CN101993886A - 一种构建gfor过表达质粒提高山梨醇产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法，以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis ZM4)自身编码GFOR的基因gfo，用于基因的克隆以及GFOR过量表达质粒pLT20a-gfo的构建。将构建的过量表达质粒pLT20a-gfo以接合转化方式导入至Z.mobilis ZM4中，从而实现GFOR过量表达，并进而大幅度提高山梨醇生物转化的催化效率、山梨醇产量以及转化速率。本发明的优点：通过应用本发明所提供的技术，可以有效的提高利用运动发酵单胞菌进行山梨醇生物法制备的得率、反应效率以及降低反应过程中乙醇副产物的浓度。

Description

一种构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法

【技术领域】

本发明涉及山梨醇生产技术领域，具体地说，是一种通过构建一个葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)过表达质粒，并在运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)中将葡萄糖-果糖氧化还原酶过量表达，从而增强山梨醇生物催化生产效率及得率的方法。

【背景技术】

山梨醇是一种存在于许多水果中的多羟基化合物。山梨醇的应用范围很广，它是一种最具开发潜力的关键中间体。目前，山梨醇主要是合成维生素C的原料，大约有20％用于生产维生素C；同时，山梨醇作为甜味剂、保湿剂、软化剂也被广泛用于食品工业、化妆品、药品的生产。目前较为普遍的生产方法是采用葡萄糖催化加氢法生产山梨醇。

生物法生产山梨醇就目前而言，在能生产山梨醇的微生物中只有运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)具有实现工业化的潜力。运动发酵单胞菌能够组成型的表达一种葡萄糖-果糖氧化还原酶(Glucose-Fructose oxidoreductase，GFOR)。该酶通过紧密结合的辅酶(NADP)催化葡萄糖氧化为δ-葡萄糖内酯并产生1mol的还原力(NADPH)；同时该酶将NADPH中的电子提供给果糖，完成果糖向山梨醇的转换(见图1)。而δ-葡萄糖内酯会在该菌株生成的δ-葡萄糖内酯酶或者自发水解的作用下，迅速转化生成葡萄糖酸。由于葡萄糖-果糖氧化还原酶催化反应的高度选择性以及该反应条件的温和性，因此该法不涉及到高压容器的使用，生成的两个产物山梨醇和葡萄糖酸都是重要的化工原料并可分别进行回收利用。根据生物法生产山梨醇的以上优点不难看出，利用生物法生产山梨醇的化工过程符合当今经济和社会发展对低能耗，低污染工业技术的需求，有可能发展成为现有生产山梨醇的替代技术。

利用生物法生产山梨醇与其他生物催化法生产化学品有着共同的一个特点就是：方便的获得大量、性质稳定和廉价的生物催化剂(酶或细胞)是决定生物催化过程能否真正用于实际工业中的一个决定因素。根据以往国内外相关的文献报道可知，来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶具有良好的稳定性以及高度的催化选择性。整个酶催化反应机理单一，除山梨醇和葡萄糖酸外没有其他副产物。经过大量和长期的研究，国内外学者提供了各种经济可行的细胞催化反应工艺；然而，作为催化剂的GFOR的来源，始终是制约该过程在实际中得以应用的一个关键瓶颈。国外曾有许多学者曾通过将运动发酵单胞菌中编码GFOR的基因(gfo)进行克隆，并将其置于大肠杆菌表达体系中进行过量表达，以期获得大量和廉价的酶制剂(Arch.Microbiol.1996，166，32-41；)。然而，由于编码GFOR的基因在运动发酵单胞菌中表达后存在一个表达后转运以及加工的过程(其具体机理仍然未见相关报道)，因此编码该酶的基因至今仍然无法在大肠杆菌及其他常见表达体系中大量表达出具有活性的产物(J.Bacteriol.1992，174，1439-1447；Structure 1996，4，1413-1428；Eur.J.Biochem.1997，244，107-112)；GFOR的来源仍然仅限于从运动发酵单胞菌中提取获得。尽管曾经有文献报道，通过使用高糖浓度培养基以及使用玉米浆代替发酵培养基中的酵母提取物的方法可以在一定程度上提高运动发酵单胞菌发酵生产GFOR的产量或者降低生物催化剂制备过程的成本(BrazilianJ.Microbiol.2003，34，329-333)，然而整个过程中GFOR得率以及比酶活低仍未能得到有效的解决。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过构建一个葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)过表达质粒，并在运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)中将GFOR过量表达，及其在制备山梨醇中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明使用的表达载体是本实验室构建的革兰氏阴性菌细菌广泛宿主接合转移质粒pLT20a；所构建的表达载体pLT20a-gfo的表达单元具有如表1所示的核苷酸序列(SEQ ID No：1)，其中引物序列根据此序列进行设计，并通过在引物的两端添加XbaI和EcoRI限制性内切酶识别序列用于基因的克隆以及pLT20a-gfo载体的构建；

