CN102113998B - 一种含有包封物的脂质体的分离提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用凝胶电泳分离提纯含有包封物的脂质体的方法，属于生物医用领域。该方法首先制备含有包封药物的脂质体，然后制备高分子凝胶，使用凝胶电泳法分离脂质体与未被包封的药物。本发明与现有技术相比，具有如下特点：1)利用不同组分在电场下的迁移率不同，实现脂质体与未被包封药物的有效分离；2)以高分子凝胶为介质，通过改变凝胶的孔径实现对不同尺寸、不同类型脂质体与未被包封药物的分离；3)适用范围广，不仅可用于小分子药物的分离，还适用DNA、siRNA和蛋白；4)分离技术操作简便，分离后脂质体及未被包封的药物可实现高效回收。
Description
技术领域
本发明涉及包含药物的脂质体的分离提纯，属于生物医用领域。
背景技术
脂质体药物在现代医学领域受到了越来越多的重视，同时也发挥着越来越重要的作用。脂质体包封药物不仅可以有效地提高药物的生物活性，还可以通过靶向的方法改进并调控药物的吸收及释放，防止敏感药物的破坏，减少副作用等等。脂质体作为药物的载体，可以包封亲水、疏水药物及蛋白和核酸，已经被广泛应用于治疗癌症，抗菌，疫苗和基因治疗等多个生物医用领域。
将药物包封在脂质体内常用的方法是将药物在脂质体制备的过程中混入，或是在脂质体形成后利用融合将药物包封其中。这些方法根据包封药物性质的不同，脂质体的组成、尺寸及制备方法的不同，包封率不尽相同，一般为20％-70％。剩余的药物残留在脂质体外，不能很好的被吸收利用，同时会增加药物的副作用，降低药物的有效利用率。从而不能使脂质体这种药物载体的优点得到充分的发挥。有效地将脂质体与未被包封的药物进行分离，是提高药物利用率，降低药物毒性的必然选择和有效手段。
目前常用的分离手段主要包括凝胶管柱层析法和离心沉降法。这两种方法在本质上都是利用重力进行分离，适用于分离密度梯度差别较大的脂质体与小分子药物的体系。对于凝胶管柱层析法而言，由于色谱柱本身对脂质体有吸附，因此在实际操作中需要预先用空白的脂质体将色谱柱进行饱和，这就造成磷脂原料的大量消耗；而对于离心沉降法而言，因为脂质体与包封药物的分子量差别不大，因此往往需要较高的转速和较长的时间，不仅需要较高转速的离心机，而且费时费力效果不佳。
发明内容
为了克服现有分离手段存在的诸多不足，本发明旨在提供一种将脂质体与未被包封的药物分离的新方法，不仅分离效率高，而且操作简便。
本发明采取的方案如下：
步骤一：根据包封药物的类型及所需脂质体的大小，选择合适的方法将药物包封在脂质体内；
步骤二：根据脂质体的大小类型，制备适当浓度的高分子凝胶；
步骤三：根据包封药物与脂质体的带电性质选择设定合适的pH、温度、盐度和分离电压，利用电泳来实现脂质体与未被包封药物的有效分离。
步骤四：进一步通过电洗脱、透析等方法实现脂质体与未被包封药物的回收再利用。
本发明利用凝胶电泳将脂质体与未被包封的药物分离的方法与现有技术相比，具有如下特点：
1)当脂质体与包封物的电荷密度不同时，在电场存在下，可以实现脂质体与未被包封的药物的有效分离；如中性脂质体包封了带电的小分子药物或高分子(如DNA、siRNA或者蛋白)，则在电场的作用下，包封物自身的迁移率高于脂质体，在凝胶电泳中，表现为迁移的距离不同，因此可以将两组分分开。脂质体和包封物的电荷密度可以通过溶液pH进行调节，使二者的差距变大，图1为利用动态光散射(30°)测得的分离前后脂质体的流体力学半径。
2)以高分子凝胶为介质，可以通过改变凝胶的孔径实现对不同尺寸、不同类型脂质体与未被包封药物的分离；
3)适用范围广，不仅可用于小分子药物的分离，还适用DNA、siRNA和蛋白；
4)分离电场强度大小可调，根据脂质体与药物的性质选择最佳分离条件；
5)分离技术操作简便，分离后脂质体及未被包封的药物可实现高效回收。
附图说明
图1为利用动态光散射(30°)测得的分离前后脂质体的流体力学半径。
