天，随后每天12小时光照(75μE)在20℃温育14天以使子囊(大部分)成熟。温育后，将叶残余物转移至根据叶残余物的量含有150-350ml水的1000ml塑料瓶中。空气(每小时250升)鼓泡穿过水，在2小时期间产生大量湍流(Heye et al.1981，CanadianJournal of Botany 59，965-968；Philion，1995，Msc Thesis McGill University，Montreal，加拿大)。之后，将所得悬液通过筛(1mm筛孔)以除去叶碎片。将悬液的2个子样品(8ml)储存在-20℃。该悬液中的子囊孢子浓度用血球计经显微镜确定。子囊孢子产量表示为(在秋天原始固定在果园地面上的)每克叶的产量或者每克春天取样日存在的经风干的叶残余物的产量。

结果和讨论

在来自对照处理的叶残余物上，每克叶残余物(干重)产生220,089个子囊孢子。这等价于每克存在于前一个秋季的叶组织(鲜重)产生的37,171个子囊孢子(表9)。在来自在前一个夏季已用芽枝状枝孢菌H39处理的叶的残余物中，仅产生109,044个子囊孢子，等价于每克存在于前一个秋季的叶组织(鲜重)产生的15,733个子囊孢子。子囊孢子产生与对照处理相比分别降低58％和50％在统计学上是显著的。芽枝状枝孢菌R406在前一个夏季处理苹果叶后对春季中子囊孢子产生的作用不太显著，不是统计学上显著的。

可以得出结论，对于在夏季期间用拮抗物芽枝状枝孢菌H39及可能也用芽枝状枝孢菌R406对果园进行的夏季处理在随后的春季对苹果黑星菌子囊孢子产生具有的长期持续作用。在过冬叶上产生的子囊孢子数目的降低会导致在苹果黑星病的主要感染季中更低的接种体压力并因此在流行开始时黑星病发展更慢。据我们所了解，这是首次报道证明了用拮抗物处理高度易感黑星病的发育中的苹果幼叶导致在过冬后下一个季节中经处理的叶上子囊孢子产生显著更低。

实施例6：芽枝状枝孢菌H39对于各种病原体孢子产生的作用

目的

接下来实验目的是评价所述拮抗物对于各种其它植物病原体的作用。

材料和方法

芽枝状枝孢菌H39的分生孢子.芽枝状枝孢菌H39的分生孢子在德国PROPHYTA Biologischer Pflanzenschutz GmbH的Solid-State Fermentation(SSF)系统中产生。将所收获的分生孢子配制为水可分散粒剂(WG)。为了保持产物性质，将终产物贮存在-20℃。在试验开始前在麦芽提取物琼脂(1g麦芽提取物l^-1)上确定干燥的分生孢子的生存力。在20℃温育24小时的分生孢子具有比分生孢子最小直径一半要长的芽管则被认为是存活的。65％的分生孢子是存活的。

病原体.在这项研究中使用如下病原体分离株(括号中是用于孢子产生的生长培养基)：仁果干癌丛赤壳菌780(燕麦粉琼脂；OA)，导致果树癌肿病及果实腐烂；囊状匍柄霉菌850(燕麦粉琼脂，OA)，引起梨树褐斑病及果实腐烂；葱腐葡萄孢(Botrytis aclada)008(OA)，引起洋葱茎腐烂；灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)143(OA)，引起各种作物灰霉病；斐济球腔菌78(马铃薯右旋糖琼脂；PDA)，导致香蕉黑斑病；禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)820(PDA)，引起谷类赤霉病；黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)807(PDA)，导致谷类赤霉病；以及甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)177(PDA)，导致芸苔科疾病。所有真菌均在24℃温育14天，每天12小时不可见光。为了获得孢子悬液，用含有0.01％Tween 80的无菌自来水淹没培养物。在用橡胶抹刀轻轻摩擦以从真菌培养物中除下孢子之后，将悬液通过筛孔200μm的无菌尼龙网进行过滤。通过血球计辅助确定孢子悬液浓度并用含有0.01％(v/v)Tween 80的无菌自来水将其调节至1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1。对于用斐济球腔菌进行的实验，悬液中也包含在无菌研磨菌丝体团后所获得的菌丝体片段。当调节悬液浓度时，仅考虑具有三个以上细胞的菌丝体片段。

