CN102014922A - 山楂酸通过抑制cox-2用于治疗病症和其症状的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及山楂酸或者其天然、合成或半合成的富含山楂酸的混合物或者含有所述酸的组合物用于治疗和COX-2活化作用有关的病变的用途，预期特别是治疗针对关节炎、类风湿性关节炎、纤维肌痛、坐骨神经痛和其它难以诊断的关节疾病的症状和/或再生治疗的用途。本发明还涉及相关的局部给药。

Description

山楂酸通过抑制COX-2用于治疗病症和其症状的用途
本发明涉及山楂酸和其任意衍生物用于治疗病理学过程的用途包括抑制内源性环加氧酶-2(COX-2)。更特别是用于关节炎、类风湿性关节炎、纤维肌痛、坐骨神经痛和其它关节不适的症状和/或无症状的治疗。本发明还涉及含有山楂酸，其任意衍生物，或天然、合成或半合成的富含山楂酸或其任意衍生物的混合物的组合物的局部给药。
发明背景
石竹素(3-β-羟基-12-oleanen-28-oic酸)是一种普遍分布于植物界的三萜酸类物质。因此，美国农业部(USDA)植物化学数据库在差不多一百多种植物中登记了它的存在，其中就有油橄榄(Olea europaea)，以及一系列经证实的生物学活性(防流产、防龋齿、抗生育、抗肝毒素、消炎、抗肿瘤、防癌、强心、利尿、保肝和子宫收缩活性)。
山楂酸(2-α，3-β-二羟基oleanen-12-en-28-oic酸)，也称为马斯里酸(crataegolicacid)，在自然界分布很少，已查明其在几十种植物中存在。尽管其稀缺导致对其研究不足，但它的抗组胺和消炎活性是已知的。从油橄榄果实表面蜡状物中通过预先用氯仿洗过的橄榄的甲醇提取而分离石竹素和山楂酸已有描述[Bianchi，G.，Pozzi，N.和Vlahov，G.Phytochemistry(1994)37，205-207]。这种类型酸的分离可通过高速反流色谱完成(HSCCC)[Du，Q.Z.，Xiong，X.P.和Ito，Y.；Journal of Liquid Chromatography(1995)18，1997-2004]。
Figure BPA00001232194100011
现如今，已有许多专利，其中山楂酸作为一种活性成分：抗肿瘤剂，US2003153538或WO 0252956；脱噬作用诱导物，WO 03057224；降低食欲的食物，WO 203039270和WO 03011267；皮肤外用脱色剂，US 2003133958；血管损伤，WO 02078685。
在一些出版物中，还表明这种三萜类物质具有消炎活性(Marquez-Martin A，De La Puerta R，Femandez-Arche A，Ruiz-Gutierrez V，Yaqoob P.Cytokine.(2006)Dec；36(5-6)：211-7)。在该文献中，还描述了山楂酸在LPS-刺激的鼠腹膜巨噬细胞中抑制IL-6和TNFα的释放及NO和过氧化氢(ROS)的生成，本作者在人类外周血单核细胞并没有发现这种作用。不管怎样，这些差异性清楚地显示的是所述应答不是均一的，并且因此是不可预测的，有必要研究每种模型和/或组织类型。
另一方面，前列腺素是由花生四烯酸(以及称作花生酸的其它C20不饱和脂肪酸)通过广泛分布的酶环加氧酶(COX)代谢途径合成，该酶循环和使氧导入前体中以生成前列腺素，其全部得自前列腺烷酸。有两种清楚鉴定的不同环加氧酶形式，其为COX-1和COX-2。COX-1在许多组织中组成性表达，在所述组织中它调节重要的生理功能。例如，COX-1催化通过内皮和胃粘膜生成前列腺素，其分别产生抗凝血和细胞保护作用。COX-2是可诱导形式，在多数组织中是检测不到的。COX-2是特定的异构体形式，来自和编码COX-1不同的基因。COX-2的表达在炎症发展过程中增加，但是其组成性表达在除了大脑之外的多数器官中保持低水平。
前列腺素，特别是PGE2，完成多重生理学和病理生理学功能。因此，低浓度的PGE2保持正常胃粘膜的完整和液体及电解质内环境平衡，而该介质的水平在炎症过程中被涉及。
