CN102115456A - 花菁类化合物,包含所述化合物的组合物及其在细胞检测中的用途 - Google Patents

花菁类化合物,包含所述化合物的组合物及其在细胞检测中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明一方面提供了一种具有通式I结构的化合物或其缀合物，其中各基团如说明书中定义。本发明另一个方面提供一种包含(i)上述式I化合物或其缀合物，以及(ii)选自阳离子表面活性剂和非离子表面活性中至少一种的表面活性剂的组合物。本发明还一方面提供一种所述组合物的制备方法以及包含所述组合物的试剂盒。本发明再一方面还提供了采用本发明所公开的组合物同时识别有核红细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞并进行分类的方法。
Figure D2009102389278A00011

Description

花菁类化合物,包含所述化合物的组合物及其在细胞检测中的用途
技术领域
本发明涉及荧光染料。具体地讲，本发明涉及适合用于生物样品染色的花菁类化合物，包含所述花菁类化合物的组合物及其采用所述组合物检测有核红细胞同时对白细胞分类计数的方法。
背景技术
有核红细胞(NRBC)即幼稚红细胞，存在于骨髓中。正常情况下1周之内婴幼儿血液中可见到少量幼稚红细胞，而成人幼稚红细胞均存在于骨髓之中，如见于外周血则为病理现象。一旦成年人外周血中出现NRBC，则多为病理状态，常见于一些溶血性贫血、急性大量失血、严重的组织缺氧、急慢性白血病、恶性肿瘤、骨髓纤维化症等多种疾病。
在正常人体内，嗜碱性粒细胞(Baso)数量较少，仅占白细胞总数的0～1％；淋巴细胞(Lym)约占白细胞总数的20～40％，这些细胞数量的变化对于一些疾病的诊断具有重要意义，如在重金属中毒、何杰金病、慢性粒细胞白血病等疾病中，嗜碱性粒细胞的数量会明显升高；在百日咳、传染性单核细胞增多症、慢性淋巴细胞白血病、麻疹、结核、传染性肝炎等疾病中淋巴细胞会出现增高现象。
因此上述有核红细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞的准确计数具有重要的临床意义。过去，临床上经常使用一些化学染料对上述细胞进行染色手工计数，例如瑞氏-吉姆萨复合染色法等。这些方法仅能提供细胞的百分比计数，同时存在操作时间长、易受操作者主观影响等缺点，并不适合临床大规模标本的检测。
目前已有测定有核红细胞和白细胞亚类的报道，其基本方法是使用溶血剂将红细胞和血小板溶解后分别对有核红细胞或白细胞亚类进行计数，而其中大部分无法实现有核红细胞和淋巴细胞、嗜碱性粒细胞同时计数。
CN 1084473C公开了一种白细胞四分类的测量方法，使用阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和阴离子有机物等成分处理血样，通过收集前方低角度散射光信息和前方高角度散射光信息将淋巴细胞从白细胞中分离出来。由于使用散射法无法区分有核红细胞和淋巴细胞，所以含有有核红细胞的样本经上述试剂处理后有核红细胞会干扰淋巴细胞的分类和计数，导致淋巴细胞和WBC计数的假性增高。
US 5155044公开了一种白细胞测量试剂，其中试剂包括裂解试剂和终止试剂两个部分。前者是一种酸性低渗溶液，作用是快速溶解红细胞和血小板；后者是一种碱性盐溶液，通过改变反应溶液的pH值和渗透压阻止裂解试剂对白细胞的进一步作用，以维持白细胞的正常形态。最后搜集DC信号、散射光信号，根据上述信号的综合差异将白细胞分为五类，这种方法的优点是简单、快速，但同时测量有核红细胞比较困难。
US5538893、US5677183、US5518928分别公开了一种用于嗜碱性粒细胞的分析试剂和方法。这些专利中的试剂可将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞裸核化，嗜碱性粒细胞保留本身的完整结构。然后通过测定细胞的阻抗或低角散射光获得细胞大小方面的信号，再通过测定细胞的侧向散射光或高角散射光获得细胞内部结构方面的信号。最后根据两种信号的综合差异即可将嗜碱性粒细胞从白细胞中分离出来，但这种方法存在一定的缺点。在遇到含有幼稚细胞或异形淋巴细胞的样本时容易将幼稚细胞和异形淋巴细胞误报为嗜碱性粒细胞，造成嗜碱性粒细胞计数的假性增加。另外在遇到含有脂肪颗粒的样本时，样本中的脂肪颗粒也可能会干扰上述方法中WBC和Baso的正确计数。
US5298426公开了一种计数NRBC的试剂和方法。该专利使用两步法测量NRBC和WBC。试剂共分两部分：第一试剂和第二试剂。第一试剂是含有一种或多种染料的酸性低渗透压溶液，作用是溶解红细胞和血小板。同时染料有针对性地与相应的细胞结合，比如有核红染料PI等、嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞染料Astrazon Yellow 3G、与所有白细胞结合的染料Acridine Red等。第二试剂是一种碱性盐溶液，主要作用是调节第一试剂的pH值和渗透压，使白细胞能保持正常的形态。最后通过搜集散射光信号和荧光信号来区分有核红细胞和白细胞。这种方法虽然实现了有核红细胞计数，但是这种试剂存在一些缺点。在第一试剂的处理过程中白细胞也受到了部分损伤，有核红染料不仅与有核红细胞核结合，同时也会进入白细胞内部与白细胞核结合，由此会导致有核红细胞计数不准确。另外这种方法需要两个步骤才能实现最终的检测结果，所以检测时间较长，在血液细胞分析仪上检测血样时会影响到整机的检测速度，同时染料的使用种类较多。
US 6664110B1公布了一种测试有核红细胞的试剂和方法。试剂由溶解红细胞的成分和染料两部分组成。在试剂和血液样本的作用过程中，红细胞被溶解后血红蛋白释放出来形成“红细胞血影”，同时荧光染料与细胞核结合，其中包括有核红细胞核和白细胞核。通过检测散射光信号和荧光信号，根据以上两种信号的综合差异将有核红细胞和白细胞区分开。
US 5559037公开了一种计数有核红细胞的试剂和方法。该专利中的试剂包括溶解红细胞成分和白细胞保护成分，红细胞溶解后PI等染料与NRBC裸核结合，白细胞保护剂保护白细胞免受损伤，阻止染料进入白细胞。最后利用0度～1度的ALL信号、1度～3度的LAS信号和荧光信号来区分NRBC和WBC。但是也存在着缺陷：虽然一个合适的溶血剂成分只破坏NRBC膜，不损伤WBC膜，这样染料只进入NRBC内部并与NRBC细胞核发生结合。但是随着血样放置时间的延长，部分白细胞会出现膜损伤，由此也会导致染料进入白细胞，从而与NRBC区分困难导致NRBC计数不准确。
US 5874310公开了一种测量NRBC的试剂和方法。该试剂没有使用荧光染料或核染料，通过试剂中的溶血剂成分将红细胞溶解，然后搜集电阻抗信号和散射光信号，根据上述信号的差异将有核红细胞和白细胞区分开。由于有核红细胞和淋巴细胞在大小和形态上的差异较小，所以这种方法测出的有核红细胞计数准确性不够理想，另外这种方法没有提到对嗜碱性粒细胞的分类计数。
从以上描述可以看出，对白细胞进行分类计数的现有技术中，多数无法实现NRBC的计数；对NRBC计数的现有技术中，多数无法实现白细胞的分类计数。
因此，期待能够将有核红细胞分类计数，并能进一步实现白细胞的计数的试剂和方法。这样不但使仪器、试剂变得简易化，而且会提高淋巴细胞计数和白细胞计数的测试准确率，因为有核红细胞在大小和形态上比较接近于淋巴细胞，在多种测量方法中常会干扰到淋巴细胞的正确分类和计数。
发明内容
本发明一方面提供了一种具有通式I结构的化合物：
Figure G2009102389278D00031
其中
Ar1为芳香环；
X选自-O-、-S-、-Se-、
