CN101978272A - 基于纸的细胞阵列 - Google Patents

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Abstract

公开了三维细胞阵列、制备三维细胞阵列的方法及使用所述阵列鉴定制剂的方法。三维细胞阵列含：多孔亲水基质，其中所述基质含多个多孔区，各多孔区至少部分被不透液界面束缚；及含细胞的水凝胶，其中所述水凝胶被嵌入所述多孔区内。制备三维细胞阵列的方法包括：提供多孔亲水基质，其中所述基质含多个多孔区，各多孔区至少部分被不透液界面束缚；及使所述多孔亲水基质与细胞和温度敏感性水凝胶或离子型水凝胶前体的悬浮液接触，其中所述悬浮液浸透所述基质的一个或多个多孔区。鉴定制剂的方法包括：提供描述的修饰细胞功能的阵列；使所述阵列与一种或多种测试制剂接触；及检测在所述一种或多种测试制剂存在下的一种或多种细胞功能；其中在所述一种或多种测试制剂存在下细胞功能的变化指示所述一种或多种测试制剂修饰细胞功能。

Description

基于纸的细胞阵列
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年3月27日提交的美国临时专利申请No.61/040,030、2008年3月27日提交的美国临时专利申请No.61/040,010、2008年9月17日提交的美国临时专利申请No.61/097,718及2009年1月22日提交的美国临时专利申请No.61/146,413的权利，其全部内容通过引用整体并入本文。
背景技术
细胞在体内位于作为部分组织和器官结构的组织化三维环境中。所述组织机化的损失为癌症的特征(Wodarz，et al.，Nature Cell Biology 9：1016-1024(2007)；Lee，et al.，J.Cell Sci.121：1141-1150(2008)；Morrison，et al.，Nature 441：1068-1074(2006))。近一个世纪以来，在生物体外(离体)培养的细胞上进行的研究已推动了癌症研究和抗癌制剂发现的进展(Ebeling，J.Exp.Med.17：273-285(1913)；Carrel，et al.，J.Exp.Med.13：387-U34(1911)；Carrel，et al.，J.Exp.Med.13：571-575(1911)；Leighton，Cancer Res.17：929-941(1957)；Paul，Cancer Res.22：431-&(1962))。用二维表面上培养的细胞进行了大多数的所述研究。已广泛认识到在所述条件下培养的细胞和体内的细胞间的形态和功能差异，且已显示三维细胞生长基质呈现出体内细胞环境的更生理相关模型(Yamada，et al.，Cell 130：601-610(2007)；Nelson，et al.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.22：287-309(2006)；Huang，et al.，Nature cell biology 1：E131-E138(1999)；Schmeichel，et al.，J.Cell Sci.116，2377-2388(2003))。重要的是，在二维基质上培养的细胞通常不应答影响三维环境中细胞的可溶性因子(Emerman，et al.，In Vitro-Journal of the Tissue Culture Association 13：316-328(1977)；Emerman，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：4466-4470(1977)；Cukierman，et al.，Science 294：1708-1712(2001)；Bissell，et al.，Differentiation 70：537-546(2002)；Weaver，et al.，J.Cell Biol.137：231-245(1997))。然而，迄今为止，大多数药物发现过程始于基于二维培养的测定中的小分子筛选。在动物和人体试验中已鉴定的化合物的失败迫使药物发现的花费至＞10亿美元/新化合物(Griffith，et al.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.7：211-224(2006))。基于三维培养物的高通量测定允许在药物发现过程的第一步中进行药物有效性和毒性的评估。将三维细胞培养物并入基础和应用癌症研究的每方面将促进用于癌症治疗的新疗法的发现。
三维环境与二维环境中细胞应答的不同源自于细胞极性、基质粘附位点的细胞广泛分布及细胞对所述基质机械特性应答的不同(Yamada，et al，.2007；Huang，et al.，1999)。在分子水平上，通过整合素信号通路与其酪氨酸激酶受体间的交叉感知调控所述事件。基质的化学组成、整合素配体的纳米和微米级分布之类的特性(Cukierman，et al.，2001；Chen，et al.，Science 276：1425-1428(1997))及基质的机械特性(Engler，et al.，Cell 126：677-689(2006)；Pelham，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：13661-13665(1997)；Yeung，et al.，Cell Motil.Cytoskeleton 60：24-34(2005))可影响所述通路和调节细胞行为。此外，通过扩散驱使对凝胶样基质中细胞的氧和营养物质传递。因此，基质的结构尺寸也在三维细胞培养中起作用。由于扩散的限制，在离体三维基质中细胞的增殖通常为低于几百微米的深度所限制。因此，在三维培养中必须小心控制所述基质的大小、组成和机械特性。
在二维培养和三维培养并行发展的数十年后，二维培养方法的简单性使其成为细胞离体研究的主导技术。控制多种化学和物理特性的需要使细胞的三维培养有更高的劳动密集性和更低的再现性。
发明概述
一方面，本发明展现了三维细胞阵列。所述细胞阵列包括含多个多孔区，各多孔区至少部分被不透液界面束缚的多孔亲水基质及含细胞的水凝胶，其中所述水凝胶被嵌入所述多孔区内。在一实施方式中，所述基质是：纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
在一实施方式中，所述水凝胶是温度敏感性水凝胶。在特定的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶为基质胶或胶原蛋白。在一些实施方式中，所述水凝胶是离子型水凝胶。在特定的实施方式中，所述离子型水凝胶包含：海藻酸(AA)、羧甲基纤维素(CMC)、叔卡拉胶、聚(半乳糖醛酸)(PG)、聚(双(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。
在其他的实施方式中，所述不透液界面包含：PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
在某些实施方式中，所述阵列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1,000或更多个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。在特定的实施方式中，所述阵列包含96、384、1536或3456个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。
在一些实施方式中，所述细胞是：细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
另一方面，本发明展现了制备三维细胞阵列的方法。所述方法包括：提供多孔亲水基质，其中所述基质含多个多孔区，各多孔区至少部分被不透液界面束缚；及使所述多孔亲水基质与细胞和温度敏感性水凝胶或离子型水凝胶前体的悬浮液接触，其中所述悬浮液浸透所述基质的一个或多个多孔区。在一实施方式中，所述基质是：纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
在一实施方式中，所述水凝胶是温度敏感性水凝胶。在特定的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶为基质胶或胶原蛋白。在一些实施方式中，所述水凝胶是离子型水凝胶。在特定的实施方式中，所述离子型水凝胶包含：海藻酸(AA)、羧甲基纤维素(CMC)、叔卡拉胶、聚(半乳糖醛酸)(PG)、聚(双(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。
在一实施方式中，所述方法还包括在使所述细胞的悬浮液与所述基质接触前，用胶凝剂润湿(例如浸透)所述基质。在一些实施方式中，所述胶凝剂为金属离子。在特定的实施方式中，所述胶凝剂为：Pb2+、Ba2+、Fe3+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Ho3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mn2+或Mg2+。
在一些实施方式中，所述不透液界面包含：PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
在某些实施方式中，所述阵列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1,000或更多个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。在特定的实施方式中，所述阵列包含96、384、1536或3456个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。
在一些实施方式中，所述细胞是：细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
另一方面，本发明展现了制备三维细胞阵列的方法。所述方法包括：提供多孔亲水基质；使所述基质的多个指定区与包含细胞和温度敏感性水凝胶或离子型水凝胶前体的悬浮液接触，其中所述悬浮液浸透所述基质的多个指定区；及使所述温度敏感性水凝胶或所述离子型水凝胶前体与胶凝剂接触，其中所述胶凝剂诱导被嵌入所述基质的多个指定区的水凝胶的形成。在一实施方式中，所述基质是：纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
在一实施方式中，所述水凝胶是温度敏感性水凝胶。在特定的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶为基质胶或胶原蛋白。在一些实施方式中，所述水凝胶是离子型水凝胶。在特定的实施方式中，所述离子型水凝胶包含：海藻酸(AA)、羧甲基纤维素(CMC)、叔卡拉胶、聚(半乳糖醛酸)(PG)、聚(双(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。
在一实施方式中，所述方法还包含在使所述细胞的悬浮液与所述基质接触前，用胶凝剂润湿(例如浸透)所述基质。在一些实施方式中，所述胶凝剂为金属离子。在特定的实施方式中，所述胶凝剂为：Pb2+、Ba2+、Fe3+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Ho3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mn2+或Mg2+。
