CN110117540B - 一种细胞培养平台及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞培养平台及其制作方法，该平台为三明治结构，由下层基底、内层垫片和上层覆盖层依次叠加组成，上层覆盖层和下层基底分别在细胞培养区域外周使用疏水材料打印疏水边界，内层垫片为独立多通道结构，并且有联通上层覆盖层和下层基底的细胞培养区域的孔洞。该平台可以依据实验要求进行定制，能够整合如微流体技术、电化学检测等多种先进技术手段，并与比色成像和荧光显微镜技术高度兼容，可以同时监测和评估多种不同细胞行为，该平台易于制造、可扩展、可定制、低成本，能够替代当前细胞培养平台。

Description

一种细胞培养平台及其制作方法
技术领域
本发明提供一种细胞培养平台及其制作方法，涉及实验工具制造工艺及细胞培养技术领域。
背景技术
在过去的一个世纪中通常选用平坦的塑料表面，例如培养皿和多孔板，作为用于细胞生长的细胞培养平台。现在的细胞研究的实验设计中(例如微流体、电化学检测、生物材料等研究领域)越来越需要定制化的细胞培养平台、需要培养平台功能化以及细胞即时监测，但上述的这些传统培养平台的灵活性非常有限，一是其无法模拟细胞体内生存环境，无法提供调节细胞生存的物理化学外环境；二是这些培养平台通常是注塑成型，这就意味着如需要非常规商品化结构，在实验前期就需要为每一个特殊结构的培养平台设计创建合适的造型模具，这极大的限制了定制化和功能化的自由度，并且增加了实验初期的生产成本。
基于定制化细胞培养，微流体技术在高通量筛选、单细胞分析、器官芯片和放射生物学等方面被普遍使用，聚二甲基硅氧烷(PDMS)目前是微流体装置的首选材料，其具有光学清晰度高，成本低，可重复利用，易于使用且快速成型等优势。但PDMS在细胞培养中存在很多缺陷，其对水蒸气和小疏水性分子的渗透性能差，材料表面不稳定以及材料中存在未交联的寡聚体，这些都不利于细胞的正常生长，不适用于长时间的细胞培养。此外，一些微流体装置与细胞研究中常用的技术不兼容且难以大规模生产。
另外，蜡印技术作为一种新型的制作细胞培养平台的技术，拥有成本低，生产工艺简单，操作方便快捷等优点。蜡印技术曾被用于纸基微流体领域，2011年Derda等人使用蜡印技术设计基于纸浆中高通量细胞筛选的纸质3D细胞培养平台，实验原理是使用疏水性蜡作为屏障，为细胞生长创造亲水区域，此后，蜡印技术被广泛应用于基于纸张的3D细胞培养的研究。但该技术仅仅应用于纸基细胞培养平台，不能与当前显微镜和荧光检测方法兼容，无法形成用于长期连续性细胞研究的培养槽，也不能整合多种先进技术从而实现同时监控、评测多种不同的细胞行为。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种细胞培养平台及其制作方法，该平台由透明柔性可印刷的基板堆叠组成，能够通过大规模制造技术(如功能性印刷和涂层)整合如生物材料、微流体技术、电化学检测等多种先进技术手段，并与比色成像和荧光显微镜技术高度兼容，可以同时监测和评估多种不同细胞行为，该平台易于制造、可扩展、可定制、低成本，能够替代当前细胞培养平台。
一种细胞培养平台包括下层基底、内层垫片和上层覆盖层，内层垫片上连上层覆盖层，下连下层基底，使用铂针对齐连接；
所述下层基底和上层覆盖层均设计细胞培养区域，细胞培养区域外周为疏水边界，所述内层垫片结构为独立多通道，通道数量为1-10条；