实验设计.对于每个病原体和基质(substrate)类型进行分别的实验，以及重复进行每个实验。

从在温室或者田间生长的植物取下梨、洋葱、玫瑰、仙客来(cyclamen)、天竺葵(Pelargonium)、香蕉和白色甘蓝无症状的绿叶，将离脱叶在室温干燥几天。将干燥的叶切成片段，每个片段的大小为大约2x2cm长，密封在塑料袋中，通过40kiloGray的γ射线照射灭菌。以同样方式处理4cm长的麦秸(具1个结节)和苹果嫩枝(1个分枝)的片段。

将用于生物测试中的叶、麦秸或者嫩枝的片段用无菌自来水洗涤以除去可溶的营养素。因此，将每种基质类型大约80个片段置于在无菌的250ml锥形瓶中的150ml无菌自来水等份中，在4℃放置过夜。之后，将片段用无菌滤纸吸干。将4个片段置于一系列保湿室的每个之内。每个室由含有两张无菌滤纸(直径85mm)及6ml自来水的无菌塑料培养皿(直径90mm)组成。在每个实验中，对于病原体应用的两个水平(1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1)，各进行5次使用拮抗物芽枝状枝孢菌H39处理的重复(培养皿)及进行5次应用水的对照实验的重复。在实验期间，培养皿完全随机安排。

将病原体的孢子悬液(或者在一种情况中是菌丝体片段)喷雾于在保湿室内的叶、麦秸或者嫩枝的片段上。对于苹果嫩枝片段应用仁果干癌丛赤壳菌，对于梨叶片段应用囊状匍柄霉菌，对于洋葱叶片段应用葱腐葡萄孢菌，对于玫瑰、仙客来和天竺葵的叶片段应用灰色葡萄孢菌，对于香蕉的叶片段应用斐济球腔菌，对于麦秸片段应用禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌，以及对于白色甘蓝的叶片段应用甘蓝链格孢菌。将经处理的组织片段在24℃温育18小时。在第一次温育之后立即将芽枝状枝孢菌H39(2x10⁶个存活孢子ml^-1)的孢子悬液或者水喷雾在所述片段上。使用无菌喷雾器以大约5μlcm^-2叶片段来应用病原体和拮抗物。之后，将叶在保湿室内在黑暗中于24℃进一步温育。应用禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌的麦秸在第8天到第13天的温育中接受每天12小时不可见光。应用仁果干癌丛赤壳菌的嫩枝在第12天到第14天的温育中接受每天12小时不可见光。

在对于葱腐葡萄孢菌和甘蓝链格孢菌共温育9天及对于灰色葡萄孢菌共温育12天之后(从应用病原体当天开始计数)，所述叶片段由葱腐葡萄孢菌、灰色葡萄孢菌或者甘蓝链格孢菌的分生孢子梗所覆盖的表面以从0至5进行评价，分别代表叶表面由病原体的孢子产生结构覆盖0％、1-5％、＞5-25％，＞25-50％、＞50-75％和＞75-100％(

et al.1995，EuropeanJournal of Plant Pathology 101，627-637)。在囊状匍柄霉菌的情况中，无分生孢子梗产生，但是有性阶段(Pleospora allii)产生大量假囊壳(pseudothecia)。在接种16天之后，使用与分生孢子梗覆盖相同的级别来评价由假囊壳所覆盖的叶表面。从每个级别(n_0-5)的叶片段数目中，计算由4个叶片段组成的每个重复实验(培养皿)的范围从0至100的孢子形成指数(SI)(SI＝(0xn₀+5xn₁+25xn₂+50xn₃+75xn₄+100xn₅)/4)。

在温育15天之后计数香蕉叶片段上由斐济球腔菌产生的群落数。使用显微镜计数在13天后麦秸片段上产生的禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌的分生孢子数。因此，将每个培养皿的麦秸片段置于含有10ml洗涤液(在自来水中20％乙醇，含有0.01％Tween 80)的Erlenmeyer烧瓶(100ml)中。将烧瓶在往复式摇床上摇动10分钟，使用血球计在显微镜下确定禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌在悬液中的分生孢子浓度。相同方法也用于量化在温育14天之后苹果嫩枝片段上仁果干癌丛赤壳菌的分生孢子数。