在一些实施方式中，所述细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述方法还包含使所述阵列与培养基接触。
另一方面，本发明展现了鉴定修饰细胞功能的制剂的方法。所述方法包括：提供本文所述的阵列；使所述阵列与一种或多种测试制剂接触；及检测在所述一种或多种测试制剂存在下的一种或多种细胞功能；其中在所述一种或多种测试制剂存在下细胞功能的变化指示所述一种或多种测试制剂修饰细胞功能。
在一些实施方式中，阵列包括含多个多孔区，各多孔区至少部分被不透液界面束缚的多孔亲水基质及含细胞的水凝胶，其中所述水凝胶被嵌入所述多孔区内。在一实施方式中，所述基质是纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
在一实施方式中，所述水凝胶是温度敏感性水凝胶。在特定的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶为基质胶或胶原蛋白。在一些实施方式中，所述水凝胶是离子型水凝胶。在特定的实施方式中，所述离子型水凝胶包含：海藻酸(AA)、羧甲基纤维素(CMC)、叔卡拉胶、聚(半乳糖醛酸)(PG)、聚(双(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。
在其他的实施方式中，所述不透液界面包含：PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
在某些实施方式中，所述阵列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1,000或更多个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。在特定的实施方式中，所述阵列包含96、384、1536或3456个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。
在某些实施方式中，所述阵列于多个多孔区与所述一种或多种测试制剂接触。在特定的实施方式中，所述阵列于96、384、1536或3456个多孔区与所述一种或多种测试制剂接触。在一些实施方式中，各多孔区与不同测试制剂接触。
在一些实施方式中，所述测试制剂是小的有机或无机分子、氨基酸、多肽、核酸、肽核酸、碳水化合物或多糖。在一些实施方式中，所述测试制剂是测试试剂库(例如组合化学品库)的成员。
在其他的实施方式中，所述细胞功能是增殖、迁移、活力或基因转录。
另一方面，本发明展现了鉴定修饰细胞功能的制剂的方法。所述方法包括：提供本文所述的三维阵列；将所述基质切成多个区段，各区段具有相等尺寸；使各区段与测试制剂或对照接触；及检测在所述测试试剂存在下的一种或多种细胞功能，其中在所述一种或多种测试制剂存在下细胞功能的变化指示所述测试制剂修饰细胞功能。在一些实施方式中，所述细胞功能是增殖、迁移、活力或基因转录。
在一些实施方式中，各区段被放置进96孔、384孔、1536孔或3456孔板的孔中。在一些实施方式中，各孔包含不同的测试试剂。在一些实施方式中，所述测试制剂是有机或无机小分子、氨基酸、多肽、核酸、肽核酸、碳水化合物或多糖。在一些实施方式中，所述测试制剂是测试试剂库(例如组合化学品库)的成员。
在一些实施方式中，所述细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
另一方面，本发明展现了三维微阵列。所述微阵列包含：具有多个孔的无底微孔板及含多个多孔区和多个不透液界面，各多孔区被不透液界面束缚的多孔亲水基质；其中所述孔和所述不透液界面以相同的图案排列，所述微孔板和所述基质附着，由此所述多个孔对齐，且密封连接至所述多个不透液界面，以形成针对各多孔区的单个室。在一些实施方式中，所述基质的所述多孔区在水凝胶中包含细胞。
在一实施方式中，所述水凝胶是温度敏感性水凝胶。在特定的实施方式中，所述温度敏感性水凝胶为基质胶或胶原蛋白。在一些实施方式中，所述水凝胶是离子型水凝胶。在特定的实施方式中，所述离子型水凝胶包含：海藻酸(AA)、羧甲基纤维素(CMC)、叔卡拉胶、聚(半乳糖醛酸)(PG)、聚(双(4-羧基苯氧基)-磷腈或PuraMatrix。
在其他的实施方式中，所述不透液界面包含：PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
在某些实施方式中，所述阵列包含1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1,000或更多个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。在特定的实施方式中，所述阵列包含96、384、1536或3456个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。
在一些实施方式中，所述细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
另一方面，本发明展现了鉴定修饰细胞功能的制剂的方法。所述方法包括：提供微阵列，其包含具有多个孔的无底微孔板及含多个多孔区和多个不透液界面，各多孔区被不透液界面束缚的多孔柔性基质；其中所述孔和所述不透液界面以相同的图案排列，所述微孔板和所述基质附着，由此所述多个孔对齐，且密封连接至所述多个不透液界面，以形成针对各多孔区的单个室；使所述阵列与一种或多种测试试剂接触；及检测在所述测试试剂存在下的一种或多种细胞功能，其中在所述一种或多种测试制剂存在下细胞功能的变化指示所述一种或多种测试制剂修饰细胞功能。
在一些实施方式中，所述测试制剂是有机或无机小分子、氨基酸、多肽、核酸、肽核酸、碳水化合物或多糖。在一些实施方式中，所述测试制剂是测试试剂库(例如组合化学品库)的成员。在一些实施方式中，各孔包含不同的测试试剂。
另一方面，本发明展现了图案修饰多孔疏水基质的方法，所述方法包括：使多孔疏水基质与含水溶性化合物的水溶液接触，所述溶液浸润所述基质以形成浸透所述溶液的所述基质的第一区和不与所述溶液接触的第二区；使所述基质与疏水材料接触，所述疏水材料浸透所述第二区；及除去所述水溶性化合物，产生被所述疏水材料束缚的亲水多孔区。
在一些实施方式中，所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、苏糖醇、甘露糖或甘油。在一些实施方式中，所述水溶液被点斑、打印、画或盖印在所述多孔疏水基质上。在特定的实施方式中，所述溶液用喷墨打印机打印。
在其他一些实施方式中，所述疏水材料包含：PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
在某些实施方式中，所述基质被图案修饰为1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1,000或更多个多孔区，各多孔区被疏水材料束缚。在特定的实施方式中，所述基质被图案修饰为96、384、1536或3456个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。
在一些实施方式中，所述基质是：硝酸纤维素、醋酸纤维素、纤维素纸、滤纸、布或多孔聚合物膜。
另一方面，本发明展现了图案修饰多孔疏水基质的方法，所述方法包括：使多孔疏水基质与疏水材料接触，所述疏水材料浸透所述基质；使所述基质区与含水溶性化合物的水溶液接触，所述溶液从所述区置换所述疏水材料；及除去所述水溶性化合物，产生被所述疏水材料束缚的亲水多孔区。
在一些实施方式中，所述水溶性化合物是：蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、苏糖醇、甘露糖或甘油。在一些实施方式中，所述水溶液被点斑、打印、画或盖印在所述多孔疏水基质上。在特定的实施方式中，所述溶液用喷墨打印机打印。
在其他一些实施方式中，所述疏水材料包含：PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
在某些实施方式中，所述基质被图案修饰为1、2、3、4、5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、1,000或更多个多孔区，各多孔区被疏水材料束缚。在特定的实施方式中，所述基质被图案修饰为96、384、1536或3456个多孔区，各多孔区被不透液界面束缚。
在一些实施方式中，所述基质是纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、纤维素纸、滤纸、布或多孔聚合物膜。
在一些方面中，在无水凝胶的情况下，本文所述阵列可包括被嵌入多孔疏水基质内的细胞。
附图说明
当与附图一起阅读时，可从下列描述更全面理解本发明的上述和其他目的、它们的各种特征及本发明本身，其中
图1A是示使用空白纸的三维细胞阵列的制备的示意图，而图1B是示使用被图案修饰为亲水区和疏水区的纸的制备的示意图。图1C是用HS-5基质细胞在基质胶中的悬浮液点斑，并用缀合Alexa Fluor 633的鬼笔环肽染色的层析纸的代表性扫描图像的拼接图。图1D是来自图1C的4～6个测量结果的平均值的坐标图，且误差棒相当于一个标准差。图1E是被点斑至经SU8图案修饰的纸上、在培养基中悬浮24小时、固定且用SYTOX染料染色的HUVEC细胞在基质胶中的悬浮液的凝胶扫描仪图像。图1F是来自图1E的4～6个测量结果的平均值的坐标图。
图2A是通过用碳水化合物的水溶液预处理所述纸而将疏水材料图案修饰至纸上(“甜水图案修饰(sweet patterning)”)的过程示意图。图2B是用蔗糖、PDMS、然后苋菜红水溶液处理的纸的数字表示。图2C是用蔗糖、聚苯乙烯、然后苋菜红水溶液处理的纸的数字表示。
图3A是用各种化合物、PDMS、然后苋菜红水溶液处理的纸的数字表示。图3B是用各种化合物、PDMS、然后苋菜红水溶液处理的纸的数字表示。图3C是用各种化合物、聚苯乙烯、然后苋菜红水溶液处理的纸的数字表示。(使用的缩写：n/s-未溶解；n/d-未测定)
图4A是“甜水图案修饰(sweet patterning)”的示意图。图4B是用PDMS、蔗糖、然后苋菜红水溶液处理的纸的数字表示。
图5A和5B是使用喷墨打印机用蔗糖图案修饰的纸的数字表示。图5C是使用自来水笔用蔗糖图案修饰的纸的数字表示。图5D是盖印蔗糖图案至纸上的示意图和用蔗糖图案修饰的纸的数字表示。
图6描绘了使用用包含细胞的水凝胶渗透的数张叠加的纸的三维细胞阵列进行(A)细胞迁移、(B)交叉迁移和侵入及(C)三维共培养的研究的示意图。
图7A、7B和7C是描绘分层测定与对影响三维生长基质中细胞增殖和迁移的小分子进行的高通量筛选的整合的示意图。
图8A是描绘微孔筛选格式与三维细胞阵列的整合的示意图。图8B是纸中或具有基质胶的纸中的3T3细胞增殖的坐标图。
图9描绘了在包含基质胶的三维细胞阵列中生长的各种细胞类型的坐标图和共聚焦图像。将4μL(图9A～9D)或1uL(图9E～9H)细胞在基质胶中的悬浮液(107细胞/mL)点斑到空白滤纸上，且在适当的培养基中悬浮所述纸。在指定的时间点，从培养基中除去所述细胞阵列并用甲醛固定。在时间过程的最后，用经荧光标记的鬼笔环肽对全部样品进行染色，并使用荧光凝胶扫描仪和ImageJ进行定量。各数据点为4个测量结果的平均值，误差棒相当于一个标准差。
图10是在二维和三维纸细胞阵列上的HUVEC细胞中各种基因的相对表达水平的坐标图。