本发明所设计的构建引物，具有如表2所示的核苷酸序列(SEQ ID No：2)；

本发明所构建的多拷贝表达载体pLT20a-gfo，其在Z.mobilis ZM4菌体中的拷贝数为两个或者两个以上；

本发明所构建的多拷贝表达载体pLT20a-gfo，是通过以Z.mobilis ZM4自身的编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的全基因为模板，通过PCR反应获得的；

表1.gfo全基因核苷酸序列(SEQ ID No：1)

表2.引物名称及核苷酸序列(SEQ ID No：2)

本发明通过将所构建的多拷贝表达载体pLT20a-gfo转化到Z.mobilisZM4菌体中后，能增加菌体GFOR表达量的提高，从而降低生物法制备山梨醇用酶的生产成本；

一种构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法，具体步骤为：

(1)培养运动发酵单胞菌Z.mobilis ZM4，并收集菌体制备基因组DNA，并根据公布的葡萄糖-果糖氧化还原酶的全基因核苷酸序列设计引物SEQ IDNo：2，以基因组DNA中的葡萄糖-果糖氧化还原酶全基因gfo，SEQ ID No：1为模板，利用PCR反应制备大小约为1.6kb的gfo基因；

(2)使用EcoRI和XbaI两个限制性内切酶对pLT20a质粒进行线性化消化，产生一个大小约为9.9kb的线性质粒DNA；同时使用EcoRI和XbaI两个限制性内切酶对gfo PCR产物也进行消化，产生大小约为1.6kb的DNA片段；利用T4DNA连接酶将两个DNA片段进行连接，从而构建多拷贝表达质粒pLT20a-gfo；利用LB+四环素+IPTG+X-Gal抗性筛选平板进行筛选，挑选白色的菌落进行pLT20a-gfo质粒的提取和鉴定；

(3)将鉴定后的pLT20a-gfo质粒转化至接合转化辅助菌株E.coliS17-1中，并以LB+四环素抗性平板筛选得到含有pLT20a-gfo质粒的E.coliS17-1菌株，该菌株命名为E.coli S17-1(pLT20a-gfo)；利用接合转化方法，将E.coliS17-1(pLT20a-gfo)中的pLT20a-gfo质粒转化至Z.mobilis ZM4菌株中；以RM+四环素抗性平板筛选得到含有pLT20a-gfo质粒的Z.mobilisZM4菌株，该菌株命名为Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)；

(4)从甘油管保存的Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)菌株接种至种子培养基中培养至生长对数后期；并进而以10％体积的接种量接种至发酵培养基中发酵培养细胞；待细胞生长至对数后期，即OD_600nm约为12.0后，将发酵液于4℃8,000×g离心力下离心2分钟；收集离心杯底部的菌体细胞，并将其置于-20℃冷冻；细胞冷冻融化后可用于生物法催化生产山梨醇(冷冻细胞在-20℃储存时间不超过一周)；以超声波破碎法破碎细胞，并分析细胞中GFOR的酶活力和比活；