Figure G2009102389278D00032
中的一种；
R1和R3各自独立选自C3～C20烯基和C3～C20炔基；
R2为氢、羧基、磺酸基、C1～C20饱和或不饱和烷基或者烷氧基；
Y为阴离子。
本发明还一方面提供一种上述式I化合物的缀合物。
本发明另一个方面还提供一种组合物，所述组合物包含(i)上述式I化合物或其缀合物，以及(ii)选自阳离子表面活性剂和非离子表面活性中至少一种的表面活性剂。
本发明还一方面提供本发明所公开的组合物的制备方法，所述方法包括将本发明所公开的组合物所包含的各组分溶于水中，制成单组分系；或者将所述组合物中所含的本发明所公开的式I化合物或其缀合物溶于有机溶剂，其他组分溶于水中，成为两个以上组分的体系。
本发明再一方面提供一种用于识别有核红细胞同时对白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所公开的组合物，所述组合物可以单组分体系存在，也可以两个以上组分体系存在。
本发明再一方面还提供了采用本发明所公开的组合物识别有核红细胞同时对白细胞分类计数的方法。
本发明使用一种试剂、一个通道同时实现了有核红细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞的正确分类和计数，不仅能对嗜碱性粒细胞准确计数，同时排除有核红细胞对淋巴细胞和白细胞的干扰，使淋巴细胞和白细胞准确计数。本发明也可以用于有核红细胞或嗜碱性粒细胞或淋巴细胞或白细胞单独计数。
本发明的另一个优点是采用本试剂和测量方法在测量有核红细胞或嗜碱性粒细胞或白细胞的过程中，脂肪颗粒样本中的脂肪颗粒不会干扰有核红细胞或嗜碱性粒细胞或白细胞的分类或和计数。
本发明的再一个优点是使用较低浓度的荧光染料获得较好的细胞分类效果。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明
图1显示了流式细胞分析仪光学系统的示意图。
图2显示了本发明公开实施例10获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图3显示了本发明公开实施例11获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图4显示了本发明公开实施例12获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图5显示了本发明公开实施例13获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图6显示了本发明公开实施例14获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图7显示了本发明公开实施例15获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图8显示了本发明公开实施例16获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图9显示了本发明公开实施例17获得的细胞以及脂肪颗粒分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图10显示了本发明公开实施例18获得的细胞分类散点图，其中X轴为侧向荧光强度，Y轴为前向散射光强度。
图11显示了本发明公开实施例19所述方法获得的本发明结果与传统方法结果的有核红细胞百分比相关性。
图12显示了本发明公开实施例19所述方法获得的本发明结果与传统方法结果的嗜碱性粒细胞百分比相关性。
图13显示了本发明公开实施例19所述方法获得的本发明结果与传统方法结果的淋巴细胞百分比相关性。
图14A显示了本发明公开实施例20中使用试剂A获得的细胞分类散点图；14B显示了试剂B获得的细胞分类散点图；其中X轴均为侧向荧光强度，Y轴均为前向散射光强度。
具体实施方式
定义
除另有说明外，否则本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“芳香环”指具有3-20个碳原子的单环或多环芳环，任选还含有1至3个选自N、O和S的杂原子。优选本发明中使用的术语“芳香环”是指至少具有6个环碳原子的芳香环。更优选“芳香环”为苯环或萘环。
本文中使用的术语“烷基”，无论是单独使用还是与其他基团结合使用，指包含1-30、优选1-12、更优选1-8、最优选1-6个碳原子的直链烷基和支链烷基。如提及单个直链烷基如“正丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本文中使用的术语“烷氧基”是指包含氧原子的上述定义的烷基，该基团通过氧原子与母体分子的剩余部位结合。
本文中使用的术语“烯基”或“链烯基”是指在分子链中含有一个或多个不饱和双键、并包含2-30、优选6-14、更优选2-4个碳原子的直链或支链碳链。
本文中使用的术语“炔基”是指在分子链中含有一个或多个不饱和叁键、并包含2-30、优选6-14、更优选2-4个碳原子的直链或支链碳链。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴、碘。
本文中使用的术语“磺酸基”是指-SO3H基团或-SO3 -M基团，其中M为相反离子，包括例如碱金属离子(例如K+离子)或碱土金属离子。
本文中使用的术语“生物样品”包括但不限于肽、蛋白质、核酸和血液中的细胞核酸物质(包括DNA、RNA和含有DNA和RNA的细胞器)。
本发明所公开的化合物
本发明一方面提供了一种能与细胞内核酸物质(包括DNA、RNA和含有DNA和RNA的细胞器)结合的荧光染料。所述荧光染料经一定波长的激发光照射后能发出荧光。可用作本发明的荧光染料的化合物为具有通式I结构的化合物：
Figure G2009102389278D00061
其中
Ar1为芳香环；
X选自-O-、-S-、-Se-、
Figure G2009102389278D00062
中的一种；
R1和R3各自独立选自C3～C20烯基和C3～C20炔基；
R2为氢、羧基、磺酸基、C1～C20饱和或不饱和烷基或者烷氧基；
Y-为阴离子。
优选Ar1为具有至少6个环碳原子的芳香环；更优选Ar1为苯环或者萘环。
优选X选自-O-、-S-和中的一种。
优选R1为C3～C18烯基或者C3～C18炔基；更优选R1为C3～C10烯基或者C3～C10炔基。
优选R3为C3～C18烯基或者C3～C18炔基；更优选R3为C3～C10烯基或者C3～C10炔基。
优选R2选自氢、羧基、磺酸基、C1～C12饱和或不饱和烷基或者烷氧基；更优选优选R2选自氢、羧基、磺酸基、C1～C8饱和或不饱和烷基或者烷氧基。
优选Y-选自Cl-、Br-、I-、ClO4 -、PF6 -、p-CH3C6H4-SO3 -中的一种。
优选本发明所公开的化合物选自：
Figure G2009102389278D00071
本发明实施例的化合物可作为本文中所述的盐形式直接用于生物样品的染色。或者，在一个实施方案中，本发明实施例化合物可作为式I化合物的衍生物的形式使用，所述衍生物包括但不限于缀合物。
本发明实施例中化合物在无核酸时本身几乎没有荧光，与核酸结合形成复合物后荧光强度迅速增加并且光谱在近红外区，避免背景荧光的干扰，有助于提到检测结果的精确度，可在流式细胞分析仪上用作各种生物样品的染色。