图11A是示用于研究HUVEC细胞的三维迁移的两步方案的示意图。图11B是在各种条件下随时间的HUVEC细胞迁移的凝胶扫描仪图像。
图12A是使用包含BHK细胞的纸和微孔板的病毒感染测定的示意图。图12B是从包含纸支持的基质胶基质中被感染的BHK细胞的96孔板读取发光的坐标图。
图13A是被点斑至滤纸上且在各种条件下生长的基质胶中的PC12细胞的凝胶扫描仪图像。图13B是被点斑至滤纸上且在各种条件下生长的基质胶中的PC12细胞增殖的坐标图。
图14描绘了在经基质胶(“2D”)薄层、允许胶化以形成基质胶包裹的PC12细胞在基质胶中的悬浮液(“3D”)，或渗透入纸内的PC12细胞在基质胶中的悬浮液(“纸”)包被的表面上平铺的PC12细胞的NGF诱导分化的定量PCR分析的坐标图。
图15A是描绘了用细胞在基质胶中的悬浮液渗透叠加的多层纸以研究在营养和氧有限条件下的细胞增殖的示意图。图15B描绘了培养7天后8层的HUVEC细胞叠加物的层中细胞密度的扫描图像和定量。用缀合Alexa Fluor 633的鬼笔环肽对细胞进行染色，使用凝胶扫描仪进行成像并使用ImageJ进行分析。在所有层中的灰度强度以在第一天的细胞灰度强度进行标准化。竖的红线和蓝虚线分别标明第7天和第1天非叠加层中细胞的染色强度。所有的数据点是8个测量结果的平均值，且误差棒相当于一个标准差。图15C和D是顶层中在第7天形成的腔和8层的HUVEC细胞叠加物的底层中小腔的网络的共聚焦图像。用AF488-鬼笔环肽对细胞进行染色。图15E是培养9天后6层的HDF成纤维细胞叠加物的层中细胞密度的定量的坐标图。图15F是培养9天后8层的IMR-90成纤维细胞叠加物的层中细胞密度的定量的坐标图。图15G是培养9天后8层的HS-5骨髓基质细胞叠加物的层中细胞密度的定量的坐标图。图15H是培养9天后8层的MDA-MB-231叠加物的层中细胞密度的定量的坐标图。图15I描绘了在8堆增殖9天的MDA-MB-231细胞中代谢活性(钙黄绿素染色)、总肌动蛋白(Texas Red鬼笔环肽染色)、总DNA(sytox染色)和增殖细胞(Click-iT
Figure BPA00001230434600111
染色)的总数量及低氧标记物的表达水平(针对VEGF和IGFBP3的定量PCR)的定量。
图16A是为研究细胞是否可在基质胶渗透的纸的各层间迁移而设计的实验的示意图。将细胞在基质胶中的悬浮液和无细胞的基质胶点斑至纸条上。折叠和紧贴所述纸，在底部放置醋酸纤维素板，并培养所述叠加物9天。(B)细胞在各层间迁移的方向的示意草图。箭标指示细胞至邻近板的迁移；迁移可发生在更接近主体培养基溶液的覆盖层(红色箭标)或离主体培养基更远的下层(蓝色箭标)。(C)包含培养9天的HDF细胞的未折叠纸的代表性图像。用甲醛固定所述纸，用AF647鬼笔环肽进行染色并使用荧光凝胶扫描仪进行成像。(D)HDF细胞迁移的定量分析。向主体溶液的迁移在除了最底层的所有层中占优势。所得结果为4个实验的平均值。误差棒相当于一个标准差。使用两尾、两样本不等方差t检验来获得p值：＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。(E)HDF细胞迁移的定量分析。向主体溶液的迁移在除了最底层的所有层中占优势。所得结果为5个实验的平均值。误差棒相当于一个标准差。＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。
图17A是示使用叠加的三维细胞阵列来分析细菌培养物的示意图。图17B是在各层中死亡的铜绿假单胞菌PA14细胞的数量的坐标图。图17C是在各层中活的铜绿假单胞菌PA14细胞的数量的坐标图。
图18A是具有可通过叠加有洞(“wH”)和没有洞(“woH”)的材料板创建的孔的平板的示意图。图18B是在夹在图18A所示的“wH”和“woH”层之间的经图案修饰的纸上接种的细胞的示意图。图18C描绘了包含一层含有细胞的经图案修饰的纸的系统。不同“孔”中纸中的细胞可暴露于不同溶液。图18D是示迁移测定的示意图。图18E描绘了无底96孔板。图18F描绘了被图案修饰为疏水区和亲水区内的纸。图18G描绘了平坦的底部表面。图18H描绘了在图18E、18F和18G中所述元件的组合，产生了每个孔都包含一层纸和每个孔可接触不同溶液的96孔平台。
图19A是允许筛选不同几何形状的3D培养物的平台的示意图。可使用穿孔纸的叠加物来创建在其中具有通道腔的3D结构。图19B是所述穿孔纸之一的照片。图19C是与不锈钢容器一起压的8张穿孔纸的叠加物的照片。不同孔中纸支持的培养物具有不同的3D几何形状。图19D是一个所述“几何形状筛选”的结果。在提高了厚度(顶部箭标)或提高了“腔”大小(底部箭标)的MDA-MB-231细胞叠加物中研究细胞的代谢活性(由钙黄绿素染色确定)和细胞的总数量(由肌动蛋白染色测量)。
发明详述
将所有出版物、专利申请、专利或本文提及的其他文献通过引用整体并入本文。此外，所述材料、方法和例子仅为解说性的而不认为是限制性的。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有由本发明所属领域的任一普通技术人员通常理解的相同含义。申请者保留将来自任何所述专利、出版物、科学文章、网站、电子方式可得的信息及其他参考的材料或文献的任何和全部材料和信息完全并入本说明书的权利。尽管可在本发明的实践和测试中使用类似于或相当于本文所述的方法和材料，合适的方法和材料如下所述：
总述
本发明至少部分基于以三维纸为基础的细胞阵列的制备和使用。用于三维细胞培养物独特特征产生的微制造基质难以被采用，因为许多细胞生物学研究组缺乏用于微制造的专业知识或设备(例如，洁净室)。另外，许多微制造技术很适合于研究少量细胞，但其难以被用于大规模的测定和筛选。在基于三维细胞的测定中的突破取决于允许三维基质所需的全部特性的控制的简单和可升级技术。可使用本文所述方法来制备所述三维基质。
三维细胞阵列
在某些情况下，本公开内容提供了能生长和维持细胞的三维细胞阵列。所述细胞阵列包括多孔柔性基质和嵌入基质内的包含细胞的水凝胶。在图1A和1B中示意性的显示了例示三维细胞阵列。如图1A和1B所示，三维细胞阵列1300包括在基质1330、1340内的区域或“孔”1310、1320。所述孔在被注入基质多孔网络内的三维水凝胶1350内包含细胞。所述基质提供了所述细胞可位于的3D支架。
如本文所述，可通过使用图1A和1B所示的施加器1360使所述细胞在水凝胶或水凝胶前体中的悬浮液接触(例如点斑)基质。当所述基质是多孔和亲水的，通过基质的厚度及细胞悬浮液经基质1330吸走或横向扩散的距离指定孔1310的尺寸(见图1A)。因为当液体和凝胶被点斑至纸或其他多孔亲水基质时其产生所确定横向尺寸的斑，可通过将确定量的细胞在水凝胶前体中的悬浮液点斑至多孔亲水基质获得所需横向尺寸的三维细胞培养物。可通过控制被点斑的液体体积来控制所述斑的横向尺寸(即三维培养物的横向尺寸)。通过疏水材料的厚度确定三维培养物的垂直尺寸(厚度)。点斑过程的重复在单独的一张纸上产生了图案修饰的三维培养物(即细胞阵列)。进行所述点斑以便通过存在的细胞培养物和筛选界面轻易识别所得图案(例如通过点斑具有4.5mm纵向和横向间距的斑的16×24阵列生成384孔的布局)。
当所述基质被图案修饰(例如包含亲水区和疏水区)时，如图1B中基质1340所示的，通过基质的厚度和基质亲水区的大小指定孔1320的尺寸(见图1B)。在所述实施方式中，通过疏水性屏障或孔1370束缚亲水区，其限制细胞悬浮液的横向流动。
在使细胞和水凝胶或水凝胶前体的悬浮液与基质接触后，在允许水凝胶在基质内凝胶化的合适条件下维持所述基质。如本文所述，合适的条件包括在特定的温度下维持所述基质或使所述基质与胶凝剂接触。所得的三维细胞阵列是稳定的且可在适于细胞生长的条件中被维持。本领域已知所述培养条件(见例如Culture of Animal Cells：AManual of Basic Techniques，Freshney，R.I.ed.，(Alan R.Liss & Co.，New York 1987)；Animal Cell Culture：A Practical Approach，Freshney，R.I.ed.，(IRL Press，Oxford，England 1986))。例如，可使细胞阵列浸入适于特定细胞类型的细胞培养基中并在培养箱中维持。
图1C是描绘图1A的三维细胞阵列1300的一系列图像。在图1C所示的例示阵列中，用手持的Gilson P10移液管将1～5μL在基质胶中悬浮的HS-5细胞点斑至层析纸1330上。使用不同浓度的细胞悬浮液来改变每个点斑区域的细胞数量。可使点斑的纸浸入37℃的培养基24小时。然后用甲醛固定所述纸，用缀合Alexa Fluor 633的鬼笔环肽进行染色并使用Typhoon凝胶扫描仪进行成像。所示图像为各点斑区代表性扫描图像的拼接图。使用ImageJ进行图像的定量。
控制点斑量允许细胞填充区域横向尺寸的调节。如图1C所示，通过点斑1～5μL基质胶悬浮液制备具有2～8mm直径的细胞填充区域1350。改变点斑溶液中的细胞浓度，同时保持细胞生长区域横向尺寸的恒定。通过测量扫描图像(图1D中所示)中包含细胞区域的灰度强度来评估纸中的细胞密度。如图1C所证明，细胞在基质胶中的悬浮液的点斑允许确定厚度和横向尺寸的三维基质的重复性生成，其存在良好确定的细胞数量。此外，可使用常规的凝胶扫描仪快速定量纸支持的基质中的细胞密度。
图1E是描绘图案修饰的基质1340上图1B的三维细胞阵列1300的图像。在图1E所示的例示阵列中，使用标准的荧光和比色技术显示嵌入细胞阵列所述孔中的细胞。将荧光凝胶扫描仪用于定量鉴定。当用SYTOX染料对细胞进行染色时确定在图案修饰基质1340的区域1350中的细胞数量(见图1F)。
可由多孔亲水基质制造本文所述的细胞阵列。在一些实施方式中，所述基质是纸，例如层析纸。然而，可使用通过毛细作用吸走流体的任何基质，其包括但不限于：硝酸纤维素和醋酸纤维素、纤维素纸、过滤纸、布及多孔聚合物膜。
纸的许多物理参数使其成为用于支持细胞三维培养的有吸引力的候选物：(1)纸是廉价、无毒、惰性多孔基质；(2)良好确定厚度(＞20μm)的平整纸张在世界范围内是易得的；(3)可将纸图案修饰为亲水区和疏水区；水溶液可轻易接受亲水区的尺寸；(4)所述纸的机械特性可被改变；及(5)纸可被轻易做成、分层或折成不同的形式。基于所述特性，纸可充当天然或合成的细胞粘着水凝胶的模具。可将纸用为接受，或无需引入疏水性壁来确定所述孔。当水凝胶吸入纸内时，通过纸的所述特性指定水凝胶的大小和厚度(见例如图1A)。
在一些情况下，使用图案修饰基质(例如经图案修饰的纸)制备所述三维细胞阵列。因为液体和凝胶可轻易吸进纸基质内，图案修饰具有不透(疏水)液界面的所述纸可被用来规定细胞生长基质的物理尺寸和形状。因此，在一些实施方式中，将所述基质图案修饰为疏水区和亲水区。可使用图案修饰亲水基质的任何方法。举例而言，可将疏水层直接施加于多孔基质以使用打印(如由喷墨打印机)、液体输送(如用盖印)或其他打印方法或丝网印刷法产生具有亲水和疏水特性的图案修饰区。也可使用光刻法制备疏水图案，其中所述纸充满光刻胶，然后暴光以产生疏水光刻胶的区域和去除亲水抗性的纸的区域。例示方法为本领域已知和在例如WO 2008/049083中所述，其通过引用整体并入本文。
制造所述经图案修饰的纸基质的例示方法包括光图案修饰技术，其中用商用的光反应性聚合物(例如SU8)浸透纸，并覆盖存在于所需图案中的透明物质，且将所述纸短暂暴露于UV光。当用适当的溶剂(例如丙酮)洗涤时，从产生所需图案的暴露区域去除所述聚合物。