(5)将-20℃冷冻待用的Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)和对照菌株Z.mobilis ZM4的细胞于室温彻底融化；以融化后的两种细胞进行生物法制备山梨醇的催化反应；反应体系为：15g/L细胞，150g/L葡萄糖，150g/L果糖，温度39℃，pH6.4±0.2；得到山梨醇；

其中：以HPLC分析山梨醇、乙醇和果糖的浓度，并根据以下关系式计算山梨醇的得率等指标；

Y_S＝C_tS/C_iF×100％

Ys：反应终止时间山梨醇的得率；C_tS：反应终止时间山梨醇的浓度；

C_iF：反应起始时间果糖的浓度。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

通过应用本发明所提供的技术，可以有效的提高利用发酵运动发酵单胞菌进行生物法制备山梨醇的得率、反应效率以及降低反应过程中乙醇副产物的浓度。

【附图说明】

图1GFOR催化山梨醇和葡萄糖酸生成的反应示意图；

图2gfo多拷贝表达质粒pLT20a-gfo构建过程图；

图3A pLT20a-gfo质粒图：Mob，接合转化相关功能基因；Tc^r，四环素抗性基因；gfo CDS，gfo基因编码DNA片段；Pgfo，来源于Z.mobilis菌株的gfo自身启动子DNA片段；OriV，pLT20a-gfo质粒复制子；XbaI，EcoRI，质粒中可以被XbaI和EcoRI所识别的限制性内切酶酶切位点；

图3B pLT20a-gfo质粒鉴定电泳图谱：M，DNA分子量标准品；1，pLT20a-gfo经XbaI单酶切产物；2，pLT20a-gfo经XbaI和EcoRI双酶切产物；3，pLT20a经XbaI和EcoRI双酶切产物；4，以筛选得到的pLT20a-gfo质粒为模板的gfo全基因PCR产物；5，以Z.mobilis ZM4基因组DNA为模板的gfo全基因PCR产物。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法的具体实施方式。

实施例1

以RM培养基(Yeast extract：10g/L；KH₂PO₄：2g/L；Glucose：20g/L；pH＝6.0)接种Z.mobilis ZM4菌株，并于30℃培养20小时。以Qiagen DNeasy Tissue Kit试剂盒提取基因组DNA(详细步骤参照试剂盒说明书)。

以已公布的运动发酵单胞菌Z.mobilis ZM4(ATCC 31821)基因组DNA为模板(Nat.Biotechnol.2005，23，63-68)，以Primer 5.0引物设计软件设计引物(引物详细名称及序列信息，见表1.)。在正反向引物的两端分别引入EcoRI和XbaI两个酶切位点用于基因的克隆。通过PCR反应获得的gfo全基因，经过EcoRI和XbaI两个限制性内切酶将PCR产物以及本实验室构建的pLT20a多拷贝穿梭质粒进行消化，产生EcoRI和XbaI两个粘性末端；随后，使用T4DNA连接酶将两个DNA片段进行连接，从而构建多拷贝表达载体pLT20a-gfo(构建过程参见图2)。