典型地，缀合物在荧光激活细胞分选仪(FACS)中使用。本文中使用的“缀合物”是指本发明化合物通过共价键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明化合物缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与缀合物温育一段时间，使得该缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明化合物，而测定装置测定由激发的化合物产生的发射光。
或者，在另一个实施方案中，该缀合物还可用于固相免疫测试，例如夹心型免疫测试。固相免疫测试的技术是本领域公知的，可由标准教科书获得。本发明的缀合物可用作固相免疫测试中的各种合适成分。
本发明的化合物的制备方法
本发明化合物可通过本领域熟知的通用方法合成得到。具体地讲，本发明化合物部分中间体可通过如下流程合成得到。
由未取代或取代的式IV的化合物为原料，分别与式R1X或R3X(X为F、Cl、Br或I)的卤化物反应：
Figure G2009102389278D00101
得到式V和式VI的季铵盐中间体：
Figure G2009102389278D00102
其中R1、R2、R3、X和A1环如式I化合物中所述定义。
例如，通过如下反应得到相应的季铵盐中间体。
Figure G2009102389278D00111
然后，将制得的季铵盐中间体与连接分子例如方酸缩合，可得到式I化合物：
其中X、Y、R1、R2、R3和A1环如上定义。
所得化合物可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
通式I化合物的使用浓度为0.05～200ppm，优选为0.1～20ppm，更优选使用浓度为0.5～10ppm。本发明实施例染料的荧光量子产率较高，因此配制试剂时可以减少用量，使用更少的染料就可达到相似的分类效果。
本发明的组合物
本发明一个实施方案还提供一种可用于对生物样品进行染色的组合物，所述组合物包含(i)上述式I化合物或其缀合物，以及(ii)选自阳离子表面活性剂和非离子表面活性中至少一种的表面活性剂。
阳离子表面活性剂
可用于本发明公开的阳离子表面活性剂可为通式II的季铵盐型阳离子表面活性剂：
Figure G2009102389278D00121
其中
R8为C6-14的烷基或链烯基；
R9、R10各自独立选自C1-4的烷基或C2-4链烯基；
R11为C1-4的烷基或C2-4链烯基，或为苄基；
B为卤素离子。
优选所述R8选自己基、辛基、癸基、十二烷基和十四烷基；更优选R8选自癸基、十二烷基和十四烷基。
优选所述R9和R10各自独立选自甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基；更优选R9和R10各自独立选自甲基、乙基或丙基。
非离子表面活性剂
可用于本发明公开的非离子表面活性剂可为通式III的聚氧乙烯类非离子表面活性剂：
Figure G2009102389278D00122
其中
R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；
R2为-O-、
Figure G2009102389278D00123
或-COO-；
n为8到30的整数。
优选所述非离子表面活性剂选自辛基苯基聚氧乙烯醚，聚氧乙烯(10)十六烷基醚、聚氧乙烯(23)十六烷基醚、聚氧乙烯(25)十六烷基醚和聚氧乙烯(30)十六烷基醚。特别优选所述非离子表面活性剂选自聚氧乙烯(30)十六烷基醚。
表面活性剂的溶血效果和其本身的侧链长度有关。一般来说，侧链越长，溶血力度越大，所需的使用浓度越低。所以不同的表面活性剂其使用浓度各有差异。原则上，只要能使红细胞溶解、有核红细胞呈现裸核、白细胞膜微损的程度足以让荧光染料进入细胞内与核酸物质结合的任何浓度均可。
阳离子表面活性剂的使用浓度一般为10～10000mg/L，优选为150～1500mg/L。
非离子表面活性剂中辛基苯基聚氧乙烯醚使用浓度为20～10000mg/L，优选为100～5000mg/L。聚氧乙烯(10)十六烷基醚使用浓度为10～10000mg/L，优选为50～4000mg/L。聚氧乙烯(23)十六烷基醚使用浓度为8～8000mg/L，优选为20～2000mg/L。聚氧乙烯(25)十六烷基醚的使用浓度为5～5000mg/L，优选为10～1000mg/L。聚氧乙烯(30)十六烷基醚使用浓度为10～2000mg/L，优选为5～500mg/L。
阴离子有机化合物
本发明所公开的组合物还可任选含有阴离子有机化合物。虽然不希望受任何理论的约束，但认为阴离子有机化合物主要功能是促进红细胞溶解，缩短溶血时间，改善细胞分类效果。加入阴离子有机化合物之后，加快了红细胞的溶解速度，未完全溶解的红细胞几乎都变成了红细胞血影，这样减少红细胞对NRBC的干扰。另一方面，据试验得知，阴离子化合物可以使NRBC更加聚集，同时也有利于Baso细胞的分类计数。
所述阴离子有机化合物可选自水杨酸及其盐、苯甲酸及其盐。
阴离子有机化合物的使用浓度以保证细胞分类效果明显为前提，溶血时间越短越好。使用浓度一般为10～50000mg/L，优选为500～5000mg/L。
其他组分
本发明所公开的组合物还任选含有缓冲剂、渗透压调节剂、防腐剂或金属鳌合物等。
缓冲剂
本发明所公开的组合物可任选包含缓冲剂，以维持试剂的稳定pH值。pH值越低，本发明组合物的溶血力越大。但是当pH值过低时会导致嗜碱性粒细胞无法从白细胞中分类出来，pH过高会使有核红红细胞很难与白细胞分开。因此本发明所公开的组合物的pH值需要一定的限制范围，通常将pH值维持在2～6左右，优选为2.5～4.5。
可用于本发明组合物的缓冲剂选自柠檬酸、甲酸、乙酸、甘氨酸、苯二甲酸、酒石酸、苹果酸和马来酸等。使用浓度为0.1～1000mmol/L，优选为1～100mmol/L。
渗透压调节剂
本发明所公开的组合物还可任选包含调节渗透压的物质，如碱金属盐、糖类等。
虽然不希望受理论约束，但一般来讲，渗透压越低，溶血效果越好。但是过低的渗透压也会导致白细胞膜的过度损伤。因此，本发明所公开的组合物的渗透压通常维持在20～150mOsm/Kg。
防腐剂和金属螯合剂
本发明所公开的组合物中还可任选包含一些常规的防腐剂和金属螯合剂以延长试剂的保存期。
所述防腐剂优选为凯松和尼泊金甲酯，使用浓度为0.05～1.5g/L，优选为0.05～0.5g/L。
所述金属螯合剂的使用浓度没有太多的限制，优选为0.05～1g/L。
本发明所公开组合物的制备方法
本发明一个方面公开了上述组合物的制备方法，所述方法包括，将本发明所公开的组合物的各组分溶于水中，成为单组分体系；或者将其中的式I化合物溶于有机溶剂，其他组分溶于水中，成为两个以上组分的体系。对于有机溶剂来说，只要其能充分溶解式I化合物并在水中有一定溶解度即可，没有其它特殊限制，一般常见的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙二醇、甘油，二甲亚砜等均可。
本发明的试剂盒
本发明还有一个方面提供了试剂盒，所述试剂盒包含本发明所公开的组合物。所述试剂盒可用于处理血液样本，特别是含有有核红细胞的血样，识别有核红细胞的同时对白细胞进行分类计数。
在所述试剂盒中，本发明所公开的组合物的各组分可作为单一包装的形式存在，也可以将其中的式I化合物(荧光染料化合物)与其他组分分开包装，作为两个以上分包装的形式存在。
由于用于本发明组合物的荧光染料在非水溶剂中稳定性更好，因此优选将它们与本发明所公开的组合物中的水溶性组分分开保存。优选将所述荧光染料保存在有机溶剂中。对于有机溶剂来说，只要其能充分溶解所述荧光染料并在水中有一定溶解度即可，没有其它特殊限制，一般常见的有机溶剂如甲醇、乙醇、乙二醇、甘油，二甲亚砜等均可。
所述荧光染料在有机溶剂中的保存浓度只要能保证化合物充分溶解并且不低于其最终使用浓度即可。通常情况下荧光染料在有机溶剂中的保存浓度的范围在0.01ppm到1000ppm为宜，优选1ppm到100ppm。