统计学.利用ANOVA及随后的LSD-检验分别分析每个实验的数据。如果拮抗物处理×病原体浓度相互作用不显著，则将平均拮抗物处理作用分析为主要作用。孢子计数数据在分析前经对数转换：log-孢子数＝log₁₀(孢子数+0.01)。

结果和讨论

仁果干癌丛赤壳菌发现芽枝状枝孢菌H39具有针对导致果树癌肿病及果实腐烂的仁果干癌丛赤壳菌的强拮抗作用。在果园中，该病原体在嫩枝经感染的伤口区域(癌肿)存活和增殖(McCracken et al.，2003，PlantPathology 52，553-566)。在控制条件下的生物测试中这种组织上产生的接种体由所述拮抗物降低99％以上(表10)。

结果示出芽枝状枝孢菌H39具有很高潜力用于果树癌肿病的生物控制中，果树癌肿病在苹果和梨生产中是黑星病之外最重要的疾病。应用所述拮抗物因此在主要的梨果类果实作物中具有控制这两种主要疾病(黑星病以及果树癌肿病)的潜力。

囊状匍柄霉菌.囊状匍柄霉菌在欧洲主要产梨区中引起梨褐斑病(Llorente & Montesinos，2006)。该疾病初步接种体的主要来源是过冬的坏死梨树叶，在其上产生有性阶段(Pleospora allii)的假囊壳。

对病原体已预先建立群落的坏死叶应用芽枝状枝孢菌H39，在两个实验中均显著降低假囊壳的形成(通过评定由果实体覆盖的叶表面而进行评价)(表11)。因此可通过对林冠或者在落叶后对果园地面应用所述拮抗物来实现用芽枝状枝孢菌H39对褐斑病进行生物控制。

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时以1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1的浓度应用囊状匍柄霉菌。

¹5个重复的平均，每个有4个叶片段；对由假囊壳所覆盖的叶表面进行评价。

²与对照处理具有显著差异(LSD-检验；α＝0.05).

葡萄孢菌坏死的宿主组织的存在是灰霉病及其它由葡萄孢菌引起的疾病流行的前提条件。已经证明从坏死的宿主组织中竞争性除去葡萄孢菌可用于对葡萄孢菌所激起的疾病进行生物控制(

et al.，2003，BioControl48，349-359)。

在对所检测的所有四种不同宿主的组织进行的生物测试中，芽枝状枝孢菌H39显著降低葱腐葡萄孢菌和灰色葡萄孢菌的孢子形成(表12-15)。所述拮抗物因此在葡萄孢菌所激起的各种谷类疾病的生物控制中具有潜力。

斐济球腔菌斐济球腔菌在香蕉中引起黑叶斑病(Arzanlou et al.，2007，Phytopathology 97，1112-1118)。这种疾病在香蕉的生产中是主要威胁。目前的疾病控制依赖于多重杀真菌剂应用。病原体在叶上坏死病斑处存活和繁殖。

对坏死的香蕉叶进行的生物测试结果示出拮抗物芽枝状枝孢菌H39在该疾病的生物控制中具有很有希望的潜力。尽管在实验条件下孢子不由病原体形成，但是可明确证明该拮抗物能将病原体从基质群落建立中去除(表16)。

禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌在谷类植物和玉米中引起赤霉病。该疾病导致产量降低，且通常更重要的是由于病原体的真菌毒素形成而导致严重质量降低。麦秸残茎及其它碎片是这种疾病的主要接种体来源(Osborne & Stein，2007，International Journal of FoodMicrobiology 119，103-108)。

芽枝状枝孢菌H39在病原体已预先建立群落的麦秸片段上显著降低这两种镰孢菌分生孢子产生(表17和18)，因此在谷类植物生产中具有用来对这些主要病原体进行生物控制的潜力。

