CN102091076A - 脂氧素在治疗激素依赖型哮喘中的应用 - Google Patents

脂氧素在治疗激素依赖型哮喘中的应用 Download PDF

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吴萍
叶笃筠
蔡蕾
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Abstract

本发明披露了脂氧素在治疗激素依赖型哮喘中的应用。糖皮质激素已成为哮喘治疗的首选药物，在控制哮喘中发挥着重要作用，然而，激素依赖型哮喘患者必须长期大量使用糖皮质激素，使体内的糖皮质激素受体下调、亲和力下降，从而影响气道炎症的控制，导致哮喘反复发作，迁延不愈。本发明揭示脂氧素可以通过抑制多药耐药相关蛋白而增加患者对激素的敏感性，从而提高激素治疗哮喘的疗效，降低其剂量和副作用。为激素依赖型哮喘提供了一种新的治疗方法。

Description

脂氧素在治疗激素依赖型哮喘中的应用
技术领域：
本发明属于医药领域，涉及激素依赖型哮喘的治疗药物，具体涉及机体内源性促进炎症缓解的脂质——脂氧素(Lipoxins)在激素依赖型哮喘治疗中的应用。
背景技术：
哮喘是以气道炎症和高反应性为特征的呼吸系统疾病，众多炎症介质、活性氧及酶参与了其发生与发展，慢性患者甚至伴有气道重塑。随着人们对哮喘发生发展机制的认识深入，哮喘的治疗方案也由单用短效β2受体激动剂、吸入性糖皮质激素，发展到今天两种或多种药物的合并治疗。
可以肯定，糖皮质激素已成为哮喘治疗的首选药物，在控制哮喘中发挥着重要作用。然而，临床上仍有不少患者对其不敏感，需要长期大剂量口服激素来控制症状，停药或减量即可导致哮喘复发或加重，此类哮喘被称为激素依赖型哮喘。由于此类患者必须长期大量使用糖皮质激素，使体内的糖皮质激素受体下调、亲和力下降，从而影响气道炎症的控制，导致哮喘反复发作，迁延不愈。
发明内容
本发明的任务是提供一种治疗激素依赖型哮喘的药物，使其具有提高激素治疗哮喘的疗效，降低其剂量和副作用等特点，以克服现有技术的不足。
实现本发明的技术方按是：
本发明提供的这种治疗激素依赖型哮喘的药物是脂氧素。
为了降低激素依赖型哮喘患者对糖皮质激素的敏感性，减轻激素依赖的副作用，本发明提供了一种机体内源性的脂质介质——脂氧素，该物质可以通过抑制多药耐药相关蛋白而增加患者对激素的敏感性，从而提高激素治疗哮喘的疗效，降低其剂量和副作用。
本发明揭示了脂氧素对多药耐药相关蛋白的影响，及其与哮喘治疗的相关性。结果发现，在培养的巨噬细胞中，脂氧素能明显抑制多药耐药相关蛋白的表达，并能促进噬酸性粒细胞的凋亡。同时，本发明在整体实验中还发现，脂氧素配合激素能降低重度哮喘小鼠的气道反应性，同时，肺功能降低和肺组织形态学变化都明显较单用激素治疗组轻。
本发明披露了脂氧素能明显提高激素依赖型哮喘个体对激素的敏感性，与激素合用能有效治疗激素依赖性哮喘。脂氧素能作为治疗激素依赖型哮喘的药物，用于治疗激素依赖型哮喘。
本发明实验资料
试剂配制
脂多糖和脂氧素分别于临用前用1640培养基配成相应浓度。
细胞实验
实验方法
1)巨噬细胞株：分别培养小鼠RAW267.4巨噬细胞株，细胞常规培养后接种于6孔板，无血清培养基培养18小时后，按下列分组进行实验：空白对照组、脂多糖(100ng/ml)组、脂多糖(100ng/ml)+脂氧素(100nmol/L)组，刺激24小时后，分别采用Real time PCR和酶联免疫法，检测细胞内多药耐药相关蛋白的基因与蛋白表达。
2)原代巨噬细胞：常规方法提取小鼠腹腔巨噬细胞，细胞常规培养后接种于6孔板，无血清培养基培养18小时后，后续实验同于上述巨噬细胞株。
3)巨噬细胞白三烯外排实验：采用小鼠RAW267.4巨噬细胞株，上述方法培养和分组后，采用酶联免疫法，检测细胞上清液中的白三烯C4含量。
实验结果
1)Real time PCR和酶联免疫法分别显示，脂多糖刺激能明显促进小鼠巨噬细胞株和原代巨噬细胞多药耐药相关蛋白在基因水平和蛋白水平的表达，而加用脂氧素后，多药耐药相关蛋白的表达明显减少，与单用脂多糖组相比差异具有统计学意义(见图1)。
2)酶联免疫法显示，脂多糖作用组白三烯的含量明显高于对照组，而脂氧素作用组，此含量显著低于单用脂多糖组(见图2)。
实验证实脂氧素能明显抑制多药耐药相关蛋白的表达，同时伴有细胞白三烯的外排的减少。
整体实验
实验方法