在本发明公开中，也将所述水溶性组分称为“溶血剂”，将荧光染料类所在的组分称为“染色液”。使用本发明所公开的试剂盒时，将染色液与溶血剂及血液样本按照一定体积比混合一段时间后再进行检测；也可以先将染色液和溶血剂混合后，再与血液样本按一定体积比混合后进行检测。对于所述染色液与溶血剂的体积比没有特别的限制，通常按照1∶10到1∶100的比例进行混合，优选1∶40到1∶60的比例。
本发明再一方面公开了一种用于制备试剂盒的方法，所述方法包括：
称取本发明所公开的组合物中的各种组分，溶解在水中，调节pH值，定容，作为单一包装的形式存放于试剂盒中；或者
称取本发明所公开的式I化合物，溶解在有机溶剂中，定容，分包装；称取本发明所公开的其他组分，溶解在水中，调节pH值，定容，分包装；将所述分包装存放于试剂盒中。其中所述其他组分是指除式I化合物外的本发明所公开的组合物中的其他水溶性组分。所述其他组分可一起溶解于水中，调节pH值，定容，作为一个包装存放于试剂盒中，也可以分别溶解于水中，调节pH值，定容，作为多个包装存放于试剂盒中。
如上所述，由于用于本发明组合物的式I化合物在非水溶剂中稳定性更好，因此优选先将它们与本发明所公开的组合物中的水溶性组分分开保存、更优选将所述式I化合物保存在有机溶剂中，随后再将所述式I化合物与其他组分分开放置于试剂盒中。
本发明组合物的应用
本发明一方面还公开了一种识别有核红细胞的同时，对白细胞进行分类计数的方法，所述方法包括如下步骤：
a、将本发明所公开的组合物和血液样本混合，荧光染料进入细胞内部与核酸物质结合；
b、检测散射光信号和荧光信号：反应后的产物经一定波长的激发光照射后，根据荧光染料的结合程度会产生不同高低的荧光信号；不同种类的细胞之间具有不同的细胞体积，同时与上述试剂反应后细胞大小会受到不同程度地改变，就会产生不同大小的散射光信号；
c、根据散射光信号和荧光信号的差异分别对有核红细胞和白细胞进行分类，根据计数值结果分别对不同种类的细胞进行报值。
将本发明所公开的组合物与血样的混合可以先将本发明所公开的组合物的各组分预先混合，随后再将混合物与血样混合；也可以将本发明所公开的组合物的各组分同时加入血样中一起混合。混合后的样品在一定温度下反应一段时间，溶解破坏红细胞和血小板，使有核红细胞呈现裸核结构，白细胞膜发生微损并出现一些小孔，便于染色。血样和本发明所公开的组合物的混合比例没有特别的限制，前提是满足上述不同种类细胞的分类效果。优选本发明中血样和本发明所公开的组合物的反应比例在1∶10～1∶500。在试剂的处理后白细胞被轻微损伤，足以使用作荧光染料的本发明所公开的通式I的化合物进入细胞内部与核酸物质结合。所述核酸物质指细胞核内的DNA、RNA及含有DNA或和RNA的细胞器。
上述的散射光指1～10度的散射光，反应细胞体积大小方面的信息，也可包括90度的散射光，反应细胞内部的复杂程度；荧光是指一定波长的激发光激发包含荧光染料的反应产物后发出的红色荧光，其中激发光是由半导体激发器发出的，波长为635nm。
在本发明实施例的试剂处理血样过程中，红细胞被溶解破坏，部分未完全破坏的红细胞也形成了红细胞血影，对后续的散射光信号和荧光信号影响很小，同时有核红细胞呈现裸核结构，可直接与荧光染料结合，但是有核红细胞经试剂处理后形成的裸核发生固缩，与荧光染料的结合量较少，荧光信号较低，而其本身又是裸核，所以1～10度的散射光信号也很小，由此有核红细胞可以与白细胞分离开，白细胞包含嗜碱性粒细胞、淋巴细胞等，不同细胞具有不同的细胞特性，经试剂处理后其细胞膜的损伤程度不同，进入的染料量也各有差异，并且不同细胞类型之间的细胞核大小不同，因此对于不同类型的白细胞来说，与细胞内核酸物质结合的荧光染料也有所不同，所以导致了不同类型的白细胞具有不同的荧光信号，但是由于淋巴细胞在白细胞所有亚类中体积最小，细胞内核酸含量也相对较低，使用合适的荧光染料，可以将淋巴细胞从白细胞中区分出来。嗜碱性粒细胞具有一定的耐酸性，本发明实施例中的试剂会使嗜碱性粒细胞的破膜程度相对体积相似的其他类型白细胞较小，使用合适的荧光染料，可以使嗜碱性粒细胞的荧光信号较小，而嗜碱性粒细胞的体积较大，根据上述两点差异可以使嗜碱性粒细胞与其他类型的体积较大的白细胞如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等分离开，综上所述，通过本发明实施例的试剂，采用本发明中所述的方法可以识别血液样本中的有核红细胞，同时还可以将白细胞分类，将淋巴细胞和/或嗜碱性粒细胞和其他亚类白细胞区分开，还可以对有核红细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和白细胞总数分别计数。
实施例
以下所提供的实施例仅用于对本发明作出进一步的举例说明，而无意于对说明书作出任何限定。
除非另有声明，否则以下实施例中使用的试剂组分为分析纯，使用的溶剂为水，其中作为荧光染料的本发明所公开的通式I的化合物可以首先用醇类溶解配制成母液，所用的血液细胞检测设备为深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的BC系列血液细胞分析仪，激发波长635nm。所述细胞分析仪的光学系统示意图如图1所示。
实施例1
化合物1的制备
Figure G2009102389278D00171
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的100mL三口烧瓶中加入0.1mol 2，3，3-三甲基吲哚，0.12mol烯丙基溴和25mL乙腈作为溶剂。避光，在氩气保护下回流反应24小时。反应结束后减压蒸出部分溶剂后向其中加入适量石油醚，超声振荡使产物析出，得到棕红色油状物，直接用于下步反应。
取该棕红色产物0.01mol，方酸0.005mol和8mL苯、6mL正丁醇、6mL吡啶作为溶剂一起放入50mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应6小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。荧光染料通过硅胶柱层析的方法纯化，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶0→100∶12梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为蓝色具金黄色金属光泽的固体物，收率43％。
MS(EI)C32H33BrN2O2m/z：477.6[M-Br]+。
实施例2
化合物2的制备
Figure G2009102389278D00172
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的100mL三口烧瓶中加入0.1mol2，3，3-三甲基吲哚，0.12mol烯丁基溴和20mL甲苯作为溶剂，避光，在氩气保护下回流反应24小时。反应结束后减压蒸出部分溶剂后向其中加入适量石油醚，超声振荡使产物析出，得到棕红色块状物，直接用于下步反应。
取该棕红色产物0.01mol，方酸0.005mol和8mL甲苯、6mL正丁醇、6mL吡啶作为溶剂一起放入50mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应7小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。荧光染料通过硅胶柱层析的方法纯化，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶0→100∶12梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为蓝色具金黄色金属光泽的固体物，收率45％。