甘蓝链格孢菌.由甘蓝链格孢菌导致的黑色叶斑病是在蔬菜生产中芸苔科的主要疾病。该病原体在被感染的坏死病斑和作物碎片中形成孢子(Humpherson-Jones，1989，Annals of Applied Biology 115，45-50)。除了叶之外，在种子生产领域中的整个幼苗以及荚果包括发育中的种子均可被损伤。

在对白色甘蓝经预先建立群落的坏死叶应用芽枝状枝孢菌H39之后，在生物测试中发现甘蓝链格孢菌的分生孢子产生显著降低(表19)。

实施例7：芽枝状枝孢菌H39对于苹果果实腐烂的作用

目的

接下来实验的目的是评估所述拮抗物对于引起苹果收获后果实腐烂的产果念珠霉菌的作用。

材料和方法

芽枝状枝孢菌H39的分生孢子.芽枝状枝孢菌H39的分生孢子如实施例6所述产生。

病原体.将在多种果实作物中引起果实腐烂的产果念珠霉菌1067在燕麦粉琼脂上于24℃生长14天，每天不可见光12小时。为了获得孢子悬液，用含有0.01％Tween 80的无菌自来水淹没培养物。在用橡胶抹刀轻轻刮擦以从真菌培养物中除下孢子之后，用筛孔200μm的无菌尼龙网过滤该悬液。由于孢子形成较少，因此在所述悬液中也包含经无菌研磨的菌丝体团后所获得的菌丝体片段。当用血球计辅助确定悬液浓度时，仅考虑具有三个以上细胞的菌丝体片段，并且用含有0.01％(v/v)Tween 80的无菌自来水将浓度调节至1x10²个孢子和菌丝体片段ml^-1以及1x10³个孢子和菌丝体片段ml^-1。

实验设计.在生物测试中使用无症状有机产生的苹果栽培变种Elstar。通过在70％乙醇中浸泡1分钟及在无菌自来水中清洗3次来对苹果表面灭菌。将4个苹果置于保湿室(大小为28x15x9cm；在底部有加湿的滤纸；用盖子密封)中，使用无菌鸡尾酒牙签在苹果上做出两个伤口(大约为直径3mm，深度5mm)(Jijakli & Lepoivre，1992，In：Fokkema，N.J.，J.& Y.Elad，Biological control of foliar and post-harvest diseases，IOBC/WPRSBulletin Vol.16(11)，pp.106-110)。将50μl无菌水应用于对照处理的伤口。在另一处理中，将50μl芽枝状枝孢菌H39的分生孢子悬液(2x10⁶个活性孢子ml^-1)加至每个伤口处。将经处理的苹果在24℃温育24小时。随后，用1x10²和1x10³个孢子和菌丝体片段的产果念珠霉菌的孢子和菌丝体片段的悬液处理苹果，在保湿室内在24℃进一步温育。每个处理重复进行5次，每个重复由在相同保湿室内的4个苹果组成，进行不同处理的保湿室以完全随机的设计进行排列。将该实验重复两次。在应用产果念珠霉菌之后8和12天测量由接种的伤口所发展出的病斑直径。

结果和讨论

在所述实验条件下，产果念珠霉菌在苹果伤口处引起严重果实腐烂，例如在这两个实验的对照处理中在所有高水平病原体伤口上均产生病斑。应用芽枝状枝孢菌H39的分生孢子在大多数情况中减少感染伤口的数目(表20a)。通过拮抗物处理，平均病斑大小降低了高达70％(表20b)。平均起来，在第一个实验中果实腐烂(以病斑大小测量)在统计学上显著减少50％，在第二个实验中减少30％。

结果证明在生长季节应用芽枝状枝孢菌H39具有保护苹果果实免于收获前和收获后由产果念珠霉菌所致果实腐烂的潜力。在收获后用芽枝状枝孢菌H39处理也有希望保护果实免于在收获后贮存期间腐烂。

表3：H39和R406经应用的接种体的应用日期和孢子萌发(从在果园中喷雾的1个琼脂平板中计数来进行评价)。

表4：在2007年10月4日取样的苹果叶附生于植物的群落建立。将叶从6月28日至8月20日用H39和V301.61每周处理两次(总共应用16次)，或者从7月12日至8月20日用R406每周处理两次(总共应用12次)。

¹具有共同字母的同一列的数值无统计学上显著的差异(LSD；α＝0.05).