其它花生四烯酸的代谢产物是异前列烷(isoprostanes)。这些代谢产物和前列腺素结构相似，并且它们是通过质膜中脂肪酸的氧化而产生的。
现如今，已经知道异前列烷是最好的细胞和全身系统的氧化应激的标记物之一。由于它显示出山楂酸的抗氧化活性，因此该物质有可能抑制异前列烷的形成(Marquez-Martin A，De La Puerta R，Femandez-Arche A，Ruiz-Gutierrez V，Yaqoob P.Cytokine.(2006)Dec；36(5-6)：211-7；Montilla MP，Agil A，Navarro MC，Jimenez MI，Garcia-Granados A，Parra A，Cado MM.Planta Med.(2003)May；69(5)：472-4)。
根据马里兰州医学中心大学(University of Maryland Medical Center)关于用于类风湿性关节炎的治疗，这种治疗能够主要使用COX-2抑制剂完成，表明“COX-2抑制剂阻断引起炎症的称作COX-2的酶”，但是它们没有预期局部给药的治疗效力。最初，认为这种类型的药物与非甾体类消炎药物(NSAIDs)一样好地起作用，但是具有较少的胃部问题。然而，许多心脏病发作和中风的报导使得FDA重新评估COX-2的风险-益处的关系。罗非克西
Figure BPA00001232194100031
和伐地克西
Figure BPA00001232194100032
在报导导致服用它们的患者心脏病发作之后从美国市场上被去除。塞来昔布
Figure BPA00001232194100033
仍然有售，但是使用了醒目的警示标签，并被建议以最小剂量和尽可能短的时间内处方使用。患者必须向医生询问该药物对于他们是否是安全并且适合。
抗疟药物例如羟氯喹
Figure BPA00001232194100034
和柳氮磺吡啶
Figure BPA00001232194100035
一般和氨甲蝶呤联用同样有益。但是需要服用几周或几个月后该药物才显示效果，并且由于它们具有毒副作用，这些药物使用时必须强制进行经常性的血液检测。
肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂是一类相对较新的用于治疗自身免疫失调的药物，尤其它们是：依那西普
Figure BPA00001232194100036
英夫利昔
Figure BPA00001232194100037
和阿达木单抗
Figure BPA00001232194100038
和
Figure BPA00001232194100039
是可注射药物，而英夫利昔是静脉内给药。
另一个相对新的药物是可注射的阿那白滞素
Figure BPA000012321941000310
是一种阻断炎性蛋白白细胞介素-1的人造蛋白质。该药物用于减少超过18岁的患者中活跃类风湿性关节炎从中度向重度的发展，这些患者对一种或多种DMARD(缓解病情的抗风湿药物)没有响应。
Figure BPA000012321941000311
能够用于和另一种DMARD或和肿瘤坏死因子抑制剂一起使用。
其它抑制免疫系统的药物，例如硫唑嘌呤和环磷酰胺
Figure BPA000012321941000313
有时候也可以用于对其它治疗无效的患者。这些药物有毒副作用，通常用于严重的类风湿性关节炎病例。
人们并不知道存在有效的、易于给药的用于关节炎、类风湿性关节炎或其它难以诊断的关节问题的症状和/或再生的治疗，这种治疗直接作用于软骨细胞并且达到有效的快速且消除指出的症状时间长的治疗效果。
发明详述
本发明描述了山楂酸和其任意衍生物用于治疗包括环加氧酶-2(COX-2)酶的活化的病症的用途。
在该意义上，在本发明中其显示了山楂酸作为在人类软骨细胞诱导COX-2的活性的抑制剂的活性，并因此该酸在治疗包括所述COX-2酶活化的疾病中的用途。
还显示了山楂酸不仅能够减轻与这类的疾病相关的炎症，还能介入症状的减轻或消除，以及介入显示出持久的效果的软骨细胞组织再生。