MS(EI)C34H37BrN2O2m/z：505.7[M-Br]+。
实施例3
化合物3的制备
Figure G2009102389278D00181
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的250mL三口烧瓶中加入0.08mol2，3，3-三甲基吲哚，0.12mol溴代异戊烯和10mL甲苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应12小时。反应体系冷却至室温后向其中加入适量乙酸乙酯，超声波振荡使产物析出，在乙酸乙酯中研磨后过滤，并用适量石油醚洗涤，得到深棕红色块状物，直接用于下一反应。
取该棕红色产物0.08mol，方酸0.04mol、甲苯4mL、正丁醇4mL、吡啶5mL作为溶剂一起放入25mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应10小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。荧光染料通过硅胶柱层析的方法纯化，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶0→100∶15梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为蓝色具金黄色金属光泽的固体物，收率23％。
MS(EI)C36H41BrN2O2m/z：533.7[M-Br]+。
实施例4
化合物8的制备
Figure G2009102389278D00191
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的100mL三口烧瓶中加入0.1mol 2-甲基苯并噻唑，0.25mol烯丙基溴和25mL二甲苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应36小时。反应体系冷却至室温后静置2h，倒掉上层清液，下层产物用适量乙醚洗涤数次，得到灰色块状物，直接用于下步反应。
取该灰色产物0.08mol，方酸0.004mol和6mL苯、4mL正丁醇、4mL吡啶作为溶剂一起放入50mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应6小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝绿色固体。荧光染料通过硅胶柱层析的方法纯化，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶0→100∶10梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为蓝绿色具金属光泽固体，收率37％。
MS(EI)C26H21BrN2O2S2m/z：457.6[M-Br]。
实施例5
化合物10的制备
Figure G2009102389278D00192
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的100mL三口烧瓶中加入0.1mol 2，3，3-三甲基吲哚，0.25mol炔丙基溴和25mL甲苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应48小时。反应体系冷却至室温后静置2h，倒掉上层清液，下层产物用适量乙醚洗涤数次，得到灰色块状物，直接用于下步反应。
取该固体物0.04mol和0.02mol方酸放入三口烧瓶中，加入5mL甲苯、4mL正丁醇、4mL吡啶作为溶剂，在氩气保护下搅拌并加热到回流，6小时后停止反应，冷却至室温后向其中加入过量乙醚，产物析出，过滤后干燥，得到深蓝色固体。荧光染料通过硅胶柱层析的方法纯化，用洗脱液二氯甲烷∶甲醇＝100∶0→100∶20梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为具有金属光泽的蓝色固体，收率29％。
MS(EI)C32H29BrN2O2m/z：473.6[M-Br]+。
实施例6
化合物11的制备
Figure G2009102389278D00201
向配有回流冷凝器、磁力加热搅拌器的250mL三口烧瓶中加入0.05mol2，3，3-三甲基吲哚，0.10mol溴代戊炔和10mL邻二氯苯作为溶剂，在氩气保护下回流反应28小时。反应体系冷却至室温后向其中加入适量乙酸乙酯，超声波振荡使产物析出，在乙酸乙酯中研磨后过滤，得到棕红色块状物，直接用于下部反应。
取该棕红色产物0.005mol，方酸0.0025mol和4mL苯、3mL正丁醇、3mL吡啶作为溶剂一起放入50mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应6小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。荧光染料通过硅胶柱层析的方法纯化，用洗脱液乙酸乙酯∶石油醚＝100∶0→100∶20梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为具有金属光泽的蓝色固体，收率33％。
MS(EI)C36H37BrN2O2m/z：529.7[M-Br]+。
实施例7
化合物23的制备
Figure G2009102389278D00211
向配有分水器、回流冷凝管、磁力加热搅拌器的25mL三口烧瓶中加入0.003mol方酸，8mL乙醇，4mL苯，加热至回流并保持该状态10小时。反应结束后冷却至室温后旋转蒸发除去其中的溶剂后加入适量乙酸乙酯洗涤，过滤，收集滤液，旋转蒸发除去溶剂后得到黄色油装液体(中间体I)。
向配有回流冷凝管和磁力加热搅拌器的50mL三口烧瓶中加入1-(3-丁炔基)-2，3，3-三甲基吲哚溴盐0.01mol，乙醇20mL，三乙胺4mL，搅拌下加热到70℃，保持该状态30分钟后加入上述黄色油状物0.015mol，继续反应30分钟后停止加热，冷却到室温后旋转蒸发除去其中的溶剂，用无水乙醚洗涤后，通过硅胶柱层析的方法纯化，用乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1洗脱，得到纯化后的产物(中间体II)。
向配有回流冷凝器和磁力加热搅拌器的25mL三口烧瓶中加入中间体II0.005mol，20mL乙醇，在回流状态下加入0.1mL40％氢氧化钠溶液，回流10分钟后停止反应，调节反应体系的pH为中性后旋转蒸发其中的溶剂，得到固体产物。将该产物和0.005mol 1-(2-烯丙基)-2，3，3-三甲基吲哚溴盐，6mL甲苯，4mL正丁醇，4mL吡啶作为溶剂一起放入25mL三口烧瓶中，在氩气保护下搅拌并加热至回流，反应6小时后停止。冷却至室温后向其中加入过量乙醚使产物析出，过滤，并用适量乙醚洗涤后干燥，得到深蓝色固体。荧光染料通过硅胶柱层析的方法纯化，用洗脱液乙酸乙酯∶甲醇＝100∶0→100∶20梯度洗脱，收集蓝色组分，旋转蒸发除去溶剂后在45℃条件下真空干燥箱中干燥24小时，得到标题化合物，为蓝色具有金属光泽的固体颗粒，收率20％。
MS(EI)C33H33BrN2O2m/z：489.6[M-Br]+。
实施例8
其余化合物的制备
  化合物名称  制备方法   MS(EI)
  化合物4  参考化合物1的制备方法   MS(EI)C36H41BrN2O2m/z：533.32[M-Br]+。