表5：在2007年10月4日取样的苹果叶内生于植物的群落建立。将叶从6月28日至8月20日用H39和V301.61每周处理两次(总共应用16次)，或者从7月12日直至8月20日用R406每周处理两次(总共应用12次)。

¹具有共同字母的同一列的数值无统计学上显著地差异(LSD；α＝0.05).

表6：在2005年秋季对苹果叶喷雾应用R406拮抗物对于在春季通过物种特异性实时PCR(TaqMan-PCR)确定的苹果黑星菌的DNA含量的作用。在2006年1月23-31日对叶残余物取样。

¹与对照处理在统计学上不同(LSD_5％＝5057).

表7：在2005年秋季对苹果叶喷雾应用R406拮抗物对于在2006年春季80片叶残余物上苹果黑星菌子囊孢子产生的作用。

¹在逆转换规模。

²与对照处理在统计学上显著不同(LSD_5％＝0.3604)。

表8：在2005年秋季对苹果叶喷雾应用R406拮抗物对于在2006年春季每克叶残余物的苹果黑星菌子囊孢子产生的作用

¹在逆转换规模。

²与对照处理在统计学上显著不同(LSD_5％＝0.3183).

表9：在6月28日至8月20日之间的夏季期间用芽枝状枝孢菌H39和R406对幼叶进行处理对于经处理的叶中在果园地面上过冬后苹果黑星菌子囊孢子产生的作用。果园实验2007/2008。

^a逆转换值。

^b与对照处理显著不同(单侧LSD-检验；a＝0.05).

表10：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃温育14天的苹果嫩枝片段上仁果干癌丛赤壳菌孢子形成的作用。

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时，以1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1的浓度应用仁果干癌丛赤壳菌。

¹5个重复的平均，每个实验4个嫩枝片段；括号中是逆转换的值。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表11：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃温育16天的坏死梨叶上Pleospora allii(囊状匍柄霉菌)的孢子形成的作用

表12：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃温育9天的坏死洋葱叶上葱腐葡萄孢菌的孢子形成的作用。

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时，以1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1的浓度应用葱腐葡萄孢菌。

¹5个重复的平均，每个有4个叶片段。

²与对照处理具显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表13；芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃温育12天的坏死玫瑰叶上灰色葡萄孢菌的孢子形成的作用。

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时，以1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1的浓度应用灰色葡萄孢菌。

¹5个重复的平均，每个有4个叶片段。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表14：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃温育12天的坏死仙客来叶上灰色葡萄孢菌的孢子形成的作用。

¹5个重复的平均，每个有4个叶片段。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表15：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃温育12天的坏死的天竺葵叶上灰色葡萄孢菌的孢子形成的作用。

¹5个重复的平均值，每个有4个叶片段。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表16：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃培养15天的坏死香蕉叶上斐济球腔菌的孢子形成的作用

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时，以1x10³个菌丝体片段ml^-1的浓度应用斐济球腔菌。

¹5个重复的平均，每个有4个叶片段。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表17：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃温育13天的麦秸上禾谷镰孢菌的孢子形成的作用

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时，以1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1的浓度应用禾谷镰孢菌。

¹5个重复的平均，每个有4个麦秸片段；括号中是逆转换的值。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表18：芽枝状枝孢菌H39对在保湿室内于24℃培养13天的麦秸上黄色镰孢菌的孢子形成的作用。

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时，以1x10²个孢子ml^-1和1x10³个孢子ml^-1的浓度应用黄色镰孢菌。

¹5个重复的平均值，每个有4个麦秸片段；括号中是逆转换的值。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表19：芽枝状枝孢菌H39对于在保湿室内于24℃温育9天的坏死白色甘蓝叶上甘蓝链格孢菌的孢子形成的作用。