1)实验动物：6～8周龄雌性清洁级Balb/C小鼠，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心，体重17-20g。采用随机数字表法将小鼠分成4组，分别为空白对照组、模型组、激素治疗组和脂氧素与激素合用组。每组动物12只。
2)重度哮喘模型制备：于实验第1天和第14天向小鼠腹腔内注射致敏液(0.08％的卵白蛋白和等体积液态铝混合)0.2ml，第15天起将小鼠置于透明密闭容器中，用1％的卵白蛋白溶液10ml雾化吸入，每次20分钟，隔日1次，连续给35天，并分别于21、35和49天以1.0×109pfu/L的呼吸道合胞病毒50μl滴入鼻腔，每日观察小鼠症状。空白对照组以磷酸盐缓冲溶液代替卵白蛋白；
3)给药方式：雾化吸入
4)气道反应性检测：于最后一次滴入呼吸道合胞病毒4天后，用乙酰胆碱激发，测定气道反应性。记录至少10次峰反应的肺变量，气道反应性以肺阻力(RL)表示。
5)肺功能检测：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，行气管切开，套管针置入、固定。用4号半婴儿头皮针穿刺小鼠尾静脉。将小鼠放入密闭的体描箱中，连接吸气管、呼气管和测压管。机械通气参数：呼吸频率90次/min、潮气量5～6ml/kg，水封瓶调节呼气末压力为-8cm H2O，记录跨肺压、流速、潮气容积的变化，计算用力最大呼气流速(PEF)、第0.4秒用力呼气积/用力肺活量(FEV0.4/FVC)等指标变化，测定容PEF、FEV0.4/FVC时用5倍正常潮气量机械通气，以8cm H2O负压辅助呼气。
6)气道壁厚度测定：处死动物后取右肺中叶肺组织，用体积分数为75％的乙醇脱水、石蜡包埋、连续切片，常规经苏木素-伊红染色，采用计算机图像分析系统测定气道壁内、外径，以及平滑肌层厚度。
实验结果
1)气道反应性检测结果显示，随着乙酰胆碱浓度的增加，肺阻力亦逐渐升高，且模型组明显高于空白对照组；脂氧素合用组的肺阻力明显低于单用激素组，同时，最大呼气流速和第0.4秒用力呼气积/用力肺活量较高。差异具有显著性意义(见表1)。
表1脂氧素对重度哮喘小鼠的气道反应性的影响
2)小鼠气道厚度检测结果见表2，可见，重度哮喘模型组的小鼠气道壁内径/外径比值最高，气道平滑肌的最厚；而合同脂氧组比单用激素组的小鼠气道平滑肌厚度明显较低。
表2脂氧素对重度哮喘小鼠的气道厚度的影响
实验证实脂氧素能明显抑制重度哮喘小鼠对糖皮质激素的依赖，提高了激素治疗的效果。
正常情况下，急性炎症反应是一个自限性过程，在体内不同促炎、抗炎及促缓解介质的精确调控下，多种炎性细胞共同构建了炎症从启动到消退的过程。近年来，基于促进炎症缓解而防治炎症相关疾病的研究日益增长。脂氧素是机体内源性的促炎症缓解的脂质之一，主要在炎症等病理过程中通过跨细胞途径，经不同脂加氧酶按顺序催化花生四烯酸及其代谢产物而生成。
多药耐药相关蛋白是耐药相关基因表达产物之一，它们能够依靠水解ATP所产生的能量将阴离子结合物、阴离子药物(如米托蒽醌)以及能与酸性配基结合的中性药物(如GSH、葡萄糖醛酸盐或硫酸盐)转运到细胞外，从而降低细胞内的药物浓度，导致机体对药物的耐受。以往的研究多集中在多药耐药相关蛋白相关的肿瘤耐药机制和防治。
本发明揭示了脂氧素对多药耐药相关蛋白的影响，及其与哮喘治疗的相关性。结果发现，在培养的巨噬细胞中，脂氧素能明显抑制多药耐药相关蛋白的表达，并能促进噬酸性粒细胞的凋亡。同时，本发明在整体实验中还发现，脂氧素配合激素能降低重度哮喘小鼠的气道反应性，同时，肺功能降低和肺组织形态学变化都明显较单用激素治疗组轻。
本发明披露了脂氧素能明显提高激素依赖型哮喘个体对激素的敏感性，与激素合用能有效治疗激素依赖性哮喘。脂氧素能作为治疗激素依赖型哮喘的药物，用于治疗激素依赖型哮喘。
附图说明
图1为脂氧素对小鼠巨噬细胞多药耐药相关蛋白表达的影响，其中，上方的A图为基因水平变化；下方的B图为蛋白水平变化；
图2为脂氧素对巨噬细胞分泌白三烯的影响。
具体实施方式
实施例1
试剂配制
脂多糖和脂氧素分别于临用前用1640培养基配成相应浓度。
细胞实验
1)巨噬细胞株：分别培养小鼠RAW267.4巨噬细胞株，细胞常规培养后接种于6孔板，无血清培养基培养18小时后，按下列分组进行实验：空白对照组、脂多糖(100ng/ml)组、脂多糖(100ng/ml)+脂氧素(100nmol/L)组，刺激24小时后，分别采用Real time PCR和酶联免疫法，检测细胞内多药耐药相关蛋白的基因与蛋白表达。