图2为实施例一最终的电泳照片。从左至右分别为，包封了模型药物的脂质体，后加入5％模型药物的脂质体与未利用脂质体包封的单纯的模型药物。照片中，白色为含有钙黄绿素的部分，灰色为背景。照片从下到上为从负极到正极。左下方的部分即为包封了药物的脂质体的部分，其他为自由的药物。
具体实施方式
实施例一、以包封物为带负电的小分子(如常用模型荧光分子钙黄绿素、常用止痛药布洛芬)为例
1、电泳缓冲液的配制
将Tris(10.78g)、硼酸(5.50g)、EDTA(0.74g)在100mL水中充分溶解，用孔径0.45um的滤膜过滤后得到电泳缓冲液的贮存液。稀释20倍使用。
2、药物模型溶液的配制
这里选取钙黄绿素作为模型药物分子来测试本方法的分离效果。钙黄绿素的分子结构式为
它不是实际使用的药物，没有药效。但是因为有荧光，方便表征。将钙黄绿素(311mg，0.5mmol)加入5mL电泳缓冲液中，搅拌均匀至钙黄绿素全部溶解后，滴加4mol/L的NaOH溶液调节pH为7.4。最后用电泳缓冲液至定容为10mL，此时钙黄绿素的浓度为0.05mol/L。
其他药物如布洛芬，其分子结构式为
布洛芬溶液的配制与钙黄绿素溶液相同。
3、将药物包封在脂质体内的制备方法
包封了药物的脂质体的制备方法有反相溶剂蒸发法、薄膜水化超声法和聚碳酸酯膜挤出法等。这里以薄膜水化超声法为例来对药物进行包封。具体如下：将二棕榈酰磷脂酰胆碱(59mg，0.080mmol)及胆固醇(31mg，0.080mmol)充分溶于20mL氯仿中，而后利用旋转蒸发仪将氯仿除去，得到磷脂薄膜。这个过程可加入20g直径为0.5cm的玻璃珠，以增加薄膜面积。在真空烘箱中静置至少过夜以除去残余的氯仿。然后加入事先加热到45摄氏度的10mL缓冲溶液或者溶解了药物模型的溶液，振荡20分钟至混合均匀后，用探头式超声机超声至溶液澄清。
4、高分子凝胶的配制
可用于制备凝胶的高分子包括聚甲基丙烯酰胺、琼脂糖、Pluronic(普流尼克)F127、壳聚糖、透明质酸衍生物、海藻酸钠等。这里仅以琼脂糖为例来制备分离用的凝胶。称取琼脂糖0.5g(所需要的量与凝胶的网孔相关)加入到盛有50mL电泳缓冲液的烧瓶中，在沸水浴中加热至琼脂糖充分溶解。在琼脂糖溶液稍冷却时，倒入托盘中，用合适的梳子形成加样孔。待凝胶溶液完全凝结，取出梳子，将凝胶安放到电泳槽内。加电泳缓冲液至刚好没过凝胶1mm。
5、含有药物模型的脂质体的凝胶电泳分离
在对脂质体进行凝胶电泳分离时，合理的温度、缓冲液的pH及盐浓度、及分离电压等参数应处于合适的范围，以保证分离的效果。具体的参数设定要综合考虑脂质体、脂质体内容物、凝胶体系的类型。当以二棕榈酰磷脂酰胆碱作为脂质体，分离的温度应控制在脂质体的转变温度40℃以下，否则温度过高，脂质体内容物大量渗透，造成脂质体包封率下降。选择Tris-硼酸盐缓冲液，pH为7.5-7.8，保证脂质体处于不带电的状态，与内容物的带电性质反差较大，分离效果最好。分离电压控制在5-10V，既保证了带电内容物的迁移，又保证了脂质体结构的稳定。
用吸管将样品缓慢加至凝胶的加样孔，关好电泳槽盖，接好电极插头。本方案选用的药物模型钙黄绿素携带负电荷，因此将样品加入负极。电泳开始后，药物模型向正极泳动。在5V/cm的电压下，电泳进行1.5小时后，钙黄绿素迁移到适当距离停止了电泳。关上电源，打开电泳槽盖，可以看到琼脂糖凝胶上呈不同颜色。
6、含有药物模型的脂质体及药物的提纯回收
将琼脂糖凝胶上不同颜色的部分割下，放入透析袋中透析1天，即得到了不含游离药物的脂质体，同时也可实现未被包封的药物的回收再利用。
实施例二、以包封物为带正电的小分子(如常用抗癌药物阿霉素)为例：
阿霉素的分子结构式为：
1.制备包封了阿霉素的脂质体