  化合物5  参考化合物1的制备方法   MS(EI)C38H45BrN2O2m/z：561.35[M-Br]+。
  化合物6   参考化合物1的制备方法   MS(EI)C40H49BrN2O2m/z：589.38[M-Br]+。
  化合物7   参考化合物1的制备方法   MS(EI)C42H53BrN2O2m/z：617.41[M-Br]+。
  化合物9   参考化合物8的制备方法   MS(EI)C30H29BrN2O2S2m/z：533.32[M-Br]+。
  化合物12   参考化合物8的制备方法   MS(EI)C36H37BrN2O2m/z：529.28[M-Br]+。
  化合物13   参考化合物8的制备方法   MS(EI)C38H41BrN2O2m/z：557.32[M-Br]+。
  化合物14   参考化合物8的制备方法   MS(EI)C26H17BrN2O2m/z：421.12[M-Br]+。
  化合物15   参考化合物8的制备方法   MS(EI)C28H21BrN2O2S2m/z：481.10[M-Br]+。
  化合物16   参考化合物11的制备方法   MS(EI)C32H27KN2O8S2m/z：631.12[M-2K]+。
  化合物17   参考化合物2的制备方法   MS(EI)C34H35KN2O8S2m/z：663.18[M-2K]+。
  化合物18   参考化合物2的制备方法   MS(EI)C34H37IN2O2m/z：505.28[M-I]+。
  化合物19   参考化合物2的制备方法   MS(EI)C36H41IN2O2m/z：533.32[M-I]+。
  化合物20   参考化合物3的制备方法   MS(EI)C38H45BrN2O4m/z：593.34[M-Br]+。
  化合物21   参考化合物3的制备方法   MS(EI)C42H41BrN2O4m/z：605.32[M-Br]+。
  化合物22   参考化合物3的制备方法   MS(EI)C44H45BrN2O4m/z：665.34[M-Br]+。
实施例9
化合物1、10和23在乙醇中的摩尔消光系数的测定：
配置浓度为1×10-5M的化合物1、10和23的乙醇溶液，分别取50μL加乙醇稀释至3mL置于厚度为1cm的比色皿中，测定其吸光度值。每个样品平行测定三次，根据Lambert-Beer定律，算出摩尔消光系数，取平均值。在25℃下，乙醇溶液中，ε1＝1.23×105，ε10＝1.07×105，ε23＝0.63×105。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：UV-mini1240。
从中可以看出，本发明的染料具有较大的摩尔消光系数，用于检测时的灵敏度较高。
实施例10
采用以下组分配制本发明实施例10的组合物
 荧光染料(化合物1)   3mg/L
  柠檬酸   2.5g/L
  柠檬酸钠   0.88g/L
  十二烷基三甲基氯化铵   0.6g/L
  4-甲氧基酚   0.2g/L
  pH   3.8
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00231
将含有有核红细胞的血液样本加入到上述组分配成的试剂中，血样样本与上述试剂的混合比例为1∶50，在42度条件下反应4.8s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果区分有核红细胞与白细胞，同时淋巴细胞与其他类型白细胞也区分开，散点图结果如图2所示，测试结果为有核红细胞百分比1.89％、淋巴细胞百分比6.93％。同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红细胞百分比为2.0％(2个NRBC/100个白细胞)、淋巴细胞百分比为7.5％(7.5个淋巴细胞/100个白细胞)。
实施例11
采用以下组分配制本发明实施例11的组合物
  荧光染料(化合物15)   10mg/L
  柠檬酸   2.5g/L
  柠檬酸钠   0.88g/L
  聚氧乙烯(23)十六烷基醚   0.4g/L
  pH   3.8
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00241
取20uL含有有核红细胞的血液样本和1mL上述组分配制得到的试剂混合，在42度条件下反应6s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞和淋巴细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果，区分有核红细胞与白细胞，同时淋巴细胞也与其他白细胞区分开，散点图结果中有核红细胞和淋巴细胞分别成为独立的细胞群，散点图结果如图3所示，测试结果为有核红细胞百分比2.62％、淋巴细胞百分比7.39％，同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红细胞百分比为3.0％、淋巴细胞百分比为7.5％。
实施例12
采用以下组分配制本发明实施例12的组合物
  荧光染料(化合物2)   5mg/L
  水杨酸钠   2.0g/L
  柠檬酸   1.6g/L
  十二烷基三甲基溴化铵   0.4g/L
  4-甲氧基酚   0.3g/L
  用NaOH调节pH值   调至3.7
其中荧光染料的结构如下：
将正常人血液样本加入到上述组分配成的试剂中，血样样本与上述试剂的混合比例为1∶50，在42度条件下反应4.8s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的嗜碱性粒细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果将嗜碱性粒细胞和淋巴分别从白细胞中分离出来，嗜碱性粒细胞和淋巴细胞均成为独立的细胞群，散点图结果如图4所示，测试结果为嗜碱性粒细胞百分比0.93％、淋巴细胞百分比36.93％。同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其嗜碱细胞百分比为1.0％、淋巴细胞百分比40.5％。
实施例13
采用以下组分配制本发明实施例13的组合物
  荧光染料(化合物1)   5mg/L
  水杨酸钠   1.6g/L
  柠檬酸   1.47g/L
  柠檬酸钠   0.88g/L
  十二烷基三甲基氯化铵   0.4g/L
  4-甲氧基酚   0.1g/L
  pH   3.7
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00251
取20uL高嗜碱性粒细胞血液样本和1mL上述组分配制得到的试剂混合，在42度条件下反应4.8s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的淋巴细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果将淋巴细胞、嗜碱性粒细胞从白细胞中分离出来，散点图结果中淋巴细胞和嗜碱性粒细胞分别成为独立的细胞群，散点图结果如图5所示，测试结果显示淋巴细胞百分比为10.8％、嗜碱性粒细胞百分比为1.2％，同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其淋巴细胞百分比为9.5％、嗜碱性粒细胞百分比为1.0％。
实施例14
采用以下组分配制本发明实施例14的组合物