作为前面所提到的结果，本发明涉及使用包括山楂酸或其任意衍生物的组合物对疾病的症状和/或再生治疗，这些疾病例如关节炎、类风湿性关节炎、纤维肌痛、坐骨神经痛、跳跃综合征(jumper syndrome)、跖趾骨关节隆凸(拇囊炎)，和响应对COX-2特异性的NSAIDs(非甾族类消炎药物)的方法。该治疗应用简单的给药方法来进行，并且由于尤其直接作用于软骨细胞或受感染组织，因而是有效的。特别地，在本发明中其显示出对关节炎和类风湿性关节炎快速且延长的症状消失的症状和/或再生治疗的有效性。
在本发明中，其显示该治疗效果，即使使用局部给药也如此。强调该事实是重要的，因为COX-2的其它NSAIDs抑制剂，当它们局部给药时，没有显示出效果，此外，它们通过其它方式给药具有严重的副作用。
山楂酸可以天然获得或合成得到。含有该山楂酸的组合物在它们定义中包括使用含有山楂酸的植物提取物，植物或其果实的工业处理的副产物的提取物，或者是含有比原始存在于植物中的更高浓度的山楂酸植物的工业副产品。例如，但并非限于此，木樨属(Olea genus)植物的提取物，更特别的是O.europea种。除了这种类型的山楂酸，也可以使用其衍生物，其中在本发明中的衍生物指它们在药典中接受的的盐或衍生物，它们有利于在待治疗的组织中的吸收和输送。更特别地，它们的钠盐、钾盐或来自生物可接受胺的盐。
这些事实通过以下进行的试验显示：
●已测定山楂酸和其衍生物对COX-2蛋白在原代人类外周血单核细胞中表达的作用。
●已测定山楂酸和其衍生物对COX-2在外周血单核细胞中的酶活性的作用。
●已测定山楂酸和其衍生物对在原代人类外周血单核细胞中的异前列烷形成的作用。
●已测定山楂酸和其衍生物对PGE2在原代人类软骨细胞中的释放的作用。
●已测定山楂酸和其衍生物对PGE2在原代大鼠星形胶质细胞和SK-S-NH成神经细胞瘤型细胞系中的释放的作用。
●已测定山楂酸和其衍生物对在原代星形细胞中的COX-2基因转录调节以及COX-2蛋白表达的作用。
●已经对患萎缩、关节炎、关节炎、纤维肌痛过程的患者中实施的临床试验，尤其证明“体内”治疗，特别是局部给药的效果。
有必要考虑到，有的时候对于被治疗的患者预先给出的诊断不是十分精确，有时候症状仅是用于前面提到的诊断的媒介。
由于COX-2的功能性及PEG2的生成可以被调节至多个水平，并且山楂酸抑制PEG2在原代人类单核细胞中的生成，因此作为使用特定动物模型的研究之前的在前步骤，详细研究了这种三萜类在不同的“体外”细胞类型中对COX-2的功能和表达的影响。因此，首次显示出山楂酸在人类软骨细胞中诱导的COX-2的抑制的“体外”作用，尤其实施了对具有关节炎、关节炎或纤维肌痛的患者的全面临床研究，显示山楂酸和其盐即使仅简单地在显示这些症状的部位进行局部治疗都有令人惊奇的效果。事实上，虽然在所有具有关节炎的患者中都观察到症状的改善，在那些小于60岁的人中，在少于一个月的治疗中就完全缓解症状。另外，在所有病例中，在十分有症状的方式观察到关节综合征的典型的钙化的逐渐再吸收。
在超过80％的病例中，对于症状的有效性在24/48小时内和2至6次局部施用后开始明显。除了在对有明显炎症的患者的关节(比如患者的手指)症状(疼痛和僵硬)的改善以外，在数分钟内注意到在被治疗区域中的温度升高，明显提示患者立即开始经受血液循环的增大。
已经证实山楂酸是较强的免疫应答的免疫调节剂(inmunomodulator)，因为它抑制经由TCR受刺激的T淋巴细胞的激活和增殖，并且除了抑制在原代单核细胞中的前列腺素E2(PGE2)的生成外，还抑制促炎症反应细胞因子TNFα和IL-6的生成。而且，还观察到能抑制先天性和后天性免疫应答的山楂酸的浓度显著低于肿瘤细胞系中诱导编程性细胞凋亡所需要的浓度。
在本发明中，以及作为在实施例部分中所得到的结果的成果，显示如下：
1.山楂酸抑制PGE2在人类单核细胞中的生成。
2.山楂酸抑制COX-2的酶活性。
3.山楂酸不能抑制COX-2基因启动子转录活化和蛋白表达。