在以2x10⁶个孢子ml^-1应用H39之前18小时，以1x10²个孢子/ml^-1和1x10³个孢子ml^-1的浓度应用甘蓝链格孢菌。

¹5个重复的平均值，每个有4个叶片段。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

表20：芽枝状枝孢菌H39对于在保湿室中于24℃温育8和12天的苹果cv Elstar上由产果念珠霉菌引起的果实腐烂的作用

a.每8个伤口产生的病斑数

b.平均病斑直径

将芽枝状枝孢菌H39用于伤口处，使用2x10⁶个孢子ml^-1的50μl孢子悬浮液。24小时后，应用产果念珠霉菌，使用1x10²个孢子和菌丝体片段ml^-1及1x10³个孢子和菌丝体片段ml^-1的50μl悬浮液。

¹5个重复的平均，每个有4个苹果，每个苹果有2个经处理的伤口。

²与对照处理显著不同(LSD-检验；α＝0.05).

Claims

1.芽枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)H39，于2007年12月13日以保藏号CBS122244保藏在位于荷兰Baarn的荷兰真菌保藏所。

2.控制植物叶、果实和穗病原体的组合物，其包含权利要求1的枝孢菌(Cladosporium)，其中所述病原体选自由以下所组成的组：苹果黑星菌(Venturia inaequalis)、囊状匍柄霉菌(Stemphylium vesicarium)、产果念珠霉菌(Monilia fructigena)、仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena)、葱腐葡萄孢菌(Botrytis aclada)、灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、斐济球腔菌(Mycosphaerella fijiensis)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、和黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)。

3.权利要求2的组合物，其中所述禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌是在谷类植物包括玉米中的禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌。

4.权利要求2的组合物，所述病原体是真菌性叶病原体苹果黑星菌。

5.权利要求2-4任一项的组合物，其中枝孢菌作为孢子存在。

6.权利要求5的组合物，其进一步包含所述枝孢菌孢子的载体。

7.权利要求6的组合物，其中所述载体是葡萄糖。

8.控制植物叶、果实和穗病原体的组合物，其中存在权利要求1的枝孢菌的提取物，其中所述病原体选自由以下所组成的组：苹果黑星菌、囊状匍柄霉菌、产果念珠霉菌、仁果干癌丛赤壳菌、葱腐葡萄孢菌、灰色葡萄孢菌、斐济球腔菌、甘蓝链格孢菌、禾谷镰孢菌、和黄色镰孢菌。

9.控制植物中病原体的方法，包括用权利要求2-8任一项的组合物处理所述植物，其中所述病原体选自由以下所组成的组：苹果黑星菌、囊状匍柄霉菌、产果念珠霉菌、仁果干癌丛赤壳菌、葱腐葡萄孢菌、灰色葡萄孢菌、斐济球腔菌、甘蓝链格孢菌、禾谷镰孢菌、和黄色镰孢菌。

10.权利要求9的方法，其中将所述组合物喷雾在植物的叶、果实或者穗上。

11.权利要求9-10任一项的方法，其中病原体的控制包括感染的预防和/或减少所述病原体所引起的植物损伤。

12.权利要求9的方法，其中所述禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌是在谷类植物包括玉米中的禾谷镰孢菌和黄色镰孢菌。

13.权利要求9的方法，所述病原体是真菌性叶病原体苹果黑星菌。

14.权利要求9的方法，其中所述组合物在收获前应用。

15.权利要求9的方法，其中所述组合物在收获后应用。

16.权利要求1的枝孢菌或者权利要求2-8任一项的组合物在预防或者治疗病原体对植物的叶、果实或者穗的感染中的应用，其中所述病原体选自由以下所组成的组：苹果黑星菌、囊状匍柄霉菌、产果念珠霉菌、仁果干癌丛赤壳菌、葱腐葡萄孢菌、灰色葡萄孢菌、斐济球腔菌、甘蓝链格孢菌、禾谷镰孢菌、和黄色镰孢菌。

17.权利要求1的芽枝状枝孢菌菌株或者权利要求2-8任一项的组合物，其用于控制植物病原体感染，其中所述植物病原体选自由以下所组成的组：苹果黑星菌、囊状匍柄霉菌、产果念珠霉菌、仁果干癌丛赤壳菌、葱腐葡萄孢菌、灰色葡萄孢菌、斐济球腔菌、甘蓝链格孢菌、禾谷镰孢菌、和黄色镰孢菌。