  荧光染料(化合物4)   5mg/L
  苯甲酸钠   1.6g/L
  柠檬酸   1.47g/L
  柠檬酸钠   0.8g/L
  十二烷基三甲基氯化铵   0.6g/L
  聚氧乙烯(25)十六烷基醚   0.1g/L
  pH   3.7
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00261
取20uL临床血液样本和1mL上述组分配制得到的试剂混合，在42度条件下反应6s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果将有核红细胞与白细胞分开，同时将嗜碱性粒细胞和淋巴细胞从白细胞中分离出来，有核红细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞分别成为独立的细胞群，散点图结果如图6所示，测试结果为有核红细胞百分比8.07％、嗜碱性粒细胞百分比0.33％、淋巴细胞百分比为12.9％，同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红百分比为8.5％、嗜碱性粒细胞百分比为0、淋巴细胞百分比为13.5％，由于采用染色法人工镜检计数有核红细胞或者白细胞亚类都是计数100个白细胞来确定最终的百分比，当有核红百分比或嗜碱性粒细胞百分比小于1％时，很可能会导致上述细胞的百分比为0，从这一点来讲，本发明的测试方法对各种细胞的报值更为准确，尤其是对于正常人血液中含量较低的细胞如有核红细胞、嗜碱性粒细胞等。
实施例15
采用以下组分配制本发明实施例15的组合物
  荧光染料(化合物1)   2mg/L
  苯甲酸钠   1.8g/L
  柠檬酸   2.5g/L
  柠檬酸钠   0.88g/L
  十烷基三甲基溴化铵   0.2g/L
  聚氧乙烯(25)十六烷基醚   0.1g/L
  pH   3.8
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00271
取20uL含有有核红的血液样本和1mL上述组分配制得到的试剂混合，在42度条件下反应6s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果将有核红细胞与白细胞分离开，同时将淋巴细胞从白细胞中分离出来，散点图结果中有核红细胞和淋巴细胞分别成为独立的细胞群，散点图结果如图7所示，测试结果为有核红细胞百分比0.87％，、淋巴细胞百分比8.3％，同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红细胞百分比为1.0％、淋巴细胞百分比为7.5％。
实施例16
采用以下组分配制本发明实施例16的组合物
  荧光染料(化合物10)   5mg/L
  水杨酸钠   2.0g/L
  柠檬酸   1.5g/L
  十四烷基三甲基氯化铵   0.1g/L
  聚氧乙烯(25)十六烷基醚   0.1g/L
  使用NaOH将溶液pH调至   3.5
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00272
取5uL含有有核红细胞的血液样本和1mL上述组分配制得到的试剂混合，在42度条件下反应6s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞和淋巴细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果将有核红细胞与整体白细胞分离开，同时将淋巴细胞从白细胞中分离出来，散点图结果中有核红细胞和淋巴细胞分离成为独立的细胞群，散点图结果如图8所示，测试结果为有核红细胞百分比1.31％、淋巴细胞百分比1.8％，同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红细胞百分比为1.5％、淋巴细胞百分比2.0％。
实施例17
采用以下组分配制本发明实施例17的组合物
  荧光染料(化合物2)   1.5mg/L
  水杨酸钠   0.8g/L
  柠檬酸   1.47g/L
  柠檬酸钠   0.88g/L
  十二烷基三甲基溴化铵   0.4g/L
  葡萄糖   10g/L
  pH   3.8
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00281
取20uL临床血液样本和1mL上述组分配制得到的试剂混合，在42度条件下反应4.8s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞、淋巴细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果将有核红细胞与整体白细胞分离开，同时淋巴细胞从白细胞中分离出来，散点图结果中有核红细胞和淋巴细胞分别成为独立的细胞群，散点图结果如图9所示，测试结果为有核红细胞百分比3.67％、淋巴细胞百分比18.87％，同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红细胞百分比3.5％、淋巴细胞百分比为19％，而位于散点图下方的不规则形状在显微镜下证实为脂肪颗粒，由于这个血液样本中的脂肪颗粒大小并不均一，会产生不同的前向散射光信号，同时脂肪颗粒对侧向荧光产生干扰，所以会产生散点图中所呈现的弯曲不规则形状，但是从散点图结果也可以发现，脂肪颗粒的出现完全不会干扰有核红细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞的分类计数和总白细胞计数，说明采用本发明的试剂和方法检测血液样本时可以排除脂肪颗粒的干扰。
实施例18
采用以下组分配制本发明实施例18的组合物
  荧光染料(化合物23)   6mg/L
  水杨酸钠   2.5g/L
  柠檬酸   1.47g/L
  柠檬酸钠   0.98g/L
  十二烷基三甲基氯化铵   0.5g/L
  聚氧乙烯(25)十六烷基醚   0.12g/L
  pH   3.8
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00291
取5uL含有有核红细胞的血液样本和1mL上述组分配制得到的试剂混合，在44度条件下反应6s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞、淋巴细胞和嗜碱性粒细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据前向散射光信息和侧向荧光信息的综合分析结果将有核红细胞与整体白细胞分离开，同时嗜碱性粒细胞和淋巴细胞也从白细胞中分离出来，散点图结果中有核红细胞成为一个独立的细胞群位于散点图的左下方，嗜碱性粒细胞和淋巴细胞均成为独立的细胞群，散点图结果如图10所示，测试结果为有核红细胞百分比1.41％、嗜碱性粒细胞百分比0.13％、淋巴细胞百分比66.1％，同一标本经国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法确认，其有核红细胞百分比为2.0％、嗜碱性粒细胞百分比0％、淋巴细胞百分比64.0％。
实施例19
采用以下组分配制本发明实施例19的组合物
  荧光染料(化合物5)   3mg/L
  水杨酸钠   0.8/L
  柠檬酸   1.47g/L
  柠檬酸钠   0.88g/L
  十二烷基三甲基溴化铵   0.4g/L
  聚氧乙烯(30)十六烷基醚   0.1g/L
  pH   3.7