所述内层垫片的孔洞与下层基底分隔出的细胞培养区域、上层覆盖层分隔出的细胞培养区域叠加对齐后完全重合，形成细胞培养空间。
进一步的，上述内层垫片在其通道垂直方向上有穿透性孔洞，内层垫片孔洞侧边上下各设计一条2-3毫米宽的疏水线，疏水线与疏水边界完全闭合相连。
进一步的，上述细胞培养平台的制作方法包括如下步骤：
1)设计图层：设计上层覆盖层和下层基底的细胞培养区域，细胞培养区域外周设计疏水边界，内层垫片孔洞侧边上下各设计2-3毫米宽的疏水线，内层垫片设计1-10条独立通道；
2)选择制片材料：选用高度透明具有光学清晰度、可印刷、具有生物相容性的薄膜作为制片材料制作下层基底、内层垫片和上层覆盖层；
3)打印疏水边界：利用打印的方法将疏水材料制作成步骤1)所述的疏水边界和疏水线，获得可组合成培养平台的下层基底、内层垫片和上层覆盖层；
4)切割图层：使用切割机切割步骤3)中获得的下层基底、内层垫片和上层覆盖层；
5)灭菌：对步骤4)中获得的下层基底、内层垫片和上层覆盖层进行灭菌处理；
6)组装：使用既可以保证足够氧气流量又可以保证层与层直径密封的连接方式组装步骤5)中下层基底、内层垫片和上层覆盖层，使所有层对齐并保持在一起。
进一步的，步骤1)中所述的疏水边界厚度大于2毫米。
进一步的，步骤1)中所述的疏水材料是PDMS或蜡中的一种。
进一步的，步骤2)中可以使用电晕技术根据实验需要在上述的上层覆盖层和下层基底表面额外添加生物材料涂层。
进一步的，步骤2)中所述的薄膜是聚酯膜、柔性玻璃、纸基微流体中的一种。
进一步的，步骤3)中所述的打印的方法指喷墨印刷、彩色打印、喷涂或柔板印刷中的一种。
进一步的，步骤6)中所述的连接方式为铂针连接、纽扣连接、粘合剂连接和3D外壳组装中的一种。
有益效果：
(1)与传统的细胞培养平台和PDMS细胞培养平台相比，本申请的细胞培养平台的可塑性更强，可根据实验要求定制适应不同培养要求的的培养平台，比如模拟96孔板几何形状或者通过在制片材料上打印特殊生物材料层定制有特殊培养条件的培养平台或者模拟缺氧环境，也能够设计兼容多种检测、观察细胞生长情况的技术手段(如电化学检测、荧光显微镜检测等)同时进行操作的培养平台(每个培养区域的培养条件不同)，为实验设计提供了更开阔的设计思路。
(2)本申请的培养平台只需要较少的细胞培养基，可以为细胞提供更多的生长区域，细胞可以在覆盖面、基底和介质中生长，这对研究不同细胞系的共培养和模拟体内环境有一定的帮助。
(3)本申请的培养平台是先设计后切割，可通过打印、切割柔性材料定制合适的结构，不需要事先使用模具进行制作，成本较低，使用方便。
(4)本申请的培养平台制作方法简单，可进行规模生产，便于技术产业转化，实现项目落地。
表1本申请细胞培养平台与传统细胞培养平台、PDMS细胞培养平台的区别
Figure GDA0003691578100000031
Figure GDA0003691578100000041
附图说明
图1培养平台各层结构及其组合示意图。
图2培养平台侧视图。
图3不同培养平台材料的UV/Vis和ATR-FTIR光谱。
图4细胞培养情况图。
图5细胞培养平台中心孔和侧孔的细胞的免疫荧光染色图。
具体实施方式
实施例1细胞培养平台的制作
1)设计图层：使用任何画图软件设计上层覆盖层和下层基底的圆形的细胞培养区域，细胞培养区域外周设计疏水边界，除了圆形培养区域其余地方均需要涂满疏水材料，疏水材料厚度大于2毫米，内层垫片孔洞沿侧边周长设计两条2-3毫米宽的闭合疏水线，两条疏水线分别与覆盖面和基底的培养区域外周的疏水边界完全闭合相连，防止液体浸润内层垫片，内层垫片设计1-10条独立通道，调控液体流动和气体通透性。
