CN101983327A - 生物样本的反复染色 - Google Patents
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Abstract
提供了便于对成像应用的生物样本反复染色的自动方法及装置。该方法包括以下步骤：提供包含生物样本的小容积流槽，将染色剂施加到生物样本上，结合至少两种前体试剂来形成活化脱色剂，而其中活化脱色剂的分解速率大于或类似于脱色反应速率，以及使脱色剂以大于活化脱色剂分解速率的流率在生物样本上流动。染色、结合和流动的过程是可反复地重复的。本文还公开了用于生物样本反复染色的装置，其包括与预混器流体连通的流槽，其中，预混器的体积容量小于流槽的体积容量的大约五倍。
Description
相关申请的交叉引用
本申请请求享有2008年4月2日提交的美国专利申请号12/061,044的优先权；该申请的全部公开内容通过引用结合到本文中。
背景技术
对于多元应用而言，组织样本或组织微阵列(TMA)需要利用多个分子探针来染色，以便定量或定性地研究蛋白质表达或空间分布。染色过程典型地使用容易出错的耗时的人工技术来执行。染色过程中所使用的试剂常很昂贵，且具有有限的贮藏寿命，因而需要特殊的处理技术。
存在使用微观流槽(flow cell)来作为用于组织样本的反应腔室，或用来监测在流动状态下的细胞活动的自动系统。然而，此类系统并未良好地适于在缺少流槽内样本的环境控制的组织样本处理中使用，且需要人工干预。
试剂(例如，荧光试剂)穿过流槽的流体流率很难控制，因为流动流可在小容积腔室内造成紊流，移动或破坏样本。另外，周边的外部加热(例如，来自加热的显微镜物台)可造成封闭样本的非均匀加热。因此，温度跨越样本而变化。此外，重复的试剂制备、样本移除和更换到物台上以采集图像需要样本重新排列，且降低了再生性。
发明简述
本发明一般地涉及便于对来自成像应用的生物样本进行反复染色的自动方法及装置。
在一些实施例中，该方法包括以下步骤：提供包含生物样本的小容积流槽，将染色剂施加到生物样本上，结合至少两种前体试剂来形成活化脱色剂，而其中活化脱色剂的分解速率大于或类似于脱色反应速率，以及使脱色剂以大于活化脱色剂分解速率的流率在生物样本上流动。染色、结合和流动的过程可反复地重复。
在一些实施例中，提供了一种用于生物样本的反复染色的装置，且该装置包括与预混器成流体连通的流槽，其中，该预混器的体积容量小于流槽的体积容量的大约五倍。
在一些实施例中，流槽包括构造成容纳组织样本的底座；热电元件；位于底座与热电元件之间的垫圈；与预混器成流体连通的入口端口；以及出口端口；其中，底座和热电元件中的一者或两者包括图像采集窗口。流槽还可包括脱气器和压电元件。
附图简述
图1示出了代表性的流槽装置。
图2示出了与流槽装置一起使用的脱气器。
图3示出了将压电元件用作预混器对漂白试剂的反应时间的改善。
具体实施方式
以下详细说明为示范性的，且并非旨在限制本申请的发明和本发明的用途。此外，并不受通过在附图的以下详述的本发明的在先背景中呈现的任何理论来限制。
为了更为清楚和简明地描述和指出要求得到专利保护的本发明的主题，将向以下说明和所附权利要求中的特殊用语提供以下定义。
单数形式″一″、″一个″和″该″包括复数对象，除非上下文明确地另外规定。如整个说明书和权利要求中在此使用的近似性语言可用于修饰任何数量表达，其可容许数量表达变化，而不会导致其所涉及的基本功能变化。因此，诸如″大约″的用语所修饰的值不限于所指定的精确值。除非另外指出，否则随后将在说明书和权利要求中使用的表示成分数量、诸如分子量的性质、反应条件的所有数字都应理解为在所有情况下都由用语″大约″修饰。因此，除非相反地指出，否则以下说明书和所附权利要求中所阐明的数字参数为近似值，其可取决于本发明设法获得的所期望的性能而变化。至少各数字参数应当鉴于报告的有效数字的数目和通过应用普通舍入技术来分析。
如本文所使用的用语″生物样本″是指从生物对象上获得的样本，包括生物组织样本或活体内或活体外获得的流体源。这些样本可为但不限于从包括人在内的哺乳动物分离的组织、片段和细胞。
如本文所使用的用语″发光团″是指表现出发光的化合物，发光包括化学发光、生物发光、磷光和光致发光。典型的实例包括但不限于发光氨、光泽精、二氢化吖啶、吖啶酯和二氧烷，以及荧光团。