4.高剂量的山楂酸抑制PGE2在软骨细胞和来自成神经细胞瘤的细胞中的生成。
5.山楂酸抑制异前列烷在人类单核细胞中的生成。
6.山楂酸抑制IL-6在人类单核细胞和软骨细胞中的生成。
7.通过MA对IL-6生成的抑制作用不通过IL-6基因转录抑制而产生。
考虑到骨之间的连接处由不含毛细管或神经末梢的关节软骨组织覆盖。在关节移动过程中，骨间的摩擦通过关节软骨被最小化，该关节软骨包含软骨细胞，占总体积的1-2％，其功能是合成胞外基质的蛋白。这种基质含有70-80％的水，其使其可具有减轻压力的结构。水分子和硫酸化粘多糖间的静电作用是保持软骨水合作用所必需的。因此，由透明质酸聚合物润滑的蛋白多糖是保持软骨完整的基础。糖胺聚糖和蛋白多糖与软骨细胞产生的胶原纤维保持着亲密联系，同时软骨细胞也产生蛋白多糖。
为了这些，本发明的第一个方面涉及山楂酸(在其如上所述的最宽定义内)或任意衍生物在用于制备治疗包括COX-2活化的病症的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及山楂酸或其任意衍生物在制备还有利于软骨细胞组织再生的药物方面的用途。
在本发明的一个优选的具体实施方式中，包括COX-2活化和/或其中产生软骨细胞组织再生的病症选自：关节炎、类风湿性关节炎、坐骨神经痛、纤维肌痛、拇指外翻或者跖趾骨关节隆凸(拇囊炎(bunion))、髌骨腱炎(跳跃膝)或其它特别响应对COX-2特异性的NSAIDs的病症。一个更特优选的具体实施方式包括其用于治疗关节炎或类风湿性关节炎的用途。
本发明另一个方面涉及含有在其最广泛含义中的山楂酸(其盐、代谢物、包含它的植物提取物、植物或其果实工业加工中的副产品的提取物，或工业副产品或任何这些组分的组合)或其任意衍生物的药物组合物用于治疗包括COX-2活化的疾病。更特别地，用于通过抑制这种COX-2来治疗包括COX-2酶在人或动物软骨细胞中的活化的疾病。
在一个优选的实施方案中，所述组合物还含有石竹素和/或药学可接受的载体。更优选的是，山楂酸和石竹素的比例为2∶1至6∶1。
即，山楂酸，它的盐，药学可接受的衍生物或其前药，以其治疗有效量，和一种或多种载体、佐剂或药学可接受的赋形剂一起配制成适当的药物组合物。更特别的是，山楂酸或山楂酸与石竹素混合物占组合物总量的0.5％-10％的比例，更优选是0.5％-5％，以及特别优选是1％-3％。
该组合物可以以不同的方式给药，例如，但不限于，腹膜内、口服、颊内、直肠、肌内、局部、皮下、关节内给药或通过吸入给药。
更优选的是，通过局部、皮下或通过关节内渗入(articular infiltrations)给药。在另一个优选的具体实施方式中，所述组合物以适合于局部给药的形式存在。
在每种情况下，组合物将适合于使用的给药类型，因此，以上所述的组合物可以是片剂、丸剂、胶囊、溶液、乳剂、霜剂、身体乳膏、软膏、吸入剂、喷雾剂、栓剂或任何其它临床允许给药的并治疗有效剂量的形式。更优选的是，是溶液、乳剂、霜剂、身体乳膏或软膏。
在另一个优选的具体实施方式中，该组合物包括得自木樨属的植物提取物或该木樨属植物工业副产品的山楂酸或其任意衍生物。
药学可接受的衍生物是指任何的盐、药学可接受的或在其它任何在给药后能够提供(直接或间接)山楂酸的化合物。
在本说明书使用的意义上，“药学可接受载体”指的是那些物质或物质的组合，这些物质在药学领域公知，用于生产给药的药物剂型，包括固体或液体、溶剂、表面活性剂等等。
根据说明书和权利要求书，术语“包括”及其变型并不用于排除其它技术特征、添加物、组分或步骤。对于专家而言，本发明的其它对象、优势以及特征在一定程度上由说明书和本发明的实践推论得到。以下实施例和附图将作为说明，并且不会对本发明给予限制。
附图说明
图1显示山楂酸对PGE-2在人类单核细胞中的生成的作用。
图2显示山楂酸对COX-2在人类单核细胞中的表达的作用。
图3显示山楂酸对COX-2在人类单核细胞中的活性的作用。
图4显示山楂酸对PGE-2在SK-N-SH细胞中的生成的作用。
图5显示山楂酸对PGE-2在原代星形细胞中的生成的作用。