表1.方案实施涉及引物名称及序列

注：序列下划线部分为限制性内切酶识别位点。实线部分为EcoRI识别序列，虚线部分为XbaI识别序列。

实施例2

利用pLT20a质粒上的lacZα筛选标记对克隆有gfo全基因的质粒pLT20a-gfo进行蓝白斑筛选；并对筛选得到白色菌株内的质粒进行提取鉴定：

将实施例1中的连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中(E.coliDH5α感受态细胞详细方法参考：分子克隆实验指南，北京，科学出版社，2002，第三版，96-98)，并将转化后的菌液涂布于含有IPTG(25μg/mL)、X-Gal(50μg/mL)和四环素(Tc，20μg/mL)的LB固体培养基平板上(如无特殊说明，本发明涉及到以上三种化学品的最终使用浓度均为以上所述)，于37℃培养24小时。将平板上长出的白色菌落接种于含有四环素的LB液体培养基(Yeast extract：5g/L；NaCl：5g/L；Peptone：10g/L；pH＝7.0)中，于37℃220rpm培养12小时。使用Omega plasmid mini kit试剂盒提取(具体操作步骤见试剂盒使用说明书)。将提取的质粒使用限制性内切酶XbaI和EcoRI进行单、双酶切，并以提取质粒为模板使用gfo引物进行PCR反应。将获得的酶切产物以及PCR产物以0.7％琼脂糖核酸电泳进行分析，从而确认gfo全基因的亚克隆结果(电泳胶的制备以及过程操作具体参考分子克隆实验指南，北京，科学出版社，2002，第三版，387-399)。

实施例3

pLT20a-gfo质粒借助于接合转化辅助菌株E.coli S 17-1转入Z.mobilis ZM4：

将筛选以及经过验证的pLT20a-gfo质粒转化至接合转化辅助菌株E.coli S17-1感受态细胞中(具体方法同于“实施例2”中E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化方法)。将转化后的菌液转移至含有20μg/mL四环素的LB固体培养基平板上，并在37℃恒温培养箱中培养24小时。从平板上挑取单菌落并接种于含有四环素的LB液体培养基于37℃、220rpm环境下培养E.coli S 17-1(pLT20a-gfo)12小时；随后，将菌液以1％(v/v)的接种量接种于含有20μg/mLTc的RM培养基中，直至OD_600nm大约为0.5左右；同时，将Z.mobilis ZM4菌株用无菌牙签接种于RM培养基中，于30℃静止培养至OD_600nm大约为0.4左右。以无菌移液器各吸取两种菌液0.5ml至无菌的1.5mL离心管中，于室温下10,000×g离心0.5min。将上清液弃去，并以新鲜的RM培养基重新悬浮细胞。将重悬的细胞于室温，10,000×g再次离心0.5min。将上清液弃去并将细胞重新用50μL的RM培养基悬浮细胞。用无菌移液器吸取悬浮有两种细胞的RM培养基并转移至预先贴至RM固体培养基表面的0.22μm无菌滤膜上，并将平板放置于30℃恒温培养箱中静止孵育12小时。

将孵育12小时的细胞以及滤膜移至2mL RM液体培养基中，并通过漩涡震荡混匀器重新悬浮细胞。用无菌移液器吸取300μL菌悬液并均匀涂布于含有20μg/mL四环素以及40μg/mL萘啶酸的RM固体培养基平板上。将涂有菌悬液的平板倒置于30℃恒温培养箱中静止孵育48小时；待培育48小时后，含有pLT20a-gfo质粒的运动发酵单胞菌在带有双抗性平板上可长出肉眼可见的菌落——Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)。

实施例4

Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)及Z.mobilis ZM4细胞的发酵制备及酶活检测：

将甘油管保存的Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)和对照菌株(Z.mobilis ZM4)以2％(v/v)接种量接种于含四环素的种子培养基(Yeast Extract，5g/L；KH₂PO₄，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.5g/L；(NH₄)₂SO₄，5g/L；Glucose，10g/L；pH＝6.0)；培养条件为30℃，150rpm。细胞生长至对数中后期后(OD_600nm约1.0)，再以10％(v/v)接种量接入发酵培养基(Yeast Extract，5g/L；KH₂PO₄，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.5g/L；(NH₄)₂SO₄，5g/L；Glucose，10g/L；pH＝6.0)；培养条件为30℃，200rpm。待菌体生长至对数后期(OD_600nm约12.0)，将发酵液于4℃8,000×g离心力下离心2分钟。丢弃上清液，收集离心杯底部的菌体细胞。并将其置于-20℃冷冻待用(储存时间为一周)。