如本文所使用的用语″氧化剂″或″氧化试剂″是指实质上使发光团失活的漂白试剂。代表性的氧化剂包括活性氧类、羟基、单态氧、过氧化氢或臭氧如过氧化氢、高锰酸钾、重铬酸钠、溴水、碘-碘化钾，或叔丁基过氧化氢。
本发明涉及一种自动系统和方法，其通过消除对传送样本(例如，在流槽内的滑片上的组织样本)的需要来以最少的操作人员干预进行工作。所公开的系统和方法还消除了使样本在染色构件与成像构件之间位移的需要。
染色构件的自动化最大限度地减小了试剂体积和试剂在系统内的停留时间这两者，从而节省了昂贵的试剂，如荧光标记的抗体，且最大限度地减少了试剂分解或副反应。其还减小了试剂计量中的变化，且可减少试剂交叉污染的发生。成像构件的自动化消除或减少了与图像对准和染色后再安装样本相关的步骤。图像配准的改善便于形成准确的合成图像。
可通过计算机控制连续染色所涉及的一个或多个工艺步骤(如添加染色试剂和氧化剂)来实现自动化。在流槽系统结合到组合的样本处理和图像采集系统中的情况下，图像采集构件(例如，显微镜或照相机)还可由软件来控制，该软件例如为如用LabVIEW或C写成的程序。
装置
本文所提供的装置用于执行所公开的方法。因此，本文所提供的是流槽及包括流槽与预混器的系统。
在如图1中所示的一个实施例中，流槽可包括构造成位于组织样本上方的包围的流动腔室。该流槽可包括：固体支承-容纳部件10、具有构造成用以容纳位于滑片12上的组织样本的中心开口的垫圈11、罩盖14、入口端口15和出口端口16，其中，当滑片位于滑片容纳部件中且垫圈夹在滑片与罩盖之间时，流槽限定封闭的腔室。由于流动腔室被包围在流槽内，最大限度地减小了流体的蒸发，且因此最大限度地减小了试剂的损失。另外，封闭构造改善了温度控制。
流槽可为模块化单元，该模块化单元适于配合到标准显微镜物台上。作为备选，流槽可为包括显微镜物台的一体式单元。在一些实施例中，流槽可固定在显微镜物台上来用于成像过程。这容许了样本在没有人工干预的情况下暴露于全系列试剂，从而有可能消除样本在在显微镜物台上的重新排列，以用于图像采集或配准。这对于多元的染色和成像特别有用，因为在各染色步骤之后采集的图像可重叠来形成合成图像。
流槽可用于包括流体控制子系统和温度控制子系统的系统中，流体控制子系统和温度控制子系统用来控制在流槽的内部腔室中的流体输送和溶液温度。在一个实施例中，流体控制系统还可包括储槽、流动传感器、混合腔室和脱气器，以便在注入流槽之前制备一种或多种试剂。此类系统的优点是免除了预混和储存可能具有有限的稳定性或贮藏寿命的试剂的需要。流体控制系统与流动的入口端口和出口端口成流体连通。
滑片容纳部件
在一些实施例中，流槽可包括构造成用来容纳位于诸如玻璃滑片的固体支承件上的组织样本的滑片容纳部件。滑片保持件适合一定范围的化学变化和温度变化。在一个实施例中，滑片保持件可由底座和用于将滑片固定在腔室中的销钉或凸片系统构成。
垫圈
流槽包括具有中心开口的垫圈，该中心开口构造成用来容纳位于滑片上的组织样本。垫圈可由可变形的化学上惰性的橡胶或塑料制成，其保持应用于流动腔室的液体。垫圈可选为包括用于入口端口和出口端口的开口。垫圈的中心开口的尺寸可设置为最大化图像采集窗口的视场。当放置到流槽中时，垫圈的宽度、长度和深度可各自变化，以达到流槽的预定内部容积。在一些实施例中，垫圈的宽度和长度的尺寸可设置成符合标准组织切片滑片或微阵列基底。例如，在一个实施例中，垫圈的中心开口可容纳20mm宽且30mm长的组织微阵列。
入口端口和出口端口
入口端口和出口端口优选放置成远离图像采集窗口。因此，入口端口和出口端口可位于垫圈中或罩盖上。入口端口和出口端口典型地在尺寸上匹配，使得流入速率和流出速率等同，以获得穿过样本的所期望的流率。
温度控制
进一步参看图1，温度控制单元还可包括用于温度控制的热电物台17和用于温度测量的RTD/热敏电阻。对于其中温度控制单元的底部表面与流体直接接触的构造而言，接触表面18可由耐化学制品的材料制成，如不锈钢或钛。框架19还可用于定位温度控制单元的构件。
在一些实施例中，温度控制单元结合到罩盖中，以便在温度控制单元(例如，珀耳帖叠层(Peltier stack))与滑片之间形成的内部腔室由温度控制器直接加热，而非通过组织滑片加热。该构造解放了组织滑片的后侧来用于成像。
脱气器