本文所述的另一例示方法为“甜水图案修饰”。在某些实施方式中，使用水溶性化合物(如糖或它们的衍生物(例如多元醇，例如木糖醇))图案修饰本文所述的基质。所述方法源于观察即疏水性溶液不能渗入充满水溶液的纸的区域。相反地，疏水溶剂形成纸内的互补图案(见例如图2A)。因此，可将疏水基质的一部分与水溶性化合物接触，其浸润多孔基质以形成用包含水溶性化合物的水溶液浸透的特异形状区。也可使用水之外的溶剂，其可使极性化合物溶解且不能与相应的疏水溶剂混合。然后可使所述基质与疏水材料接触，其浸透所述基质的暴露区域，但不渗入水浸透的区域。疏水材料可包含聚合物或聚合物前体，其可被处理以设置或固化所述聚合物，例如通过加热、蒸发或光聚合。随后可从亲水基质去除所述水溶性化合物，留下了由疏水材料界定的亲水多孔区。在某些实施方式中，所述水溶性化合物为蔗糖(例如在水溶液中)。在其他的实施方式中，所述疏水材料为例如PDMS、聚苯乙烯或在用来产生疏水溶液的溶剂中可溶的其他任何疏水材料。
在一些实施方式中，通过例如点斑、打印、画或盖印使所述基质与水溶性化合物接触。在基于常规喷墨打印的图案修饰策略中，通过打印蔗糖溶液至纸上来创建所需疏水图案的反面。然后将所述纸浸入充满无蔗糖区的聚苯乙烯(或其他聚合物)溶液。用水洗涤后，去除蔗糖模板并获得所需的亲水-疏水图案。
图2A示意性的说明了用水溶液320(例如水溶性化合物的水溶液(例如蔗糖水溶液))图案修饰亲水多孔基质310(例如纸)的一种方法。在所述实验中，将蔗糖水溶液点斑至纸上，其在纸中形成水溶液浸透区330。然后将所述纸浸入疏水溶液340内。疏水溶液是在不能与水溶液混合的疏水溶剂中的任何聚合物的溶液。例如，疏水溶液可包含聚合物前体(例如PDMS)或聚合物(例如聚苯乙烯、PLGA)。所述两种不能混合的液相在多孔基质上分离以提供含水区330和疏水区350。由于相分离，疏水溶液不修饰被水溶液点斑的纸的区域。可处理所述疏水溶液以设置或固化所述聚合物，例如通过加热、蒸发或光固化。然后(例如用水)可冲走所述蔗糖，产生用疏水材料图案修饰的纸。因此产生的基质包括亲水未修饰的纸360和疏水修饰的纸370的区域。在多孔基质内不能混合的液体可互为模板：在基质上亲水图案的周围疏水溶剂形成互补的形状。
尽管图2A中的示意图说明了用水溶性化合物预处理所述基质和随后用疏水材料处理所述基质，在其他的实施方式中，可用疏水材料预处理所述基质和随后用水溶性化合物处理所述基质(见例如图4)。其在图4中被说明，其中基质被完全浸入疏水溶液以制备疏水基底510。疏水溶液包括如上所述的聚合物。在所述例子中，将水溶液520点斑至纸上，其在纸中形成了水溶液浸透区530。在疏水溶液中水溶液是不能混合的，且其在疏水基底510中形成了含水区530。可如上所述处理所述基质以提供包括亲水未修饰的纸和疏水修饰的纸的区域的基质(未显示)。
可使用大量已知技术的任一个来向所述基质施加所述水溶性化合物以制备亲水模板。例如，可通过点斑、打印、画或盖印来施加水溶性化合物的水溶液(见例如图5和实施例11)。打印技术是已知的且其包括喷墨打印机、自来水笔等的使用。也可通过画(如丝网印刷法、刮胶法等)施加水溶液。对于盖印技术，印可由已知材料(例如橡胶、金属和纸)制成，并被设计来保持和转移所需量的液体(见，例如图5D)。也可在本文所述的方法中使用向基质施加液体、墨水、溶剂和染料等的其他已知方法。所述施加可通过手工或使用机器(例如自动化系统)。
本文所述的方法可利用任何水溶性化合物。所述化合物包括例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、苏糖醇、甘露糖、甘油和其他水溶性碳水化合物及至少与上文所列的一样可溶的它们的衍生物。可使用例如本文实施例1所述的测定来确定在给定的基质上及与给定的疏水材料一起使用的水溶性化合物的适当浓度。在一些实施方式中，水溶性化合物在非极性有机溶剂中是不溶的。在一些实施方式中，水溶性化合物是无机盐。
可使用本文所述的基于总体相分离的图案修饰技术来用许多类型的疏水材料图案修饰纸。例如，所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂或聚苯乙烯。可使用的其他疏水材料包括但不限于在有机溶剂中可溶(例如聚苯乙烯和其衍生物、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体(例如SU8)、蜡和脂肪)和/或通过在例如20～70℃由有机溶剂缩聚作用的聚合制备(例如PDMS、聚氨酯和环氧树脂衍生物、酚醛聚合物或丙烯酸酯及甲基丙烯酸酯衍生物)的任何塑料。
水凝胶
可通过使基质与吸入亲水基质的水凝胶或水凝胶前体接触来制备本文所述细胞阵列。在某些实施方式中，在向所述基质施加所述前体后形成水凝胶。与本文所述的图案修饰和非图案修饰多孔基质一起使用所述水凝胶。
可在本文所述的方法中使用任何已知的水凝胶。水凝胶基质如例如美国专利No.5,906,934、Lin et al.，Advanced Drug Delivery Rev.58：1379-1408(2006)及Jen et al.，Biotechnology and Bioengineering 50：357-364(2000)所述。可在本文所述方法中使用聚合物，其可形成韧性的离子型或共价交联的水凝胶。本文所用“水凝胶”是当经共价、离子或氢键交联聚合物以产生捕获水分子来形成凝胶的三维开放格子结构时形成的物质。所述聚合物可为有机聚合物。所述聚合物可为天然或合成的聚合物。本文所用“水凝胶前体”为经共价、离子或氢键交联以形成水凝胶的聚合物。
用来形成水凝胶的材料的例子包括：多糖(如海藻酸盐)、聚膦嗪和聚丙烯酸脂(其被离子交联)或嵌段共聚物(如PluronicsTM或TetronicsTM)、聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物(其分别通过温度或pH被交联)。其他的材料包括蛋白(如纤维蛋白)、聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、透明质酸和胶原蛋白。一般而言，所述聚合物在水溶液(如水、缓冲盐溶液或醇水溶液、具有带电侧基的或它们的一价离子盐)中至少是部分可溶的。
具有可与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的非限制性例子包括：聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙酯)、磺化聚合物(如磺化聚苯乙烯)。其他非限制性例子包括例如：海藻酸(AA)、羧甲基纤维素(CMC)、叔卡拉胶、聚(半乳糖醛酸)(PG)、聚(丙烯酸)(PAA)和聚(双(4-羧基苯氧基)-磷腈。也可使用具有由丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基的非限制性例子包括：羧酸基、磺酸基、卤代醇基、酚OH基和酸OH基。
具有可与阴离子反应的碱性侧基的聚合物的非限制性例子包括：聚(乙烯胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)及一些亚胺基取代的聚磷腈。也可由主链氮或悬挂式亚胺基形成聚合物的铵或季铵盐。碱性侧基的非限制性例子包括：氨基和亚氨基。
本文所用“胶凝剂”为交联水凝胶前体以形成水凝胶的任何试剂。例如胶凝剂可经共价、离子或氢键交联水凝胶前体以形成水凝胶。例如，通过所述聚合物与包含相反电荷胶凝剂(例如相反电荷的多化合价离子)的水溶液发生反应来离子交联具有带电侧基的水溶性聚合物。在一些实施方式中，所述聚合物具有酸性侧基，且所述胶凝剂为多化合价阳离子。在一些实施方式中，所述聚合物具有碱性侧基，且所述胶凝剂为多化合价阴离子。在一些实施方式中，所述胶凝剂为阳离子，例如Pb2+、Ba2+、Fe3+、Al3+、Cu2+、Cd2+、Ho3+、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Mn2+或Mg2+、Sr2+、Gd3+、Pb2+、Ra2+、Fe2+、Pd2+、Bi3+、Hg2+、Au3+、Co2+、Co3+、Cr2+、Cr3+、Mn4+、Pt2+、Pt4+、Sn2+、Sn4+、Ce3+、Ce4+、Ga3+、V3+或Rh3+。
在其他的实施方式中，所述水凝胶为温度敏感性水凝胶(如基质胶或胶原蛋白)，且通过提高基质温度至适当水平(如37℃)诱导凝胶化。通过将所述基质浸入适当温度的溶液内(例如适于特定细胞类型的培养基内)维持所述温度。温度敏感性水凝胶为本领域已知且为商业易得的。
细胞
用细胞并同时用阳离子溶液和/或水凝胶聚合物装载本文所述阵列。在一些实施方式中，在使所述阳离子溶液和/或水凝胶聚合物与所述基质接触后用细胞装载所述阵列。
在基于纸的细胞阵列中生长的细胞可为任何原核或真核细胞。所述细胞包括例如：细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞或PC12细胞)。其他例示细胞包括来自下列属成员的细胞：埃希氏菌属、杆菌属、乳杆菌属、红球菌属、假单胞菌属、曲霉属、木霉属、链孢霉属、镰刀菌属、腐殖菌属、根毛霉属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、毛霉菌属、毁丝霉(Myceliophtora)属、青霉属、白腐真菌属(Phanerochaete)、侧耳属、槐耳属、黄小孢子属(Chrysosporium)、酵母属、裂殖酵母属、子囊菌酵母属(Yarrowia)或链霉菌。其他的细胞包括：CD90+/CD45-肝肿瘤干细胞。在某些情况下，可用一种或多种表达载体或病毒载体转化或转染所述细胞。
多层细胞阵列
在某些实施方式中，可制造基于多层纸的细胞阵列。可通过叠加数层本文所述的任何三维细胞阵列制备所述阵列。例如，可叠加两个或更多个纸阵列(各阵列由包含细胞的水凝胶渗透)以制备多层阵列。在一个或多个实施方式中。可用一个或多个包含细胞的纸阵列覆盖包含无细胞水凝胶的一个或多个纸阵列以达到多层阵列。在一个或多个实施方式中，一层或多层可包含试剂，例如化学试剂，例如化学引诱物。例如，可在包含化学引诱物的纸板的顶部上叠加大量包含水凝胶的纸板，且在所述叠加物的顶部放置包含细胞的纸板。
测定
使用本文所述的三维细胞阵列进行本领域已知的任何基于细胞的测定。例如，可在筛选影响细胞功能(如细胞活力、凋亡、增殖、迁移和基因表达)的试剂中使用本文所述的三维细胞阵列。测试试剂可被添加至所述细胞阵列，可被吸附或被共价连接至水凝胶或基质(例如纸)，或也可被包括在基质(例如纸)上包被的生物降解性基质中。
在一些情况下，使三维细胞阵列接触测试试剂，并使用例如本文所述的测定来确定细胞目的特征(例如活力、凋亡、增殖、迁移或基因表达)。在所述测试试剂存在下细胞目的特征相对于对照(例如所述测试试剂不存在的情况)的改变指示所述测试试剂调节细胞功能。
在某些情况下，所述测试试剂被包含在孔(例如微孔板的孔)内，且使三维细胞阵列接触所述孔中的所述测试试剂。例如，所述测试试剂存在于微孔板孔内的培养基中，且可使所述细胞阵列接触(例如浸没于)包含所述测试试剂的所述培养基。在一些情况下，可在使所述细胞阵列与所述测试试剂接触之前和之后测量细胞的特征。在一些实施方式中，可将细胞阵列切成多个区段(例如条、块、盘、球)，且可将区段放置在微孔板的各孔中。
可将基于多层纸的阵列用于分析各种细胞特征，例如迁移、装配和增殖。例如，可将叠加的层用于三维液体引导(Martinez et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.105：19606-11(2008))。