图6显示山楂酸对转录COX-2的活性的作用。
图7显示山楂酸对COX-2在人类单核细胞中的表达的作用。
图8显示山楂酸对PGE-2在软骨细胞中的生成的作用。
图9显示山楂酸对IL-6在软骨细胞中的生成的作用。
图10显示山楂酸对PGE-2在单核细胞中的生成的作用。
图11显示山楂酸对由P+1诱导的IL-6启动子的活性的作用。
图12显示山楂酸对由IL-1诱导的IL-6启动子的活性的作用。
图13显示山楂酸对异前列烷在原代单核细胞中的生成的作用。
实施例
接下来，本发明将通过发明人进行的试验加以说明，该试验尤其使山楂酸的效果和活性更清楚并显示上面所描述的内容。
使用的化合物、材料和方法对于所有实施例进行一般地描述：
1.化合物
山楂酸以其钠盐形式使用，该盐溶解在DMSO(二甲基亚砜)中形成母液(10和50mM)。培养物中DMSO最终最大浓度为1％，不会干扰测量的参数。
2.细胞培养
●外周血的原代单核细胞的分离和培养。来自健康成人志愿者供体的外周血单核细胞(PBMC)通过用Ficoll-Hypaque静脉血离心通过密度梯度进行分离。单核细胞通过与塑料品粘合进行分离，随后在24孔盘中培养，密度50,000个细胞/ml(用于酶免疫测定法(EIA))，和在6-孔盘中温育(用于免疫印迹分析法)。
●人类原代软骨细胞的培养。软骨细胞购自Promocell(德国，Heidelberg)，并在对该类型细胞进行调节的培养基中培养。该细胞在24-孔盘中培养用于测量PGE-2和IL-6。
●大鼠原代星形细胞的培养。星形细胞原代培养物由新生大鼠(一日龄)的脑制得。脑的上半部分打开，小心将脑膜与成纤维细胞分离以避免污染培养物。将大脑皮层离解，得到细胞悬浮液，其在调节用于星形细胞培养的DMEM中培养。培养物在6-孔盘中扩增并且在3-4代后测定PGE2的生成。
●细胞系的培养。SK-N-SH(American Tissue Culture collection，HTB 11)是一种来自人类成神经细胞瘤的细胞系，并且在添加2mmol/L的L-谷氨酰胺、抗生素和10％FCS的DMEM中指数增长。细胞在37℃，5％CO2气氛下培养。
3.蛋白质印迹法
细胞(原代单核细胞或SK-N-SH)在每种情况下所指示地在50μl(20mMHepes pH 8.0，10mM KCl，0.15mM EGTA，0.15mM EDTA，0.5mM Na3VO4，5mMNaF，1mMDTT，亮抑酶肽1μg/ml，胃蛋白酶抑制剂0.5μg/ml，抑酶肽0.5μg/ml，1mM PMSF和0.5％NP-40)溶胞液中受激。蛋白浓度通过布拉德福试剂(Bio-Rad，Richmond，CA，USA)加以测定，并且30μg蛋白质在Laemmli溶液中煮沸并且在10％浓度下在SDS/聚丙烯酰胺凝胶中经受电泳。分离的蛋白质转移至硝基纤维素膜(0.5A，100V在4℃)上一小时。该膜在含有0.1％吐温20和5％粉末状脱脂奶的TBS中封闭。对不同蛋白的免疫检测采用以下方法进行：通过使用不同初级抗体温育两小时，然后用相应的用过氧化物酶标记的次级抗体温育一个半小时，并通过使用化学发光系统ECL(GE Healthcare LifeSciences)显影。
4.瞬间转染(Transitory transfections)和萤光素酶分析
SK-N-SH细胞应用JetPei试剂(Polyplus transfection，法国)根据厂商的说明用质粒COX-2-Luc及IL-6-Luc转染。两种质粒都含有被指出引导萤光素酶基因作为转录活化的标记的基因启动子。细胞转染后根据实验在正常条件下保持培养24或48小时，并它们在每个情况下用相同的方式进行刺激。刺激后，细胞在溶胞缓冲液(25mM三磷酸盐pH 7.8，8mM MgCl2，1mM DTT，1％TtritonX-100，和7％甘油)中室温下溶解15分钟。蛋白提取物中萤光素酶活性通过使用光度计Autolumat LB9510(Berthold)按照来自Promega萤光素酶试验的系统说明(Madison WI，USA)进行检测。