2)原代巨噬细胞：常规方法提取小鼠腹腔巨噬细胞，细胞常规培养后接种于6孔板，无血清培养基培养18小时后，后续实验同于上述巨噬细胞株。
3)巨噬细胞白三烯外排实验：采用小鼠RAW267.4巨噬细胞株，上述方法培养和分组后，采用酶联免疫法，检测细胞上清液中的白三烯C4含量。
实验结果
1)Real time PCR和酶联免疫法分别显示，脂多糖刺激能明显促进小鼠巨噬细胞株和原代巨噬细胞多药耐药相关蛋白在基因水平和蛋白水平的表达，而加用脂氧素后，多药耐药相关蛋白的表达明显减少，与单用脂多糖组相比差异具有统计学意义(见图1)。
2)酶联免疫法显示，脂多糖作用组白三烯的含量明显高于对照组，而脂氧素作用组，此含量显著低于单用脂多糖组(见图2)。
实验证实脂氧素能明显抑制多药耐药相关蛋白的表达，同时伴有细胞白三烯的外排的减少。
实施例2
整体实验
1)实验动物：6～8周龄雌性清洁级Balb/C小鼠，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心，体重17-20g。采用随机数字表法将小鼠分成4组，分别为空白对照组、模型组、激素治疗组和脂氧素与激素合用组。每组动物12只。
2)重度哮喘模型制备：于实验第1天和第14天向小鼠腹腔内注射致敏液(0.08％的卵白蛋白和等体积液态铝混合)0.2ml，第15天起将小鼠置于透明密闭容器中，用1％的卵白蛋白溶液10ml雾化吸入，每次20分钟，隔日1次，连续给35天，并分别于21、35和49天以1.0×109pfu/L的呼吸道合胞病毒50μl滴入鼻腔，每日观察小鼠症状。空白对照组以磷酸盐缓冲溶液代替卵白蛋白；
3)给药方式：雾化吸入
4)气道反应性检测：于最后一次滴入呼吸道合胞病毒4天后，用乙酰胆碱激发，测定气道反应性。记录至少10次峰反应的肺变量，气道反应性以肺阻力(RL)表示。
5)肺功能检测：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后，行气管切开，套管针置入、固定。用4号半婴儿头皮针穿刺小鼠尾静脉。将小鼠放入密闭的体描箱中，连接吸气管、呼气管和测压管。机械通气参数：呼吸频率90次/min、潮气量5～6ml/kg，水封瓶调节呼气末压力为-8cm H2O，记录跨肺压、流速、潮气容积的变化，计算用力最大呼气流速(PEF)、第0.4秒用力呼气积/用力肺活量(FEV0.4/FVC)等指标变化，测定容PEF、FEV0.4/FVC时用5倍正常潮气量机械通气，以8cm H2O负压辅助呼气。
6)气道壁厚度测定：处死动物后取右肺中叶肺组织，用体积分数为75％的乙醇脱水、石蜡包埋、连续切片，常规经苏木素-伊红染色，采用计算机图像分析系统测定气道壁内、外径，以及平滑肌层厚度。
实验结果
1)气道反应性检测结果显示，随着乙酰胆碱浓度的增加，肺阻力亦逐渐升高，且模型组明显高于空白对照组；脂氧素合用组的肺阻力明显低于单用激素组，同时，最大呼气流速和第0.4秒用力呼气积/用力肺活量较高。差异具有显著性意义(见表1)。
表1脂氧素对重度哮喘小鼠的气道反应性的影响
Figure G2009102731763D00091
2)小鼠气道厚度检测结果见表2，可见，重度哮喘模型组的小鼠气道壁内径/外径比值最高，气道平滑肌的最厚；而合同脂氧组比单用激素组的小鼠气道平滑肌厚度明显较低。
表2脂氧素对重度哮喘小鼠的气道厚度的影响
Figure G2009102731763D00092
实验证实脂氧素能明显抑制重度哮喘小鼠对糖皮质激素的依赖，提高了激素治疗的效果。

Claims (2)

1.脂氧素在制备用于治疗激素依赖型哮喘的药物中的应用。
2.一种用于治疗激素依赖型哮喘的药物，其特征在于含有有效成分脂氧素。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104305997A (zh) * 2014-08-21 2015-01-28 华南理工大学 用于检测生物体肺功能的装置

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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
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