在一些实施方式中，可使用基于纸叠加物的阵列作为迁移测定的平台。可在多层叠加系统中建立氧和营养物质的扩散梯度。因此，相同的测定格式提供了便利的系统来模拟实体瘤的内部环境。在一些实施方式中，可研究内皮细胞、内皮祖细胞(EPC)(Asahara et al.，Science 275，964-967(1997))和乳腺癌细胞向血管生成因子、向营养物质、氧或向化学引诱物的板间迁移。例如可使用基质胶中包含乳腺癌细胞的板和包含没有细胞的基质胶的板的叠加来研究细胞向包含“空白”基质胶的板的侵入。可选择包含细胞的叠加物和“空白”叠加物的特定顺序以研究所述迁移的方向(见图16)。
在其他的实施方式中，当叠加的板被拆开时可轻易定量位于不同深度(层)的细胞低氧诱导增殖、分化或凋亡。可在高通量筛选中使用迁移和低氧测定。
图6示例示的方法，其中在包含水凝胶的纸板层上叠加用经荧光标记的细胞接种的纸板，然后其叠在包含细胞粘附水凝胶加化学引诱物的纸上。
图6A是多层细胞阵列600的示意性说明。阵列600包括包含含细胞的孔620的多孔亲水基质610。阵列600也包括具有孔640的多孔亲水基质630。可用目的试剂(例如用来筛选细胞行为的试剂)预处理孔640。阵列600也包括插入板650。插入板650是多孔亲水基质，其可包括安置在插入板650内的水凝胶。阵列600被叠加以便亲水基质610、插入板650和亲水基质630是流体接触的。将阵列600放置于在细胞生长合适条件下的合适培养基中。然后去叠加阵列600，并确定在亲水基质610、插入板650和亲水基质630内的细胞660的数量。
图6B是另一个多层细胞阵列600的示意性说明。如图6B所示，阵列600包括多孔亲水基质610和620，其中亲水基质610包含含细胞类型611的水凝胶，且亲水基质620包含含细胞类型621的水凝胶。所述亲水基质610和620被叠加，被放置于细胞培养基内，然后被去叠加。分析亲水基质610和620中细胞类型611和细胞类型621的数量。
在特定的实施方式中，去叠加后，分离的纸叠加物中的细胞保持存活，且其可被分开培养或使用本文所述的任何测定对其进行鉴定以与分离的纸叠加物中的细胞比较。例如，使用细胞增殖试剂(例如Alamar Blue)或荧光测定(例如钙黄绿素染色，图15)可定量各板中活的细胞。可固定各层中的细胞，并用经荧光标记的试剂(例如标记DNA的SYTOX、标记F-肌动蛋白的鬼笔环肽，图15)对其进行定量。可裂解各板中的细胞，并使用所述裂解物来测量目的基因(例如VEGF和IGFPB3，图15)的表达水平或测量特异蛋白(例如用商业ELISA试剂盒测量低氧诱导因子(HIF)1和2)的细胞浓度。可从各板中酶解去除细胞，并通过流式细胞仪分析对其进行鉴定以评估存活、凋亡和坏死细胞的数量，及进行在各板中细胞种群的细胞周期分析。可使用荧光报告分子或细胞示踪染料来标记各板中的细胞，及追踪各层中各细胞的来源(图6B)。最后，从不同的层板分离的细胞的比较转录谱可在实体瘤及由多层细胞组成的其他非血管化三维结构内部发生的转化上提供新的见解。
在一些实施方式中，可使用叠加纸板中细胞的共培养来研究组织间的自组装、细胞的交叉迁移和在组织样环境中的低氧应答。例如，可使用纸上的三维细胞培养物来研究内皮细胞与周围组织的互作，其对血管网络形成及器官和肿瘤的营养输送是关键的。也可对内皮细胞形成的微环境进行检查，其对多种细胞类型的增殖和分化也是关键的。
可用包含其他细胞类型的阵列叠加包含细胞的纸阵列以制备共培养物(见例如图6C)。在所述纸板被拆开后易于研究在所述纸板共培养物中两种细胞类型的应答。例如，可使用内皮细胞和乳腺癌细胞共培养物的叠加阵列来研究组织向内生长(例如肿瘤转移、肿瘤血管化)。更具体而言，可使用报告细胞系进行包含内皮细胞和肿瘤细胞的纸板间细胞的交叉迁移(图6B)。可如上所述定量迁移前和迁移后各层中的细胞数量。
在另一个实施例中，可在多层的三维细胞阵列中与内皮细胞和乳腺癌细胞一起共培养内皮祖细胞(EPC)。已知体内的EPC与血管内皮互作，且其经受了作为归巢至缺血性或受伤组织的第一步的跨血管内皮迁移。相反地，EPC分泌因子增强血管化，并促进预存在的内皮细胞中的迁移应答(Urbich，et al.，Circ.Res.95：343-353(2004))。可将EPC放置于基于纸的基质中，然后用包含内皮细胞和乳腺癌细胞的层叠加以研究在内皮细胞-EPC共培养物中的长期反应。可研究所述细胞应答血管生成因子和氧浓度梯度的交叉迁移。可使用EPC和共培养的细胞类型的表达谱和流式细胞仪分析来鉴定它们的不同状态(图6C)。
在其他情况下，可使用“细菌的多层叠加物”来分析在各种条件下的细胞生长。例如，可使用细菌的多层叠加物作为细菌生物膜的模型，其为包含多层细菌的三维结构。生物膜各层中的细菌被暴露于不同条件(例如不同量的营养物质或氧)。可使用纸中生长和叠加的细菌来模拟生物膜中存在的营养物质/氧富集和限制的区。可使用不同层中细菌生物化学组成的分析来理解在生物膜形成期间发生的细菌转化。本领域已知生物膜内的氧/营养物质饥饿可能诱导细菌获得特定表型，其或多或少显示出对各种细胞毒性剂的易感性(K.Lewis，Nat Rev.Microbiol.2007，5，48-56)。因此，分析用不同测试试剂处理后多层细胞阵列的不同层中的细菌存活对鉴定处理细菌生物膜的试剂是有用的。
一例示系统如图17所示，其中多层纸中的细菌在氧/营养物质易得层(层1和8)或限制层(层2～7)中。如图17A所示，多孔疏水基质1710浸入细菌悬浮液中。叠加和培养所述基质1710。去叠加所述介质，并分析在层1711、1712和1713中细菌的生长。图17B描绘了来自被包括层1、2、3、4、5、6、7和8的叠加物1720的死细菌和活细菌分析。
高通量筛选
可将本文所述三维细胞阵列用于高通量筛选方法例如以筛选调节剂。在一些实施方式中，可用一种或多种潜在的调节剂点斑经图案修饰的纸(例如图案修饰为亲水区和疏水区)。然后用三维细胞阵列覆盖经图案修饰的纸，所述调节剂可扩散进所述阵列内，且可评估所述调节剂对阵列内细胞的作用。
图7示例示筛选方法。使用生物降解性聚合物(例如聚乳酸羟基乙酸、PLGA)的纸阵列中小分子的局部释放来进行基于细胞的高通量筛选(Bailey，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：16144-16149(2004))。在所述方法中，用细胞阵列覆盖用PLGA中小分子图案修饰的纸(图7B)。分析所述小分子扩散对阵列内细胞的作用。
如图7A所示，多孔亲水基质710包括基质710内的区域或“孔”720。通过在基质710上接触特定试剂的水溶液725来形成所述孔720。如图7B所示，包括包含细胞的三维水凝胶760的多孔亲水基质750被叠加至基质710的顶部，其允许所述试剂扩散进基质750。可确定所述试剂对细胞活性的作用。
在其他实施方式中，高通量筛选包括基于多层纸的阵列。例如用小分子图案修饰的纸板可被叠加至大量纸板上，其中一个为三维细胞阵列。可测定所述小分子对细胞特性(例如细胞迁移)的作用。例示方法如图7C所示。
图7C描绘了多层细胞阵列700。阵列700包括亲水基质750。基质750包括三维水凝胶760内细胞的“孔”。阵列700也包括亲水基质710，其包括所述基质710内的“孔”720。所述孔720包括基质710内的特定试剂。阵列700也包括多孔、亲水的插入板730。亲水基质710包括所述基质710内的“孔”720。所述孔720包括在基质710内的特定试剂。阵列700也包括多孔、亲水的插入板730。叠加、培养、去叠加基质710、插入板730和基质760，并确定基质710、插入板730和基质760中细胞的数量。在特定的实施方式中，使用基质710、插入板730和基质760上特定位置处的细胞数量来从影响细胞行为(例如迁移、增殖或死亡)的基质710鉴定试剂720。
在一些实施方式中，可通过将包含细胞的三维纸阵列放置进微孔板内进行高通量筛选。所述微孔板的各孔包括要待筛选的试剂，且可测定阵列内细胞的应答。
一例示方法如图8所示。在所述方法中，将相同大小的纸阵列分布至微孔板的各孔以确保每个孔中几乎相等的细胞数量的递送(图8A)。为说明所述策略，用3T3成纤维细胞在基质胶中的悬浮液渗透2mm×4mm的滤纸，然后将其分布进96孔板的所述孔中。使用Alamar Blue来评估细胞的数量。对于来自8个独立孔的测量结果，可观察到少于10％的偏差，其证明嵌入三维阵列的相似细胞数量被递送给所述孔。3T3细胞在基质胶浸没的纸内而不在无基质胶的纸内增殖(图8B)，且当将秋水仙素添加至所述孔时，所述增殖被停止。因此可使用所述系统来筛选影响三维阵列中细胞增殖的试剂。
另一例示方法如图18所示。在所述方法中，用水凝胶1830中细胞嵌入被图案修饰为疏水区1810和亲水区1820的纸阵列1800。然后使经图案修饰的纸1800与不透水材料的两板1840和1850接触。具有透洞的一张纸板1850(命名为“wH”)形成了包含所述液体的孔1851，没有洞的另一张纸板1840(命名为“woH”)形成了所述孔的底部。经图案修饰的纸1800的疏水界面1820产生了不透水密封装置1860，其防止分开的孔1851间流体的毛细管作用。然后可将所述孔1851暴露于不同溶液或试剂1852且可分析对细胞的作用。
可使用上文命名为“wH”和“woH”的纸板1840和1850来创建不限制平板的大小、形状或特征、洞(孔)的大小、形状或数量或用于制备所述平板的材料和方法的筛选阵列。可通过喷射塑形法、铸造、机械加工、激光切割、或真空板形成一个或多个树脂制造所述板。可由透明或不透明材料制备所述板。材料可为金属、塑料、玻璃、陶瓷和优选对细胞无毒性的不透水材料。在特定的实施方式中，命名为“wH”的板1850可包含定制的阵列或洞以创建孔的定制阵列，其可由为与标准微孔板一起工作而设计的仪器识别(例如可使用“wH”中洞的12×8阵列来创建与96孔板具有相同布局的阵列)。在特定的实施方式中，可以商业可得的无底96、384、1536和3456孔板(例如，来自Greiner Labortechnik of Frickenhausen，Germany；and Corning Life Sciences of Acton，Massachusetts)获得命名为“wH”的具有特异图案的洞的板1850。
可调整本文所述的任何多层测定以使其与无底微孔板一起使用。例如，可叠加多层的经图案修饰的纸并使其与“wH”和“woH”板接触(如图18D所示)，且各层可包含各种试剂或可被用在例如迁移测定分析中。
在特定的实施方式中，在使用正常或恶性细胞和调节剂的高通量筛选中使用三维细胞阵列以鉴定促进(或抑制)细胞死亡、增殖、迁移或分化的那些。如果如本文所述使用多层纸，可评估应答调节剂的各层中的细胞死亡、增殖、迁移或分化。
在其他的实施方式中，可将三维细胞阵列用于使用祖细胞和干细胞的高通量筛选。迄今为止，在二维基质上已进行了干细胞和祖细胞的高通量筛选，而使用本文所述的细胞阵列可扩展所述方法。所述纸阵列内细胞的三维分层模拟常用于祖细胞和干细胞生长或分化的细胞的三维聚集物。例如，称为“胚体”的胚胎干细胞(ESC)的三维聚集物被用于ES细胞的分化，称为“神经球”的神经干细胞(NSC)的三维聚集物被用于神经干细胞的增殖和分化。在特定的实施方式中，可将ESC或NSC平铺于细胞阵列，且可使用一层或多层的所述阵列来创建类似于“胚体”或“神经球”的三维结构的阵列。当所述阵列的各层被分离时，可研究所述结构内的分化。使用本文所述的任何方法进行调控所述分化的“调节剂”的筛选。
不同几何形状的3D培养物的高通量筛选