通过超声波破碎法，将冷冻待用的细胞进行破碎，并检测GFOR的酶活水平。该酶活性测定及蛋白质浓度测定等方法参考相关文献报道(J.Bacteriol.1986，167，863-869；Anal.Biochem.1976，72，248-254)。经过酶活力单位的测定以及产率和比活的计算可知，增加gfo基因拷贝数的Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)菌株，其GFOR的得率和比酶活单位分别为：29.99±0.58U/g葡萄糖和5.13±0.19U/mg蛋白质；没有增加gfo基因拷贝数的对照菌株(Z.mobilisZM4)GFOR的得率和比酶活单位分别为：19.47±1.59U/g葡萄糖和3.39±0.29U/mg蛋白质。经过发酵培养，通过增加gfo基因的拷贝数后，Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)的GFOR得率和比酶活单位分别比对照菌株提高了54.03％和51.32％。因此通过该方法，可以大大的提高来源于Z.mobilis ZM4的GFOR酶的生产水平和含量。

实施例5

Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)及Z.mobilis ZM4冻融细胞催化山梨醇生产：

将实例4中制备并于-20℃冷冻待用的Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)和对照菌株Z.mobilis ZM4的细胞于室温下彻底融化，以融化后的两种细胞分别进行制备山梨醇的催化反应。

用电子天平分别称取15g(湿重)融化的细胞用于催化。分别称取约150g的葡萄糖和果糖，配制成300g/L的糖溶液作为反应的底物溶液。将500ml反应底物溶液预先置于3L反应器中预热至39℃(整个反应过程温度维持在39℃)。将融化的15g细胞加入39℃糖溶液反应体系中启动生成山梨醇的催化反应。以14M NaOH控制反应体系的pH为6.4±0.1。反应过程中刚加入细胞时以及随后每隔15分钟取样，并以高效液相色谱分析果糖、乙醇和山梨醇的浓度。高效液相色谱系统配置包括：LC-20AD液相色谱泵(Shimadzu，Japan)；RID-10A示差检测器(Shimadzu，Japan)；Aminex HPX-87H(Bio-RadLaboratories，Inc.，U.S.A)液相色谱柱。分析条件为：以0.005M H₂SO₄为流动相，柱温65℃，流速为0.6mL/min。

当以Z.mobilis ZM4冻融细胞进行山梨醇生产的催化反应时，反应过程持续约为4小时，果糖初始浓度为156.7g/L山梨醇的浓度为126.3g/L，乙醇浓度为25.8g/L，山梨醇的得率为80.7％，平均生产速率为31.6g/(L·hour)；当以Z.mobilis ZM4(pLT20a-gfo)冻融细胞进行山梨醇生产的催化反应时，反应过程持续约为2小时，果糖初始浓度为158.4g/L，山梨醇的浓度为151.0g/L，乙醇浓度为12.8g/L，山梨醇的得率为95.3％，平均生产速率为75.5g/(L·hour)。

根据催化反应的数据分析可知，通过基因工程手段对Z.mobilis ZM4进行改造之后，山梨醇的生产速率为野生菌株催化反应的2.39倍，山梨醇的得率提高了18.1％，反应副产物乙醇的浓度降低了一倍左右。由此可见，通过本发明可以有效的提高生物法生产山梨醇的效率和产量，而且同时可以降低副产物乙醇的生成，由此可显著提高山梨醇生物法制备的经济效益。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