5.PGE2在不同细胞类型中的生成和COX-2活性的测定
软骨细胞、单核细胞和星形细胞培养物用相应的活化剂(IL-1，LPS或PMA+lonomicine)在所指出的时间期间在几种浓度山楂酸存在或不存在情况下进行刺激。而后，收集上清液以检测受刺激的细胞释放的PGE2的量。PGE2应用Assay Designs的EIA系统(产品目录号901-001)按照厂商说明进行测定。
为检测COX-2活性，细胞首先用LPS-刺激(10ng/ml)24小时以诱导COX-2蛋白的细胞表达。此后培养物洗涤并且在15分钟时间里加入新鲜的不含血清培养基、山楂酸(不同浓度)和花生四烯酸(AA)。在此过程中，COX-2酶活性通过培养物所含AA产生PGE2的能力进行测定。
6.异前列烷和IL-6在单核细胞中生成的测定
单核细胞用与生成PGE2(LPS刺激24小时)同样的方式进行刺激，由细胞释放的8-异-前列腺素F2α(异前列烷)或者IL-6分别通过来自Cayman(USA)(产品目录号516351)或Pelikine(产品目录号RDI-M1916clb)的系统EIA根据厂商说明进行测定。
实施例1
山楂酸(MA)抑制COX-2酶活性和PGE 2 在LPS-刺激的单核细胞中的生成
在炎症过程中单核细胞产生大量的促炎症的细胞因子，如TNFα、IL-1β和IL-6，以及炎症介体，尤其如白三烯和前列腺素。已经证实山楂酸(MA)抑制PGE2在采自外周血的LPS刺激的人类单核细胞中的生成(图1)。
为鉴定MA对PGE2生成的作用机理，一个特别重要的寻找原因和能够预测应用的方面，进行了一系列用于研究MA对COX-2基因的转录活性及该蛋白表达的影响的实验。首先，外周血中的单核细胞在增长剂量的MA存在下进行LPS刺激，12小时后经受电泳的细胞特性被提取出以通过蛋白质印迹法以检测COX-2的表达。在图2中可以看出MA不抑制由LPS诱导的COX-2的表达(图2)。
对于MA作为COX-2活性的抑制剂的可能性，通过使用LPS处理单核细胞24小时我们诱导COX-2的表达。该时间后，细胞用不含血清的培养基洗三次，用增长剂量的MA培养15分钟。此后，加入花生四烯酸(15μM)，再过15分钟，通过EIA测定向PGE2的转化。在图3中可以看出MA以依赖剂量方式抑制COX-2酶活性，这解释了其对PGE2在该细胞类型中生成的影响(图3)。
实施例2
山楂酸(MA)对PGE 2 在原代星形细胞和SK-N-SH细胞系(成神经细胞瘤)中 的生成的双重影响
接下来，MA对COX-2基因的启动子的转录活性及对SK-N-SH细胞蛋白质的表达的作用进行研究。这些细胞短暂地用含有由萤光素酶基因的质粒(通过COX-2基因的完整启动子定向)转染。转染后24小时，这些细胞用递增剂量的MA温育并用PMA+lomomicine刺激6小时。其后，萤光素酶活性在细胞溶解中测定，观测到MA不影响COX-2基因的转录活性(图5)。
COX-2蛋白可诱导的表达在SK-N-SH细胞中不受MA的存在的影响(图6)。
实施例3
山楂酸(MA)对PGE2和IL-6在用IL-1刺激的人类软骨细胞中的生成的作用
为了确定MA是否对在另一类在炎症现象中涉及的细胞类型中发生的PGE2的生成的作用，对山楂酸对原代人类软骨细胞的消炎活性进行了测定。细胞用递增剂量的MA处理而后用IL-1(10U/ml)刺激以测定PGE2和IL-6的释放。在图7(图7)中显示在软骨细胞中用IL-1刺激后MA对PGE2的生成具有双重作用。低剂量(0.1和1μg/ml)时PGE2的生成增加，而高剂量(25和50μg/ml)时则观察到完全抑制由IL-1诱导的这种前列腺素的释放。
相反地，在相同的细胞中，以依赖浓度的方式，IL-6的生成则完全被MA抑制(图8)。
这些结果总的来说与先前在人类单核细胞(在那里LPS诱导的IL-6被MA抑制)中发现的结果符合(图9)。