可在涉及不同几何形状的3D培养物的快速产生和3D几何形状如何影响细胞特性(例如代谢活性、生长、迁移、分化)的研究的筛选方案中使用纸支持的阵列。可由(但不限于)以下所述例示不同几何形状：(1)不同物理尺寸或形状的3D培养物。通过叠加不同数量的板和在指定位置中包含指定大小的洞的板生成所述培养物。板上洞的平面排列和垂直排列确定所得培养物的3D尺寸和形状(见例如图19)；(2)在特定位置具有特定机械特性的3D培养物。可通过叠加不同机械特性的板生成所述培养物，在所述叠加物中板的顺序确定在垂直方向上机械特性的空间位置；(3)在特定位置具有特定化学组成的3D结构。可通过叠加包含在板不同区域中的不同水凝胶中包裹的细胞的板生成所述培养物，在所述叠加物中板的顺序确定在垂直方向上化学特性的空间位置。横向图案修饰和叠加的组合允许控制X、Y和Z中的化学组成。
上述的三个例子是独立的，且可被组合使用。例如，穿孔纸的叠加物可提供具有不同机械特性的一些区域，且也可包括具有在不同组成的水凝胶中包裹的细胞的一些区域。
细胞测定类型
可使用本文所述的三维阵列来表征在阵列内生长的细胞的各种特性。例如，在基于纸的阵列中细胞的定性和定量检测是可能的，例如使用本领域已知的荧光显微镜或比色测定。
某些实施方式可使用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，其为本领域普通技术人员已知。所述技术如例如″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，third edition(Sambrook et al.，2001)；″Oligonucleotide Synthesis″(M.J.Gait，ed.，1984)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1987)；″Methods in Enzymology″(Academic Press，Inc.)；″Current Protocols in Molecular Biology″(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，and periodic updates)；″PCR：The Polymerase Chain Reaction″，(Mullis et al.，eds.，1994)所述。
凋亡测定
可使用本领域已知的用于测量凋亡的任何标准测定来确定本文所述三维细胞阵列中细胞的凋亡。所述测定包括但不限于：末端脱氧核苷酸转移酶介导的地高辛-11-dUTP缺口和标记(TUNEL)测定(Lazebnik et al.1994，Nature 371，346)；荧光素-dUTP的掺入(Yonehara et al.，1989，J.Exp.Med.169，1747)；吖啶橙染色(Lucas，R.，et al.，1998，Blood 15：4730-41)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7测定(从Promega，cat#67790可得的Apo-ONETM同源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3/7测定)；及细胞死亡核小体ELISA测定(从Roche，Cat# 1774425可得)。
在一些情况下，可将测试试剂添加至本文所述的三维细胞阵列，且可使用相对于对照(未加入测试试剂)的凋亡诱导中的变化来鉴定调节凋亡的候选试剂。
细胞增殖和细胞周期测定
可使用本领域已知的任何方法测定本文所述的三维细胞阵列内的细胞增殖。已知的方法包括但不限于：溴脱氧尿苷(BRDU)或5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)(图15)掺入测定(Hoshino et al.1986，Int.J.Cancer 38，369；Campana et al.，1988，J.Immunol.Meth.107，79；EdU，Invitrogen)；磷酸化组蛋白H3染色(Chadlee，D.N.1995，J.Biol.Chem 270：20098-105)；3[H]-胸苷掺入(Chen，J.，1996，Oncogene 13：1395-403；Jeoung，J.，1995，J.Biol.Chem.270：18367-73)；使用Alamar Blue测定进行代谢活性测量(图15)(从Biosource International可得)(Voytik-Harbin S L et al.，1998，In Vitro Cell Dev Biol Anim 34：239-46)，钙黄绿素测定(图15)(从Invitrogen可得)或CellTitelGlo测定(从Promega可得)。从包含细胞的区域发出由特异测定产生的信号(荧光、化学发光、放射性)，且可使用常规方法(荧光显微镜、荧光或发光扫描仪、磷光成像仪、凝胶成像仪等)对其进行测量。
生物化学测定
可使用本文所述的三维细胞阵列分析基因表达水平。例如，可在细胞阵列内直接裂解细胞，且可在本领域已知的标准测定(RNA印迹分析、核糖核酸酶保护测定或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR))中使用所述裂解物(见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.2001))。
可使用已知的全基因组分析技术测定三维阵列中生长的细胞在基因表达上的变化。例如，可使用Affymetrix基因芯片
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来进行转录组分析；可使用Illumina深度测序来进行编码RNA和调节RNA(例如小RNA或miRNA)的分析。可将基因表达谱和调控RNA谱与离体和体内生长的细胞的已知谱进行比较。
也可通过蛋白印迹分析或免疫测定之类的方法使用从三维细胞阵列中培养的细胞获得的细胞材料来分析蛋白水平。可通过已知的整体谱方法(global profiling methods)(例如基于质谱(例如鸟枪蛋白组学、代谢组学)或NMR谱(代谢组学)的方法)分析来自细胞材料的蛋白、碳水化合物和代谢物。
分离的细胞分析
可从本文所述的三维细胞阵列分离所述细胞且在随后的测定中使用。例如，可在流式细胞仪分析中使用分离的细胞。可使用已知的任何方法(例如酶解地)从所述阵列中分离细胞。一例示酶对纤维素基质是反应性的，如来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。
外部刺激应答
评估三维细胞阵列中生长的细胞对已知效应器(例如增殖和形态发生的效应器)的应答。在一例示测定中，可评估内皮细胞的应答(例如管和腔的形成)。已知通过整合素-ECM互作和下游ρGTP酶介导的通路调控所述应答，且可轻易获得和测试已知抑制所述进程的一组小分子和siRNA(Koh，et al.，J.Cell Sci.121：989-1001(2008)；Ghosh，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.in press，doi：10.1073/pnas.0800835105(2008))。
测试制剂
可使用本文所述的三维细胞阵列来测定任何测试试剂。“测试试剂”可为任何试剂，例如有机或无机小分子、氨基酸、多肽、核酸、碳水化合物或多糖。所述测试试剂可为合成、天然产生的或者合成成分和天然成分的组合。在一些实施方式中，所述测试试剂可为测试试剂库(例如组合化学品库)的成员或细胞提取物或体液(例如尿液、血液、眼泪、汗水或唾液)的成分。
通过下列实施例进一步说明本发明。仅以说明的目的提供所述实施例。其不被解释为以任何方式限制本发明的范围和内容。
实施例
实施例1：基质胶渗透的纸内细胞的形态和生长速度
测试了在用基质胶渗透的纸的三维基质内生长的许多细胞的长期生长速度。所述细胞包括原代细胞(人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人皮肤成纤维细胞(HDF)、IMR-90人肺成纤维细胞)、永生化细胞(转染了端粒酶的GFP-HUVEC、HS-5人骨髓基质细胞、S16大鼠雪旺氏细胞)和癌细胞(MDA-MB-231人乳腺癌和PC-12大鼠嗜铬细胞瘤)(图9A～G)。
在纸支持的基质胶基质中大多数细胞的数量倍增时间显著低于其在2D培养物中的倍增时间。对于S16细胞(～36小时)和PC12细胞(～48小时)，所述倍增时间是最长的，而原代HUVEC和永生化的GFP-HUVEC细胞系都显示出很少的或没有增殖。所述结果与观察一致，即在三维水凝胶中悬浮的许多细胞类型比在培养皿的二维表面上平铺的相同细胞增殖更慢。
使用共聚焦显微镜来检查在纸支持的基质胶基质中的细胞形态。使用人脐带血管内皮细胞(HUVEC)作为模型系统。HUVEC在三维中显示出独特的形态变化即细胞形成与体内毛细管相像的空心结构。相反地，当在二维培养皿上培养HUVEC时其形成平板状的单层细胞。当所述细胞被包裹在所述三维基质内时，已知它们的生长速度降低。
将HUVEC在基质胶中的悬浮液点斑至纸上。在7～12天所述细胞形成空心血管样结构。所述观察证明在基质胶渗透的纸中培养的细胞显示出在三维基质中生长的细胞的行为特征。成纤维细胞、基质细胞和雪旺氏细胞经纤维素纤维延伸，长期增殖后形成多层结构。MDA-MB-231细胞显示出很少的延伸并形成细胞的无组织聚集物。诱导在用基质胶渗透的纸中培养的PC-12细胞以分化成形成三维互连神经突网络的神经元样细胞。
总的来说，纸对检查的原代和永生化细胞的形态和生理机能不具有不利作用。
实施例2：在基质胶渗透的纸内和在二维基质上细胞基因表达的 比较
在纸中生长的细胞不同于在二维中生长的细胞。使用全基因表达谱来研究在纸上三维生长的细胞与三维生长的细胞有多相似。
对在化学上相同的二维和三维系统上增殖的HUVEC的基因表达水平进行比较。将在二维基质胶单层中培养的细胞与在基质胶渗透的纸内培养的细胞进行比较。裂解细胞，并处理以分离总RNA。分析七个候选基因在二维和三维系统中生长的细胞中的不同表达。
实时定量PCR证明7个选定基因中的4个具有不同的表达水平(见图10)。每个基因在二维基质上细胞中的表达水平被设定为1，所述图表显示在基质胶渗透的纸中细胞基因表达的相对上调和下调。使用微球蛋白作为所有样品的参照基因。可将线性区域用于每组引物中。
实施例3：纸为研究细胞三维迁移的便利平台
纸可被用来三维生长细胞和随后被用来筛选在三维中发生而在二维中不发生的应答(或所述应答在二维中是不同的)。为证明这一点，使用纸作为平台以研究内皮细胞(HUVEC)的三维迁移和管形成。
将细胞在基质胶中的悬浮液(1μL，107细胞/mL)点斑至纸上且所述纸被浸入基质胶中。这产生了2～3mm的圆形图案，其包含由无细胞的三维基质围绕的三维基质中的细胞(见图11A)。使用荧光凝胶扫描仪监测细胞随着时间进入周围基质胶的迁移。当在细胞培养基中培养的时候，细胞侵入周围的区域(图11B)。包含细胞的斑的半径可作为所述迁移的量度。
在用100ng/mL VEGF(“VEGF”)或10μM小分子抑制剂ρ激酶Y27632(“Y27632”)补充的内皮培养基中悬浮包含细胞的纸板。固定所述样品并于图11B指定的天用SYTOX进行染色。通过Y27632、小分子抑制剂ρ激酶(ROCK)促进细胞的向外生长。在完全内皮生长培养基(EGM)或具有额外的100ng/mL VEGF的EGM中所述侵入的半径显著低于在EGM+10μM Y27632中的半径(图11B)。可在所述“侵入区域”中观察腔和管样结构。
在另一实施方式中，将内皮细胞点斑在中间，而乳腺癌细胞在外面，并三维共培养。差异性标记所述细胞类型，并观察所述两种细胞类型的横向交叉侵入(代表“转移”和“血管发生”的组合)。
实施例4：在基于细胞的高通量筛选中纸的应用
可与现有的高通量筛选基础设施一起轻易使用纸支持的三维基质。用细胞水凝胶悬浮液渗透的纸被分布至96孔板的孔中。使用相同大小纸片的分布来控制每个孔相同数量细胞的递送。使用发光进行三维中细胞应答的高通量研究。