在一些实施例中，本发明还包括用于协助从流槽中除去气体的方法。如图2中所示，诸如非晶体含氟聚合物或聚二甲硅氧烷(PDMS)的气体可渗透薄膜20可用来分隔气体排出通路21和包含样本23的流体腔室22。在此类构造中，反压力或真空的应用使系统通风，且除去腔室中的过多气体。
搅拌
在一些实施例中，本发明还可包括压电元件，该压电元件连接到流动腔室上，且能够通过将低压电信号转换成声能而在流动腔室中产生振动。在优选实施例中，压电元件可由陶瓷、石英(SiO2)或钛酸钡(BaTiO3)构成。压电元件的构造提供了超声波搅拌，且影响穿过流动腔室的试剂的流动曲线。这在其中所期望的染色反应有扩散限制且流槽几何形状阻止常规机械混合的情形中特别有利。
计算机处理单元
计算机可控制流槽系统的各种构件，例如包括热控制单元、预混器、振动单元和泵。在流槽系统结合到组合的样本处理和图像采集系统中的情况下，图像采集构件(例如，显微镜或照相机)也可由计算机控制。
方法
本文还提供了用于处理和采集来自粘附在固体支承件上的生物样本(例如，固定到显微镜滑片上的组织切片)的图像的方法。该方法包括使用为具体应用所选择的装置的各种备选实施例的步骤。共同拥有的US2008-0118944中描述了用于反复处理生物样本的典型方法，该申请结合在本文中。
一种代表性的方法包括：(a)将生物样本定位在流槽中，生物样本例如为显微镜滑片上的组织切片；(b)以容许发光团与样本之间有充分的接触时间的方式将荧光标记或发光团应用到样本上，该接触时间通常在30至60分钟的范围内，取决于所使用的标记的浓度和类型；(c)施加清洗溶液，例如适合的缓冲溶液，以便将任何游离的荧光标记或发光团洗掉；(d)采集标记样本的图像；(e)通过施加氧化剂来施加化学试剂以破坏步骤(b)中的发光团，此处使用连续流动工艺将氧化剂溶液施加到样本上，氧化剂使发光团实质上失活，以便最小化流槽内的非层流和停留时间，导致1至5分钟的平均停留时间；(f)可选地采集样本的图像，以及(g)重复步骤(b)-(f)至少一次。
各施加步骤可通过使含有特定试剂的溶液在位于流槽内的生物样本上流动来实现。可控制以下参数来提高反应性，且从而减小试剂消耗：(1)流槽的内部容积；(2)流槽的内部温度；(3)混合氧化溶液组成部分(例如，过氧化氢和碳酸氢钠)的时机；(4)溶液在其通过样本时的搅拌程度；以及(5)除去气泡或流槽的脱气。这些参数的适当调节还可减小样本的降解，容许单个样本产生更多数据。
自动脱色步骤容许操作人员在保持原有配准的同时再探测单个样本。添加氧化剂导致了生物样本脱色，因为发光团所产生的信号基本上被除去了。不论脱色是通过化学地改变发光团还是通过分离而实现的，信号都减少了至少80％，而优选大于90％。信号的该减少可测量为相对于染色生物制品的初始绝对亮度的在特定波长下的染色后亮度，以对于由脱色步骤引起的背景信号或自体荧光的伴随减少而进行调整。
流槽内部腔室容积
小容积的流槽保存贵重的试剂。在试剂扩散为速率确定步骤时，流动应与内部腔室容积相关联。例如，到流槽的流体输送可基于腔室的体积容量来调整，以容许快速、完全地冲洗腔室。
流槽提供了用于测试样本的固体支承件。流槽尺寸基于所使用的固体支承件而受到约束。流槽的高度基于样本的厚度。在样本为组织切片的情况下，其可具有在大约5μm至大约100μm之间的厚度。该组织切片可占据20mm乘以30mm的面积。这导致了在10μL至1000μL的范围内的小的内部腔室容积，优选为50μL至200μL。
在从流槽上大致除去试剂之前，可发生分解。流动腔室中的紊流改善了表面反应性，且便于除去试剂副产物(例如，氧气)。因此，在一些实施例中，腔室可包括生成紊流的搅拌元件(例如，声学压电构件)。
内部腔室温度
尽管一些微阵列染色过程在20℃至100℃之间进行，但一些系统可能以紧密公差要求高得多或低得多的温度。涉及染色的吸收和解吸过程取决于温度，且因此在一些实施例中，在发生化学交互作用的情况下在整个样本的表面上提供均匀的温度。
例如，可将层叠的热电元件引入腔室中或腔室上，其中，流过元件的电流可通过辐射加热腔室内的流体来在特定温度范围内调节腔室温度。一些系统可能需要+/-5℃的温度公差，而其它的可能具有紧得多或较为宽松的温度公差。在一些实施例中，热电元件可选地包含热沉来吸收和耗散热量，以便于温度调节。
预混器和混合时机