接下来，研究了山楂酸对IL-6的释放的抑制作用是否是由于基因编码所述蛋白质的转录作用。因此，产生IL-6的SK-N-SH细胞，用含有萤光素酶基因的质粒(其通过IL-6完整启动子定向，并且由IL-1或PMA+离子霉素的组合在递增剂量的MA存在或不存在下进行刺激)进行转染，萤光素酶活性在处理4小时后在细胞提取物中测定。在图10和图11(图10和图11)中显示MA不抑制IL-1启动子的转录活性，因此对IL-6释放的抑制活性肯定是由于在转录后水平的抑制作用。
实施例4
山楂酸(MA)对异前列烷在LPS刺激的人类单核细胞中生成的作用
异前列烷，如内过氧化物(endoperoxide)8-异-前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)，是花生四烯酸氧化产物的代谢物，现如今被认为是氧化应激的最佳标记物。图12(图12)显示MA以依赖浓度方式抑制在人外周血的单核细胞在LPS刺激后生成的8-iso-PGF2α的释放。该数据证实了先前被这些作者们所说明的MA的抗氧化活性。MA对异前列烷的产生的抑制能力比生育酚和trolox更高，并且和白藜芦醇相当(图13)。
实施例5
通过局部给药山楂酸钠盐和各种比例的山楂酸钠盐和石竹素的混合物和山楂酸和石竹素各种比例的混合物(70-85％的山楂酸和30-15％的石竹素)进行临床研究。在使用盐的情况中，局部给药使用以身体乳膏(Body milk)形式适当分布来进行，如果使用自由游离酸，则采用Beeler base来给药。身体乳膏含有大约0.5-1.5％的活性成分(盐)，霜剂含有大约1.5-2.5％的活性成分(游离酸)，以及富含石竹素和山楂酸的压榨橄榄残渣的提取物。
钠盐通过溶于甲醇的MeONa或NaOH水性溶液根据常规实验室方法进行碱化处理得到。
局部处理得到的部分结果如表1所示：
Figure BPA00001232194100121
表1
阳性结果表示在局部给药后等待12至24小时，关节的不适的显著减轻和灵活性明显增加，其在软骨区域中显示了有效的消炎效果。在一些病例中，症状的消失是持久性的，其显示了软骨细胞的再生过程。令人惊奇的是，在许多病例中，就症状来说，第一次施用就达到了以上效果。
在超过百名患者中，仅有两个结果标为“阴性”，特别地进行评估。第一位是位60来岁的女性，患有20年膝关节和足关节炎史，而在两个月治疗后，她告知足部不适有了显著的改善。第二个病例对应于一位超过85岁的男性，其膝关节严重不适，在治疗中没有注意到任何改善。

Claims (11)

1.山楂酸或其任意衍生物在制备用于治疗包括COX-2活化的病症的药物中的应用。
2.山楂酸或其任意衍生物在制备用于软骨细胞组织再生的药物中的应用。
3.如权利要求1或2任一项所述的山楂酸或其任意衍生物的用途，用于制备治疗选自包括以下的病症的药物：关节炎、类风湿性关节炎、坐骨神经痛、纤维肌痛、髌骨腱炎或拇囊炎。
4.一种包含山楂酸或其任意衍生物的药物组合物，用于治疗包括COX-2活化的病症。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其含有药学可接受的赋形剂。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其含有石竹素。
7.如权利要求6所述的组合物，山楂酸和石竹素的比率为2∶1至6∶1。
8.如权利要求4-7任一项所述的组合物，其为适合局部给药的形式。
9.如权利要求4-8任一项所述的组合物，山楂酸或其任意衍生物是得自木樨属植物的提取物。
10.如权利要求4-9任一项所述的组合物，山楂酸或其任意衍生物是得自木樨属植物的工业副产物。
11.如权利要求4-9任一项所述的组合物，山楂酸或其任意衍生物在组合物中以0.5％至3％的比例存在。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106420765A (zh) * 2016-09-10 2017-02-22 浙江大学 山楂酸在制备治疗和预防中枢神经系统疾病药物中的用途

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102210691B (zh) * 2010-04-01 2013-04-10 华东师范大学 山楂酸及其衍生物在制备抑制破骨细胞分化和功能的治疗和/或预防药物中的应用