具体而言，使用基于细胞的简单模型系统来产生发光的读取。用携带荧光素酶报告质粒的水泡性口炎病毒(lux-VSV)感染幼仓鼠肾(BHK)细胞。用所述病毒感染的细胞产生荧光素酶。
将BHK细胞在基质胶中的悬浮液渗透进2×4mm的纸片内。所述纸片被分布至96孔板的所述孔中，且用生长培养基培养所述细胞24小时。将渐增滴度的lux-VSV添加至所述孔。6小时后，移去所述培养基，添加细胞裂解缓冲液中的荧光素溶液至所述孔，且使用发光酶标仪读取所述信号。
观察到对应于lux-VSV滴度线性提高的发光线性提高(图12B)。各数据点对应于从特定孔的读取；来自在相似条件下进行的测定的读取的散布低。所述结果证明可将使用发光报告系统的细胞应答定量和筛选扩展至高通量筛选。
实施例5：在基质胶渗透的纸上生长的PC-12细胞的分析
我们分析在基质胶渗透的纸上PC-12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系的生长。已知PC-12细胞在用神经生长因子(NGF)处理后经历神经元分化。
首先，我们评估在纸中生长的PC-12细胞应答NGF的增殖。将PC12细胞在基质胶中的悬浮液(1uL，5×106细胞/mL)点斑至滤纸上。将所述纸放置在包含血清的培养基(在F12K基础培养基中的2.5％胎牛血清、15％马血清)或用100ng/mL神经生长因子(NGF)补充的包含血清的培养基中。培养在纸-基质胶基质内的细胞指定时间，用甲醛固定，并用缀合Alexa Fluor 488的鬼笔环肽进行染色。使用Typhoon荧光凝胶扫描仪扫描所述纸(见图13A)。使用ImageJ软件定量所述图像，且在图13B中存在4个测量结果的平均值。误差棒是一个标准差。
细胞在纸支持的基质中以36小时的种群倍增时间增殖。此外，在包含血清的培养基中，NGF对细胞的生长速度具有很少的影响。
下一步，我们评估使用NGF-处理在纸支持的三维基质中维持的PC-12细胞是否分化成神经元。我们将PC12细胞在基质胶中的悬浮液点斑至纸上，并在用NGF或者用NGF和ROCK抑制剂Y27632的组合补充的培养基中悬浮所述纸。共聚焦显微镜检查发现了有长神经突的神经元样细胞。当使用不同的培养基/添加剂时，细胞的形态和神经突的长度发生变化。例如，在100ng/mL NGF存在情况下的6天培养后，由包含血清的培养基中的细胞发生短神经突，在无血清的培养基中发生更长的神经突，在5μM Y27632ROCK抑制剂存在下在无血清的培养基中观察到大量互连神经突的3D网络。
为确定观察到的神经元表型，通过定量PCR分析所述细胞，且显示其上调神经元特异性神经丝L(NF-L)和神经肽Y(NPY)的转录本(图14)。最后，我们将在纸支持的基质胶(“纸”)中维持的PC-12细胞的分化与在无纸基质胶中(“3D”)或在基质胶包被的表面上(“2D”)的细胞分化进行比较。
在包含血清的培养基或在用100ng/mL NFG补充的培养基中使在所述基质中的细胞增殖。在第3天或第4天时，处理所述样品以分离mRNA，且通过定量PCR评估NF-L或NPY的表达水平。使用GAPDH和肌动蛋白作为持家对照。使用GAPDH作为参照在对于每个引物的线性范围中进行ΔΔCT分析。在图14中，各数据点为3个独立样品的测量结果的平均值。误差棒是一个标准差。
在通过NFG处理诱导的NF-L和NPY表达水平中我们没有观察到不同(图14)。所述观察提示纸不干扰所述细胞的分化，且可将基于纸的平台用于筛选调节三维环境中细胞分化的试剂。
实施例6：研究在限制营养物质和氧的三维培养物中细胞增殖的 多层基于纸的水凝胶
使用多个纸板的分层来图案修饰三维中的细胞及来创建细胞的复合三维装配。重要的是，所述叠加层被拆开且在各层中的细胞能被单独检查(图15A)。在多层培养物内，处于不同深度的层中的细胞被暴露于不同浓度的氧和营养物质。因此，可使用多层培养来研究在营养物质和氧浓度梯度中不同细胞类型的增殖。
为比较在多层培养物中许多细胞类型的行为，将4μL基质胶中的原代细胞(HUVEC、HDF、IMR-90)或永生化细胞(HS-5)点斑至200μm厚的层析纸上。在适合的培养基中培养所述细胞24小时(允许细胞进行扩散)并将其叠加至6～8层的纸上。为创建在叠加层中氧和营养物质的单向梯度，将不透层放置在所述叠加物的底部(图15A)。叠加的细胞培养7天(HUVEC)或9天(HDF、IMR90、HS-5)。所述细胞被固定且被再叠加。用缀合Alexa Fluor633的鬼笔环肽对细胞进行染色，使用凝胶扫描仪成像，并使用ImageJ进行分析。对应于第1天的细胞密度的灰度强度被设定为1.0；在所有层中的灰度强度以在第1天的强度进行标准化。在所述分析中包括在非叠加层中增殖9天的细胞的密度(黑线，图15B、15E、15F、15G)。
在HDF和HS-5叠加的培养物中，在顶层中的细胞密度类似于在非叠加纸中增殖11天的细胞的密度(图15B)。因此，即使在单向梯度中，在200μm内的细胞被暴露于足够量的营养物质和氧以支持其增殖。
IMR90和HUVEC细胞甚至在顶层中也显示降低的增殖。我们推测所述降低是由于从纸的一侧获取营养物质的阻断。在自由浮动层中，其中可从纸的任何一侧发生营养物质的获取且所述细胞离所述主体溶液平均为100μm或更近。随着纸的一侧被阻断，至主体溶液的平均距离有效倍增且变成～200μm。所述厚度的所述倍增对于对氧缺乏更敏感的所述细胞系是有害的。在一对照实验中，在包含基质胶(没有细胞)和在下面的不透层的7层的顶部放置一层HUVEC细胞。所述构造有效阻断从纸的一侧获取营养物质和氧。在顶(包含细胞)层中的细胞数量少于在自由浮动层中的数量且其类似于在8层HUVEC的顶层叠加物中细胞的数量(未显示)。
在所有情况下，在第一层下的细胞密度(＞200μm深度)显著低于在非叠加层对照中的细胞密度(黑线，图15B、15E、15F、15G)。与起始细胞密度的比较(1.0网格线，图15B、15E、15F、15G)显示在不同细胞类型的不同层中发生增殖的损失。所述测试细胞系的“不增殖深度”为：HUVEC-200μm、HS-5～400μm、IMR-90～600μm、HDF-800μm。可使用进一步的实验来说明细胞死亡、对低氧的抗性和其他因素。细胞增殖(EdU)或代谢活性(钙黄绿素、Alamar Blue、图15I)标记物的染色显示代谢活跃细胞或活跃合成DNA的细胞(S期细胞)的数量除了在顶部叠加物之外，在任何叠加物中低许多。观察到的“S期细胞的梯度”和“代谢活跃细胞的梯度”比总DNA或总肌动蛋白染色的梯度陡许多，其表明在底层中的大多数细胞是代谢不活跃的和非增殖的。如VEGF和IGFBP3的定量PCR所示，在底部叠加物中的细胞也表达高许多的水平的低氧反应性基因(图15I)。
共聚焦图像显示在叠加层中细胞的独特形态变化。空腔网络的大量形成在顶部的5～6层中发生(图15C)。在底层中观察到更小许多的腔(图15D)和在非叠加的对照中仅可观察到单独的短腔(未显示)。每个腔细胞核平均数量的定量显示在层1的腔中观察到平均12.6细胞/腔，在层8中为5.5细胞/腔及在非叠加对照中为8.0细胞/腔。我们推测相比于“非叠加对照”中的腔，在顶部叠加层中更长腔的形成是由于多层培养物中HUVEC的营养物质和氧缺乏，其刺激刺激腔生长的因子(VEGF等)的自分泌产生。
实施例7：研究在三维培养物中细胞迁移的多层纸支持的水凝胶
使用多层纸支持的水凝胶的叠加来研究细胞的三维迁移。另外，可使用细胞层间三维迁移的观察来确定在叠加后形成了连续的三维水凝胶。使细胞迁移可见的简单方法是交替叠加包含纸支持的基质胶中的细胞的层和只包含基质胶的层。为创建所述叠加物，将4μL基质胶和细胞在基质胶中的悬浮液点斑至滤纸片上。折叠后产生由包含基质胶的区域围绕的含细胞区域的“4-螺旋物”，选择点斑的图案(图16A)。为了增强细胞的迁移，通过在各折叠的叠加物的底部上放置不透层(醋酸纤维素薄板)来创建营养物质和氧的单向梯度(图16B)。
9天培养后，用4％甲醛溶液处理折叠的纸且用鬼笔环肽进行染色。不折叠所述叠加物，并使用凝胶扫描仪使所述细胞可见(图16C)。细胞在包含基质胶的板间迁移。我们推断各层与邻近的层是物理接触的。迁移至较高层与较低层的定量显示，当与逆着梯度迁移的细胞相比，使更多的细胞迁移至氧和营养物质浓度更高的更高层(即沿着所述梯度)(图16D和图16E)。为评估在迁移中共形接触的作用，我们比较层中的细胞行为，所述层被折叠并被压至刚折叠但未被压在一起的层上。我们观察到仅当所述层被压在一起时迁移发生(未显示)。因此在不是共形接触的层中细胞不能迁移至邻近的层。
实施例8：在不同几何形状的3D培养物中细胞生长和代谢活性的 仿形
我们使用包含洞图案的纸来创建不同几何形状的3D培养物(图18A)。将细胞在基质胶中的悬浮液渗透进纸内，且所述纸被叠加，并用不锈钢容器吸住(图18C)。培养所述细胞9天，在第9天，用钙黄绿素温育所述叠加物30分钟，然后用甲醛固定。然后分离所述层并使用荧光凝胶扫描仪使钙黄绿素强度成像。用缀合Texas Red的鬼笔环肽对所述层进行染色，并使用凝胶扫描仪使其显现。在图19D和19E中显示来自一些3D几何形状的结果。
我们比较具有2、4、6或8层的叠加物(即400、800、1200和1600微米厚的培养物，图19D)和具有由2、4或6层“纸中的洞”(其在3D培养物的中间有效创建了400、800或1200微米的缺口(“腔”))分离的6、4或2层的3D培养物(图19E)。对于在不透界面上具有8、6、4和2层的叠加物，代谢活性的梯度急剧下降至低于层1(图19D)。
在3D培养物中腔的引入提高了在所述叠加物中细胞的总体代谢活性，且使在所述3D培养物中间的细胞更加代谢活跃(例如，将在18D中的4层叠加物和在18E中以800微米分离的2+2层构成的相同叠加物进行比较)。因为在所述叠加物的底部和侧面没有营养物质的入口且营养物质和氧的大量涌入仅经所述叠加物的顶部发生，在3D培养物内腔的引入不改变所述叠加物的有效灌注表面区域(其在顶部)。最后，对于“分离的叠加物”，细胞的数量是相同的或甚至更高。不管正常的叠加物和“具有腔的叠加物”间的所述相似性，所述组合的代谢活性在具有腔的叠加物中显著更高。
实施例9：研究细菌细胞的生存能力的多层纸支持的水凝胶
研究在200微米层析纸的叠加物中生长的铜绿假单胞菌株PA14细胞的生存能力。用细菌的悬浮液浸没所述纸，且允许细菌附着至所述纸几小时。然后叠加八张纸(形成8层的叠加物)并在培养基中温育4小时、24小时或48小时。所述纸被去叠加，且使用商用的活/死细菌生存能力试剂盒(Invitrogen)确定各层中死细菌和活细菌的数量。
在8层的叠加物的中间观察到活细菌和死细菌的数量的稳步下降。所述下降可归因于细菌的氧扩散和氧消耗的竞争率。尽管所述叠加物的顶部(层1)和底部(层8)都暴露于培养基，所述培养基不被搅拌，且层8离空气/液体界面最远。在不搅拌的培养基中，在层8中有更少的存活细菌，推测因为相比于层1，较少的氧可进入层8。
实施例10：甜水图案修饰方法的研制
A.筛选能保护用于甜水图案修饰方法的纤维素的碳水化合物和 多元醇
研制筛选以鉴定保护纤维素免受疏水溶液影响的化合物。起初测试了蔗糖，因为蔗糖是便宜和丰富的碳水化合物。将各种浓度的蔗糖溶液点斑至滤纸上，然后将水凝胶溶剂中的聚合体和聚合体前体溶液浸入所述纸(见图2A)。聚合所述前体及干燥所述溶剂后，用水洗涤所述纸。然后将苋菜红的水溶液点斑至图案修饰区上，且串珠状的染料液滴提供了所述保护的定性测量。如果保护是成功的，点斑区域将保持亲水，且随后用苋菜红水溶液将其润湿。相反地，在保护不成功的区域中，聚合物修饰的纸将被给予疏水性，且随后不用苋菜红水溶液将其润湿。