用于多元染色的试剂可具有有限的贮藏寿命，此处试剂的有效性随着时间而减弱。这在通过混合两种或多种溶液来开始化学反应而制成的试剂可能经历部分分解或沉淀时发生。这可导致形成气体和其它不期望的副产物。在一些实施例中，通过刚好在试剂引入流槽中之前使用预混器分散反应物来在分子水平上完全地混合溶液。混合时间应当足够长，以便生成试剂，且受到充分限制来防止分解。
位于流槽上游的预混器可基于腔室设计或管路设计。腔室设计可包括具有入口端口和出口端口且包含机械混合器的小容器。管路设计可包括Y型适配器，化学试剂以预定流率被驱使进入该Y型适配器。作为备选，管路设计可包括物理屏障(例如，位于管路内的微孔或球形膜片)或生成紊流的喷嘴。
预混器容许化学试剂在引入流槽之前混合。流槽的体积容量基于化学试剂的分解速率和穿过流动腔室的化学试剂或其反应产物所期望的流率确定。
给定温度下的过氧化物溶液的分解速率等于-dC/dt＝kC，此处C为过氧化物浓度，t为时间，而k为一级速率常数。一级反应的半衰期与初始浓度无关，且计算为t1/2＝In(2)/k。第n级反应的半衰期也可确定，且表示为t1/2＝2n-1-1/(n-1)k[A0]n-1。
流槽内的驻留时间限制为小于试剂的半衰期。因此，流槽的体积容量由以下确定：Vp＜(V/t)(t1/2)，此处，(Vp)为流槽的体积容量，而(V/t)为流率。
生成氢过氧化物阴离子的氧化剂如过氧化氢溶液在5分钟的制备内分解且形成氧气。典型地，流槽的体积容量可从1至1000μL变化，优选为50μL至500μL。为了确保试剂在流槽中的平均停留时间小于5分钟，流率优选从50μL/min至500μL/min变化。应用Vp＜(V/t)(t1/2)，预混器的体积容量限制为5至5000μL，优选为250μL至2500μL。
试剂储槽
预混器与一个或多个试剂储槽成流体连通。试剂储槽用作试剂在输送至预混器之前的储存装置。流动控制器容许将计量数量的试剂传送至预混器。可以以相继顺序或并行地进行一种以上的试剂的输送，从而容许准确计量试剂和减小试剂的交叉污染。
图像采集窗口
所公开的方法可在包括流槽的系统中执行，该流槽构造成使得能够通过图像采集窗口来加强对样本的接近。图像采集窗口可由基底限定，样本设置在基底上(例如，显微镜滑片)，或基底可包括滑片容纳部件下侧上的透光材料。
因此，可使用流槽来执行本发明的方法，在流槽中，辅助装置如加热元件或搅拌元件(例如，声学压电构件)定位成远离图像采集窗口，联接到照相机上的显微镜可通过图像采集窗口来在各种处理阶段期间采集样本的图像。
控制反应动力
在一个实施例中，在预混器中制备3ml的过氧化氢缓冲溶液(3％H2O2，pH10)。预混器设计成与流槽物理连通，以便利用连续流动来将新近制备的缓冲过氧化物引入流动腔室中，其中在腔室内的驻留时间小于5min。典型的流率为250μL/min，而流动腔室的容积小于250μL。腔室还包括压电元件。
如图3中所示，这些条件将反应时间减少至与人工染色过程相比的大约三分之一，在人工染色过程中，样本在容器中处理，且对于每5min的驻留时间搅拌大约10sec。提高反应性可归因于活化脱色剂的新近制备(分解较少)，以及在平衡反应中连续除去副产物。协调的预混和最佳流率还通过过氧化氢在基本溶液中的分解而减少了原位形成的氧气泡的总量。
尽管鉴于特定实施例在上文中描述了本发明，但如本领域的技术人员很清楚的那样，可制作出本发明的一些修改和变型，而不脱离所附权利要求中所阐明的其精神和范围。
Claims (25)
1.一种生物样本的反复染色的自动方法，包括：
(a)提供包含生物样本的小容量流槽；
(b)施加染色剂；
(b)结合至少两种前体试剂来形成活化脱色剂，其中，所述活化脱色剂的分解速率大于或类似于所述脱色反应速率；
(d)使所述脱色剂以大于所述活化脱色剂的分解速率的流率在所述生物样本上流动；以及
(e)可选地重复步骤(b)-(d)至少一次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过图像采集窗口来观察由所述染色的生物样本生成的所述信号，以及可选地测量生成的所述信号的亮度值，以及使所述信号与生物标记的特殊标注相关联。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化脱色剂包括氧化剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化氢、溴水、碘-碘化钾和叔丁基过氧化氢的缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，一种前体试剂包括过氧化氢，而另一种前体试剂为氢氧化钠。