2)选择制片材料：选用高度透明具有光学清晰度、可打印、具有生物相容性的薄膜，目前使用125μm厚的MelinexOD(聚酯膜)，但也可以使用柔性玻璃、纸质微流体或纸质3D培养。如有特殊的培养要求，我们可以使用电晕技术依据实验培养要求在上层覆盖层和下层基底表面额外添加需要的生物材料涂层(如促进细胞生长和分化的细胞调控因子)，定制合适的细胞培养平台。
3)打印疏水边界：使用Xerox ColorQube8580彩色打印机将蜡打印成步骤1)所述的疏水边界和疏水线，获得可组合成培养平台的下层基底、内层垫片和上层覆盖层。也可以通过如喷墨印刷、喷涂或柔性印刷的方法制作疏水边界和疏水线。
4)切割图层：使用桌面切割机切割步骤3)中获得的基底、垫片和覆盖层，如果进行大规模生产也可以选用激光切割完成切割步骤，获得如图1中所示的基底、垫片和覆盖层。
5)灭菌：使用去离子水和乙醇分别洗涤步骤4)中获得的基底、垫片和覆盖层，培养细胞时将装置放在UV下30分钟，如果使用纸质材料也可以通过高压灭菌进行灭菌，而对于尺寸更大的塑料材料也可以用伽马辐射进行灭菌。
6)组装：使用8毫米直径的铂针手动组装步骤5)中下层基底、内层垫片和上层覆盖层，使所有层对齐并保持在一起，当然也可以使用既可以保证足够氧气流量又可以保证层与层直径密封的连接方式，比如纽扣固定、合适的粘合剂图层或者适合的3D外壳支持该设备。内层垫片的孔洞与下层基底分隔出的细胞培养区域、上层覆盖层分隔出的细胞培养区域叠加对齐后完全重合，形成细胞培养空间，获得如图1中所述的组装后的培养平台，其结构的侧视图如图2所示。
实施例2细胞培养平台的制片材料的表征测定
1、材料和方法
(1)选用125μm的聚脂薄膜，用肥皂和自来水清洗聚脂薄膜，后用去离子水和70％乙醇和水冲洗后烘干，备用。
(2)选择步骤(1)获得的备用的聚脂薄膜中的一部分在其表面使用黑蜡打印覆盖，另一部分不进行黑蜡处理。
(3)使用ElmerLambda900分光光度计分别收集步骤(2)中两种不同理的聚脂薄膜、常用盖玻片、Cellstar多孔细胞培养板的UV/Vis光谱，测定四种材料的折射率。
(4)Perkin-ElmerSpectrumOneFTIR光谱仪(ATR模式)测定步骤(2)获得的印刷前、印刷黑蜡后聚酯薄膜在分别接触三种溶液(去离子水(DI)、无血清细胞培养基(SF)和完整细胞培养基(COMP))后的ATR-FTIR光谱。
(5)分别使用四种溶液(去离子水(DI)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、无血清细胞培养基(SF)和完整细胞培养基(COMP))对步骤(2)获得的印刷前、印刷黑蜡后聚酯薄膜进行液滴，使用CAM200(KSVInstrumentsLtd)测量液滴后初始的接触角和液滴后10秒的接触角，并通过杨-拉普拉斯公式确定其各自的湿润性。
2、结果
显微镜是用来监测细胞行为的主要技术之一，因此，在细胞培养平台的制造中，使用具有光学透明性的非常薄和高度透明的材料是一个优势，图3中的(a)显示了不同培养平台材料的光谱图，常见的激发荧光显微镜中的波长在400-700nm之间，在这个范围内聚脂薄膜的透射率约为88％，玻璃盖玻片约为91％，多孔细胞培养板为90％，透射率相差不大，聚酯薄膜可以作为细胞平台替换材料，添加了黑蜡的聚酯薄膜的透射率明显较低，使用黑蜡的目的是在培养区域外周产生疏水边界，防止细胞进入非培养区域，并不作为细胞生长区域，因此黑蜡区域较低透射率并不影响观察细胞。