为制备PDMS修饰的纸(图2B)，将蔗糖水溶液的斑沉积至所述纸上，然后将所述纸浸入在辛烷中的PDMS溶液(1∶1wt，混合物)中。如图2B所证明，蔗糖保护的斑保持亲水性，允许苋菜红溶液润湿在所述蔗糖处理的斑中的纸。如图2B所示，低浓度的蔗糖不保护所述纸(PDMS处理后所述纸变成疏水的，产生了串珠状的苋菜红溶液)。使用在甲苯中的聚苯乙烯溶液可观察到相似的结果(图2C)。
PDMS和聚苯乙烯在蔗糖溶液周围形成互补的图案。可使用有潜力的许多其他类型的热固性和热塑性高分子材料。所述结果提示，由纸上的蔗糖溶液形成的任何图案可模板在纸内的互补疏水图案的形成。
使用图2A所概括的筛选，发现纤维素由其他的碳水化合物衍生物保护(见图3)。在图3A中，化合物在水中溶解(60％重量分数)且被点斑至滤纸上(1μL滴)。将在正辛烷中的PDMS溶液浸入纸内。在70℃温育纸2小时以固化所述PDMS，然后用水将其洗涤。使用染料溶液(2μL滴)来评估点斑区的润湿特性。在图3B中，使用作为疏水材料的PDMS测试各种浓度的不同化合物。在图3C中，用列出的溶液点斑所述纸并将其短暂浸入10wt％甲苯中的聚苯乙烯溶液。过多的溶液被彻底去除，且允许所述纸在室温干燥。
相关化合物的保护性能力是相当不同的，且通过碳水化合物和它们的衍生物的保护是浓度依赖性的(图3)。纯甘油或甘油水溶液不保护纤维素免受PDMS影响。因为相比于PDMS的固化率，甘油的蒸发是慢的，所述结果表明甘油和PDMS-辛烷溶液在纸内是易混合的。
免受PDMS-辛烷和聚苯乙烯-甲苯影响的保护分布变化显著(见图3B和3C)。保护所需的化合物的浓度，对于聚苯乙烯比对于PDMS更低。甘油水溶液(高于60％)保护纸免受甲苯-聚苯乙烯影响。
在纸不存在下不能从所述液体的相行为预测纸内液体的可混合性。一些不能混合的液体在纸内变成可混合的(例如甘油和辛烷-PDMS溶液)。所有化合物浓度的微小变化后，有保护效率的急剧下降。在图2A中所述的筛选提供了鉴定保护性化合物和确定用于保护的浓度的方法。
B.使用亲水溶剂图案修饰，随后用亲水溶液点斑
如果相分离是平衡构形(equilibrium configuration)，溶液添加的顺序不应该影响最后的状态。
纸首先被浸入正辛烷中的PDMS前体的1∶1溶液中。蔗糖的溶液被点斑至PDMS浸入的纸上，并在70℃温育所述纸2小时，以固化所述PDMS。在几秒内，蔗糖液滴渗透进纸块内并代替所述疏水溶液(图4A)。固化和洗涤产生了具有与由试剂的反向添加形成的润湿特性相同的阵列(见图4B和2B)。因此，试剂的添加顺序是不重要的。
C.用疏水材料图案修饰纸
使用许多现有的用墨水溶液图案修饰纸的技术用蔗糖溶液图案修饰。在第一种方法中，使用具有填充糖浆的墨盒的喷墨打印来形成所述图案(见图5A)。使用具有填充糖浆的墨盒(60wt％蔗糖、1wt％甘油、0.1％surfanol)的Epson Stylus喷墨打印机打印所述图案。使用连续10轮的打印来沉积高量的蔗糖，且未观察到分辨率上的损失；本文所述的打印的图案的照片如图5A所示。打印的纸被浸入1∶1的PDMS-辛烷溶液中并在70℃过夜固化。
打印的图案保持亲水性且能被用于液体引导(微流体)(见图5B)。通道间1mm的分界线防止液体渗透入平行的通道。
在另一个方法中，是使用填充糖浆(63wt％蔗糖溶液)的自来水笔形成微流体通道。使用常规的激光打印机打印两个通道的虚线轮廓。使用填充糖浆的自来水笔“填充”所述轮廓。纸被浸入聚苯乙烯溶液(在甲苯中为10wt％)，并用干净的滤纸吸干过多的溶液。在室温干燥所述纸5分钟并用水洗涤。点斑墨水溶液(苋菜红和考马斯亮蓝)，且允许其吸进所述通道。在所述通道中观察到层流(图5C)。
在另一方法中，通过盖印蔗糖溶液至纸上制造图案修饰的纸。使用SU8图案修饰的纸作为盖印的基础(用蓝色染料标记亲水的纸区域)。如图5D所示组合所述“印”。在两个平坦的表面间手工压制糖浆浸泡的纸、SU8图案修饰的纸和KimwipeTM。重复盖印16次。盖印16个相同图案所需的总时间是30秒左右。可使用所述方法快速产生大量的相同图案。
等同发明
应了解虽然已与本发明的详述相结合描述了本发明，希望前面的描述说明但不限制本发明的范围，其由附加的权利要求的范围所界定。其他方面、优势和修饰在下列权利要求的范围内。

Claims (43)

1.三维细胞阵列，其含：
●多孔亲水基质，其中所述基质含多个多孔区，各多孔区至少部分被不透液界面束缚；及
●含细胞的水凝胶，
其中所述水凝胶被嵌入所述多孔区内。
2.权利要求1的细胞阵列，其中所述基质是纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
3.权利要求1的细胞阵列，其中所述细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
4.权利要求1的细胞阵列，其中所述水凝胶是温度敏感性水凝胶。
5.权利要求1的细胞阵列，其中所述水凝胶是离子型水凝胶。
6.权利要求1的细胞阵列，其中所述不透液界面含PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
7.制备三维细胞阵列的方法，包括：
●提供多孔亲水基质，其中所述基质含多个多孔区，各多孔区至少部分被不透液界面束缚；及
●使所述多孔亲水基质与细胞和温度敏感性水凝胶或离子型水凝胶前体的悬浮液接触，其中所述悬浮液浸透所述基质的一个或多个多孔区。
8.权利要求7的方法，还包括在使所述细胞的悬浮液与所述基质接触前，用胶凝剂润湿所述基质。
9.权利要求8的方法，其中所述胶凝剂诱导被嵌入所述基质的一个或多个多孔区的水凝胶的形成，所述水凝胶含细胞。
10.权利要求7的方法，其中所述基质是纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
11.权利要求7的方法，其中所述细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
12.权利要求7的方法，其中所述不透液界面含PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂、聚苯乙烯、聚醚、聚酰胺、PMMA、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、光刻胶前体、蜡或脂肪。
13.制备三维细胞阵列的方法，包括：
●提供多孔亲水基质；
●使所述基质的多个指定区与含细胞和温度敏感性水凝胶或离子型水凝胶前体的悬浮液接触，其中所述悬浮液浸透所述基质的多个指定区；及
●使所述温度敏感性水凝胶或所述离子型水凝胶前体与胶凝剂接触，其中所述胶凝剂诱导被嵌入所述基质的多个指定区的水凝胶的形成。
14.权利要求13的方法，其中所述基质是纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
15.权利要求13的方法，其中所述细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
16.权利要求13的方法，还包括使所述阵列与培养基接触。
17.鉴定修饰细胞功能的制剂的方法，所述方法包括：
●提供权利要求1的阵列；
●使所述阵列与一种或多种测试制剂接触；及
●检测在所述一种或多种测试制剂存在下的一种或多种细胞功能；
其中在所述一种或多种测试制剂存在下细胞功能的变化指示所述一种或多种测试制剂修饰细胞功能。
18.权利要求17的方法，其中所述阵列于多个多孔区与所述一种或多种测试制剂接触。
19.权利要求17的方法，其中各多孔区与不同测试制剂接触。
20.权利要求17的方法，其中所述细胞功能是增殖、迁移、活力或基因转录。
21.三维细胞阵列，其含：
●含水凝胶的第一多孔亲水基质，所述水凝胶含细胞且于指定区配置在所述第一基质内；
●含水凝胶的第二多孔亲水基质；及
●第三多孔亲水基质，所述第一基质叠在所述第二基质上，且所述第二基质叠在所述第三基质上。
22.权利要求21的阵列，其中所述第三基质含测试制剂。
23.权利要求22的阵列，其中所述测试制剂是小分子、氨基酸、多肽、核酸、碳水化合物或多糖。
24.权利要求21的方法，其中所述基质是纸、硝酸纤维素、醋酸纤维素、布或多孔聚合物膜。
25.权利要求21的方法，其中所述细胞是细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。
26.鉴定修饰细胞功能的制剂的方法，所述方法包括：
●提供权利要求1的三维阵列；
●将所述基质切成多个区段，各区段具有相等尺寸；
●使各区段与测试制剂或对照接触；及
●检测在所述测试试剂存在下的一种或多种细胞功能；
其中在所述测试试剂存在下细胞功能的变化指示所述测试制剂修饰细胞功能。
27.三维微阵列，其含：
●无底微孔板，其具有多个孔；及
●多孔柔性基质，其含多个多孔区和多个不透液界面，各多孔区被不透液界面束缚；
其中所述孔和所述不透液界面以相同的图案排列，所述微孔板和所述基质附着，由此所述多个孔对齐，且密封连接至所述多个不透液界面，以形成针对各多孔区的单个室。
28.权利要求27的微阵列，其中所述基质的所述多孔区在水凝胶中含细胞。
29.鉴定修饰细胞功能的制剂的方法，所述方法包括：
●提供权利要求20的三维微阵列；
●使所述阵列与一种或多种测试制剂接触；及
●检测在所述一种或多种测试制剂存在下一种或多种细胞功能；
其中在所述一种或多种测试制剂存在下细胞功能的变化指示所述一种或多种测试制剂修饰细胞功能。
30.图案修饰多孔疏水基质的方法，所述方法包括：
●使多孔疏水基质与含水溶性化合物的水溶液接触，所述溶液浸润所述基质以形成浸透所述溶液的所述基质的第一区和不与所述溶液接触的第二区；
●使所述基质与疏水材料接触，所述疏水材料浸透所述第二区；及
●除去所述水溶性化合物，产生被所述疏水材料束缚的亲水多孔区。
31.权利要求30的方法，其中所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、苏糖醇、甘露糖或甘油。
32.权利要求30的方法，其中所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂或聚苯乙烯。
33.权利要求30的方法，其中所述水溶液被点斑、打印、画或盖印在所述多孔疏水基质上。
34.权利要求33的方法，其中所述溶液用喷墨打印机打印。
35.权利要求30的方法，其中所述基质是硝酸纤维素、醋酸纤维素、纤维素纸、滤纸、布或多孔聚合物膜。
36.权利要求30的方法，其中所述基质是纸。
37.图案修饰多孔疏水基质的方法，所述方法包括：
●使多孔疏水基质与疏水材料接触，所述疏水材料浸透所述基质；
●使所述基质区与含水溶性化合物的水溶液接触，所述溶液从所述区置换所述疏水材料；及
●除去所述水溶性化合物，产生被所述疏水材料束缚的亲水多孔区。
38.权利要求37的方法，其中所述水溶性化合物是蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、木糖醇、核糖、苏糖醇、甘露糖或甘油。
39.权利要求37的方法，其中所述疏水材料是PDMS、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、环氧树脂或聚苯乙烯。
40.权利要求37的方法，其中所述水溶液被点斑、打印、画或盖印在所述多孔疏水基质上。
41.权利要求40的方法，其中所述溶液用喷墨打印机打印。
42.权利要求37的方法，其中所述基质是硝酸纤维素、醋酸纤维素、纤维素纸、滤纸、布或多孔聚合物膜。
43.权利要求37的方法，其中所述基质是纸。
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