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化脱色剂形成在与所述流槽流体连通的混合腔室中。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化脱色剂通过使穿过与所述流槽流体连通的通道的各前体试剂的流动流汇合而形成，并且其中，所述通道可选地包含用以增强各前体试剂的所述流动流的混合的物理屏障。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色剂为发光团。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括振动所述流槽来加强混合的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，使用附接到所述流槽上的压电元件来施加所述振动，其中，电能转换成声能。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使所述流槽的内部温度升高到环境温度以上，以加强染色或脱色。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过所述流槽的真空通风来减少所述流槽内的气泡形成。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述活化脱色剂的前体试剂从一个或多个试剂储槽传送至所述预混器，其中，所述前体试剂以预定浓度输送至所述预混器。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一个或多个步骤(b)-(e)由处理器控制。
15.一种用于生物样本的反复染色的自动装置，包括与预混器流体连通的流槽，其中，所述预混器的体积容量小于所述流槽的体积容量的大约五倍。
16.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述流槽的体积容量在1μL至1000μL之间，而所述预混器的体积容量小于5μL至5000μL。
17.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述流槽的体积容量在50μL至500μL之间，而所述预混器的体积容量小于250μL至2500μL之间。
18.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述预混器还包括泵和紊流生成器，以增加至少两种前体试剂的混合。
19.根据权利要求18所述的装置，其特征在于，所述紊流生成器为混合喷嘴、多孔过滤器、球形阻挡件或微孔。
20.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述流槽包括构造成用来容纳组织样本的底座；热电元件；位于所述底座与所述热电元件之间的垫圈；与所述预混器流体连通的入口端口；以及出口端口；其中，所述底座和所述热电元件中的一者或两者包括图像采集窗口。
21.根据权利要求20所述的装置，其特征在于，所述装置还包括用来除去所述流槽内存在的气体的脱气器。
22.根据权利要求20所述的装置，其特征在于，所述装置还包括附接到所述流槽上的压电元件，并且其中，所述压电元件能够通过将电能转化成声能来在所述流槽内产生振动。
23.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述装置还包括与所述预混器流体连通的试剂储槽。
24.根据权利要求23所述的装置，其特征在于，所述装置还包括预混器控制器和试剂流动控制器。
25.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述预混器控制器、所述试剂流动控制器和附接到所述热电元件上的可选的温度控制器与处理器结合，并且其中，所述处理器配置成用来控制所述装置的一个或多个运行参数。
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