取二硬脂酰磷脂酰胆碱及胆固醇的氯仿溶液，利用旋转蒸发的方法除去氯仿溶液，得到磷脂薄膜。使用pH为4.0的柠檬酸盐缓冲溶液水化，通过冻融或者挤出的方法制备得到脂质体。磷脂的最终浓度为30mM，随后将脂质体利用羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液饱和的凝胶柱洗脱形成脂质体内外pH梯度。溶解阿霉素于生理盐水中，浓度为2mg/mL。将脂质体与阿霉素溶液按体积比5∶1混合，65℃培育30min，即实现基于跨膜pH梯度的药物在脂质体内的积聚。
2、Pluronic(普流尼克)凝胶的配制
称取Pluronic(普流尼克)F127 20g加入到盛有100mL电泳缓冲液的烧瓶中，在冰水浴中搅拌至充分溶解后倒入托盘中，用合适的梳子形成加样孔。升温至40℃，凝胶溶液完全凝结，取出梳子，将凝胶安放到电泳槽内。加电泳缓冲液至刚好没过凝胶1mm。
3、含有阿霉素的脂质体的凝胶电泳分离
用吸管将样品缓慢加至凝胶的加样孔，关好电泳槽盖，接好电极插头。本方案选用的药物模型阿霉素携带正电荷，因此将样品加入正极。电泳开始后，药物模型向负极泳动。在10V/cm的电压下，电泳进行1小时后停止了电泳。关上电源，打开电泳槽盖。
实验参数的设定：使用Pluronic(普流尼克)F127作为凝胶基质时，温度应高于35℃，保证凝胶性质的稳定，以二硬脂酰磷脂酰胆碱作为脂质体，分离的温度应控制在脂质体的转变温度55℃以下，因此此实验方案的实现温度控制在35-55℃，最佳温度为40摄氏度附近。选择pH为4.0的柠檬酸盐作为缓冲液，使小分子药物阿霉素充分带电，提高分离效果。分离电压控制在5-10V，既保证了带电内容物的迁移，又保证了脂质体结构的稳定。
4、含有药物模型的脂质体及药物的提纯回收
将凝胶上不同颜色的部分割下，降温至15℃，凝胶溶解，即实现脂质体及药物的分离。也可使用电洗脱及透析的方法，实现分离提纯。
实施例三、以包封物为带电的大分子(如DNA，siRNA等)为例：
1、包封了DNA的脂质体的制备方法
首先制备由蛋黄磷脂酰胆碱构成的脂质体，浓度为80mM。取250μL的脂质体溶液与100μL浓度为1mg/mL的鱼精DNA共混。向上述混合溶液中加入乙醇与CaCl2水溶液，涡旋30s后透析24小时。
2、包封了DNA的脂质体的凝胶电泳分离
配制浓度为0.5％的琼脂糖凝胶，可以选择点染法或者泡染法确定DNA的分离情况。也可使用丙烯酰胺凝胶作为分离介质，电压为9V/cm，电泳进行2小时，即可将未被包封的DNA与脂质体分离。利用电洗脱及透析的方法可回收脂质体与自由的DNA分子。
实验参数的设定：使用蛋黄磷脂酰胆碱作为脂质体，分离的温度应控制在室温附近。选择Tris-硼酸盐缓冲液，pH为7.5-7.8，保证脂质体处于不带电的状态，与DNA的带电性质反差较大，分离效果最好。分离电压控制在5-8V，对DNA与脂质体的分离效果最好。
Claims (3)
1.一种含有包封物的脂质体的分离提纯方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备含有包封物的脂质体，所述包封物为带电的小分子药物钙黄绿素、布洛芬、阿霉素，以二棕榈酰磷脂酰胆碱作为脂质体，所述脂质体与包封物的电荷密度不同；
2)制备高分子凝胶，所述高分子凝胶选自聚甲基丙烯酰胺、琼脂糖、普流尼克F127、壳聚糖或海藻酸钠中的一种；
3)使用凝胶电泳法将包封药物的脂质体与未被包封物分离，分离的温度控制在脂质体的转变温度以下，选择缓冲液的pH及盐浓度使脂质体与包封物的带电性质反差大，分离电压控制在5-10V。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，制备脂质体的方法选自下列方法之一：反相溶剂蒸发法、薄膜水化超声法或聚碳酸酯膜挤出法。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)后，进一步通过电洗脱、透析方法实现脂质体与未被包封药物的回收再利用。
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