序列表

<110>华东理工大学

<120>一种构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法

<130>CN09125

<140>200910056639.0

<141>2009-08-19

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1574

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

tcgaaattaa cgatcaccca caagaaataa ttatctgaca gcgcttacca atcaattatt     60

gccgaacgca gagtcccgta ttaggacggt caacaatcta aaccgttttt cagaaaatat    120

tgctttataa gcctcaaaac ttaaaagctg cggtatttta atataccaaa attttctgga    180

aaagccggcg aatcagataa cagttccgca caggtgagaa ccacgacgga tcttctctga    240

attgttggtt agttaagaaa gaaacaagga ttatgacgaa caaaatctcg tcttcagata    300

atctttccaa tgctgtttca gcaacggatg acaacgcttc ccgtacgcca aatctgaccc    360

gtcgcgctct cgttggtggt ggtgttggac tggccgcagc tggcgcctta gccagtggtc    420

ttcaggcagc gacgcttcct gctggtgcca gccaggttcc gaccacgcct gcaggtcgcc    480

cgatgcctta cgcgatccgc ccgatgccgg aagatcgtcg tttcggttat gctatcgtcg    540

gtctgggtaa atatgccctt aaccagattt taccgggttt tgccggatgc cagcattccc    600

gcatcgaagc tttggtcagc ggtaacgctg aaaaagctaa aatcgttgcc gctgaatatg    660

gcgtcgatcc ccgtaaaatt tatgattaca gcaacttcga caagatcgct aaagatccaa    720

aaatcgacgc tgtttacatc attttgccaa actctttgca tgctgaattt gctatccgtg    780

ctttcaaagc cggcaagcat gttatgtgtg aaaagccgat ggcaacctct gttgctgatt    840

gtcagcggat gatcgatgca gccaaggctg ctaataaaaa gctgatgatc ggttaccgtt     900

gccactatga tccaatgaac cgtgcagcgg taaaattgat ccgtgaaaac cagttgggta     960

aactgggcat ggttaccacc gacaactcag acgttatgga tcagaacgat cctgcacagc    1020

agtggcgtct gcgtcgtgaa ctcgccggtg gcggttcttt gatggatatc ggtatttatg    1080

gcttgaacgg tacccgttac ttgctgggtg aagaaccgat cgaagtccgt gcttacacct    1140

acagcgatcc gaatgatgaa cgtttcgttg aagtcgaaga tcgtattatt tggcagatgc    1200

gcttcagaag cggtgctctg tctcatggtg catcttctta ttcgaccacg acgacttcac    1260

gtttctcggt gcagggcgac aaagctgttc tgttgatgga tccggctacc ggatattatc    1320

agaatttgat ttctgtccag accccaggcc atgctaacca gtcgatgatg ccacagttca    1380

tcatgccagc gaacaaccag ttctctgcac agttggatca tctggctgaa gccgtcatca    1440

ataacaaacc agttcgtagc ccgggtgaag aaggtatgca ggatgtgcgc ctgattcagg    1500

ccatttatga agcagctcgt accggtcgcc ccgtcaacac ggattggggt tatgtccgtc    1560

agggtggtta ttga                                                      1574

<210>2

<211>62

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

cggaattctc gaaattaacg atcacccacg ctctagacca tggtcaataa ccaccctgac    60

gg                                                                   62

Claims (5)

1.一种构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法，其特征在于，通过构建一个葡萄糖-果糖氧化还原酶表达质粒，并在运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4中将葡萄糖-果糖氧化还原酶过量表达，从而大幅度提高山梨醇生物转化的催化效率、山梨醇产量以及转化速率，所述的GFOR是指葡萄糖-果糖氧化还原酶。

2.如权利要求1所述的构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法，其特征在于，将来源于Z.mobilis ZM4的gfo全基因以核苷酸引物SEQ ID No：1通过PCR获得并克隆至pLT20a质粒中，完成表达质粒pLT20a-gfo的构建。

3.如权利要求1所述的构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法，其特征在于，将构建的gfo表达质粒pLT20a-gfo转化至Z.mobilis ZM4中，从而实现葡萄糖-果糖氧化还原酶过量表达。

4.如权利要求1所述的构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法，其特征在于，通过将过量表达的葡萄糖-果糖氧化还原酶，应用于山梨醇制备领域中。

5.如权利要求1所述的构建GFOR过表达质粒提高山梨醇产量的方法，其特征在于利用运动发酵单胞菌Z.mobilis ZM4作为质粒转化的宿主菌，但运动发酵单胞菌只是最优选的菌株，还包括能够产山梨醇的各种运动发酵单胞菌，以及能够实现基因转化并表达葡萄糖-果糖氧化还原酶的菌株。

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