其中荧光染料的结构如下：
Figure G2009102389278D00301
取临床样本30例，将血样和上述组分配制得到的试剂按照1∶50的比例混合，在42度条件下反应4.8s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本中的有核红细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，根据上述两者综合信号的差异分别对细胞进行分类计数，将30例样本的分类计数结果与国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的瑞氏-吉姆撒染色法人工镜检结果进行比对，其结果汇总如下：有核红百分比相关性如图11、嗜碱性粒细胞百分比相关性图12、淋巴细胞百分比相关性图13，测试结果分别为NRBC％相关系数R＝0.95032、Baso％相关系数R＝0.86551、Lym％相关系数R＝0.99706。
实施例20
采用以下组分配制本发明实施例10的组合物
  试剂A   试剂B
  荧光染料   化合物22mg/L   对照化合物10mg/L
  水杨酸钠   2.0g/L   2.0g/L
  柠檬酸   1.6g/L   1.6g/L
  十二烷基三甲基氯化铵   0.6g/L   0.6g/L
  4-甲氧基酚   0.2g/L   0.2g/L
  使用NaOH将溶液pH调至   3.8   3.8
其中化合物2的结构如下：
Figure G2009102389278D00311
对照化合物的结构如下，具体合成方法见中国专利200810217140.9：
Figure G2009102389278D00312
将正常人血液样本分成两份，分别加入到上述组分配成的试剂A和B中，血样样本与上述试剂的混合比例为1∶50，在42度条件下反应4.8s，采用激光流式法(激发光源是半导体激光器，激发波长为635nm)检测血液样本，检测1～10度的前向散射光信息和90度的侧向荧光信息，得到散点图14A、14B。对比两图可见，细胞的荧光强度接近，分类效果也相近，表明本发明的化合物的荧光量子产率较高，使用较少的染料就可达到相似的分类效果。
已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。

Claims (21)

1.一种具有通式I结构的化合物：
Figure F2009102389278C00011
其中
Ar1为芳香环；
X选自-O-、-S-、-Se-、
Figure F2009102389278C00012
中的一种；
R1和R3各自独立选自C3～C20烯基和C3～C20炔基；
R2为氢、羧基、磺酸基、C1～C20饱和或不饱和烷基或者烷氧基；
Y-为阴离子。
2.权利要求1的化合物，其中Ar1为具有至少6个环碳原子的芳香环；优选Ar1为苯环或者萘环。
3.权利要求1-2中任一项的化合物，其中X选自-O-、-S-和
Figure F2009102389278C00013
中的一种。
4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中R1为C3～C18烯基或者C3～C18炔基；优选R1为C3～C10烯基或者C3～C10炔基。
5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中R3为C3～C18烯基或者C3～C18炔基；优选R3为C3～C10烯基或者C3～C10炔基。
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中R2选自氢、羧基、磺酸基、C1～C12饱和或不饱和烷基或者烷氧基；优选R2选自氢、羧基、磺酸基、C1～C8饱和或不饱和烷基或者烷氧基。
7.权利要求1-6中任一项的化合物，其中Y-选自Cl-、Br-、I-、ClO4 -、PF6 -、p-CH3C6H4-SO3 -中的一种。
8.权利要求1-7中任一项的化合物，所述化合物选自：
Figure F2009102389278C00021
Figure F2009102389278C00031
Figure F2009102389278C00041
Figure F2009102389278C00051
Figure F2009102389278C00061
Figure F2009102389278C00071
Figure F2009102389278C00081
9.权利要求1-8中任一项的化合物的缀合物。
10.一种组合物，所述组合物包含：
(i)权利要求1-8中任一项的化合物或权利要求9的缀合物，以及
(ii)选自阳离子表面活性剂和非离子表面活性中至少一种的表面活性剂。
11.权利要求10的组合物，其中所述阳离子表面活性剂为通式II的季铵盐型阳离子表面活性剂：
Figure F2009102389278C00082
其中
R8为C6-14的烷基或链烯基；
R9、R10各自独立选自C1-4的烷基或C2-4链烯基；
R11为C1-4的烷基或C2-4链烯基，或为苄基；
B为卤素离子。
12.权利要求11的组合物，其中所述R8选自己基、辛基、癸基、十二烷基和十四烷基，优选R8选自癸基、十二烷基和十四烷基。
13.权利要求11-12中任一项的组合物，其中所述R9和R10各自独立选自甲基、乙基、丙基、丁基或丁烯基，优选R9和R10各自独立选自甲基、乙基或丙基。
14.权利要求11-13中任一项的组合物，其中所述非离子表面活性剂为通式III的聚氧乙烯类非离子表面活性剂：
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
III
其中
R1为C8-23的烷基或链烯基，优选选自辛基、癸基、月桂基、十四烷基、十六烷基和硬脂基的直链烷基，特别优选选自月桂基、十四烷基和十六烷基的直链烷基；
R2为-O-、
Figure F2009102389278C00091
或-COO-；
n为8到30的整数。
15.权利要求14的组合物，其中所述非离子表面活性剂选自辛基苯基聚氧乙烯醚，聚氧乙烯(10)十六烷基醚、聚氧乙烯(23)十六烷基醚、聚氧乙烯(25)十六烷基醚和聚氧乙烯(30)十六烷基醚，特别优选选自聚氧乙烯(30)十六烷基醚。
16.权利要求10-15中任一项的组合物，所述组合物还含有阴离子有机化合物。
17.权利要求16的组合物，其中所述阴离子有机化合物选自水杨酸及其盐以及苯甲酸及其盐。
18.权利要求10-17中任一项的组合物，所述组合物还任选含有缓冲剂、渗透压调节剂、防腐剂或金属鳌合物。
19.权利要求10-18中任一项的组合物的制备方法，所述方法包括将权利要求10-18任一项的组合物所包含的各组分溶于水中，制成单组分系；或者将所述组合物中所含权利要求1-8任一项的化合物或权利要求9的缀合物溶于有机溶剂，其他组分溶于水中，成为两个以上组分的体系。
20.一种用于识别有核红细胞同时对白细胞分类计数的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求10-18中任一项的组合物，所述组合物可以单组分体系存在，也可以两个以上组分体系存在。
21.一种识别有核红细胞同时对白细胞分类计数的方法，所述方法包括如下步骤：
a、将权利要求10-18中任一项的组合物和血液样本混合，荧光染料进入细胞内部与核酸物质结合；
b、检测散射光信号和荧光信号；
c、根据散射光信号和荧光信号的差异分别对有核红细胞和白细胞进行分类，根据计数值结果分别对不同种类的细胞进行报值。
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