CN102558278B (zh) * 2010-12-28 2014-07-09 复旦大学 三萜类化合物及其在制备抗补体药物中的用途
JP5855770B2 (ja) 2012-02-06 2016-02-09 プリジェン，ウィリアム，エル． ファムシクロビルとセレコキシブとの組合せを含む、機能性身体症候群のための抗ウイルス化合物とｃｏｘ−２インヒビターとの組合せ療法
JP6547183B2 (ja) * 2015-03-16 2019-07-24 日本製粉株式会社 トリテルペンを有効成分として含有する変形性関節症の予防又は治療の為の組成物
JP2017109942A (ja) * 2015-12-15 2017-06-22 日本製粉株式会社 オレアナン型トリテルペンを有効成分として含有するトレーニング機器を使用しないレジスタンストレーニングによる膝関節機能改善作用および骨格筋機能増強作用を促進させる為の組成物
JP2019043876A (ja) * 2017-08-31 2019-03-22 日本製粉株式会社 マスリン酸を有効成分として含有するタンパク質合成促進剤及び骨格筋肥大促進剤

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2404012A1 (en) 2000-03-31 2001-10-04 The Nisshin Oil Mills, Ltd. External agent for the skin and whitening agent
CN1450900A (zh) * 2000-07-31 2003-10-22 日清奥利友株式会社 抗肿瘤剂
WO2002052956A1 (fr) 2000-12-27 2002-07-11 The Nisshin Oillio, Ltd. Boisson ou aliment antitumoral
JPWO2002078685A1 (ja) 2001-03-30 2004-08-19 日清オイリオ株式会社 血管障害疾患用剤
WO2003011267A1 (fr) 2001-07-31 2003-02-13 The Nisshin Oillio, Ltd. Medicaments anti-obesite et ses substances
WO2003029391A1 (fr) * 2001-09-28 2003-04-10 The Nisshin Oillio, Ltd. Procede de production de compositions de matiere grasse renfermant de l'acide oleanolique et/ou de l'acide maslinique
JPWO2003039270A1 (ja) 2001-11-08 2005-02-24 日清オイリオグループ株式会社 抗肥満用飲食物
WO2003057224A1 (fr) * 2001-12-28 2003-07-17 The Nisshin Oillio, Ltd. Inducteur d'apoptose
ES2267403B1 (es) * 2005-08-17 2008-03-16 Universidad De Granada Composicion nutraceutica obtenida de triterpenos naturales de la olea europaea.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106420765A (zh) * 2016-09-10 2017-02-22 浙江大学 山楂酸在制备治疗和预防中枢神经系统疾病药物中的用途

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