图3中(b)显示了六种情况下的ATR-FTIR光谱，印刷前聚脂薄膜(M)和黑蜡印刷后的聚酯薄膜(W)在接触去离子水(DI)、无血清DMEM(SF)和完全DMEM(COMP)和无洗涤(NW)的ATR FTIR光谱(M-COMP-NM和W-COMP-NM的光谱几乎重合)，光谱中可以证实聚脂薄膜和黑蜡的主要成分，同时ATR FTIR光谱显示了印刷前和印刷后的聚脂薄膜在两种培养基后表面化学性质的变化，尽管聚脂薄膜和黑蜡油墨之间存在差异，但两种材料在暴露于细胞培养基后的光谱相似，并且这种变化不是永久性的，可以通过多次用去离子水冲洗来逆转它。
接触角测量有助于进一步了解细胞培养基诱导的材料表面化学变化，表2显示了两种材料在与液体接触前和接触10秒后的接触角。
表2不同材料接触不同液体的接触角
Figure GDA0003691578100000061
接触细胞培养基后，两表面接触角明显减小，这一变化证实了ATR-FTIR光谱中变化。对于聚脂薄膜而言刚接触溶液时亲水性不足，溶液不能自发湿润和扩散，但浸润一段时间后就可以解决这个问题，因此，在细胞接种前，需要使用细胞培养基直接对培养区域进行预湿润。
实施例3使用本申请培养平台培养人真皮成纤维细胞
1、材料和方法
(1)配制添加10％胎牛血清、青霉酸-链霉素(10000U/10mgmL-1)、L-谷氨酰胺(200mM)的作为补充剂的改良DMEM培养基。
(2)首先使用培养基预湿润实施例1中组装的培养平台的培养孔，培养孔每排从左往右标记为1-4，依次接种1个细胞(1号孔)、5000个细胞(2号孔)、10000个细胞(3号孔)、15000个细胞(4号孔)，每个培养孔中总液体体积为60μL。
(3)放入培养箱中，培养条件为：37℃、5％CO2、95％相对湿度，在融合度达到80％-90％时进行传代培养。
(4)制备钙黄绿素-AM染色剂对培养过一天和三天后的活细胞进行染色。
(5)在染色5分钟后，用ChemiDoc TM XRS+系统扫描(488通道)培养平台的底层，收集数据，采集的数据在Lab TM软件中进行分析，在每个时间点，使用ZEISSAxioVert.A1(ZEISS)对细胞进行成像，成像前用细胞凋亡诱导剂处理一排细胞并孵育10小时。
2、结果
图4中(a)显示了细胞培养一天和三天后细胞生长情况，细胞呈现高密度纤维纺锤形状，培养三天的培养孔中细胞覆盖率也较高，说明该装置可以正常使用于HDF细胞培养中，足以维持无菌培养环境，细胞生长状况良好。同时观察到在轻微的划痕和缺陷在塑料基板(未示出)上不影响成像。
图4中(b)显示平均亮度的增加与细胞增殖成正比，利用这种线性增加，可以为将来在药物筛选中测量细胞增殖情况提供一定依据。
实施例4培养平台对免疫荧光显微镜的兼容情况
免疫荧光显微镜是研究人员广泛使用的一种方法。因此，确保所述装置与该技术兼容是非常重要的。
1、方法和材料
(1)实验组使用如实施例1中的方法组装的培养平台，接种细胞之前使用培养基预湿润培养孔，在13mm的内孔中接种30000个细胞，体积为140μL，在7mm外孔中接种30μL的培养基不接种细胞，以防止内孔干燥。
对照组中将体积为500μl的30000个细胞接种到放置在24孔板中的13mm盖玻片中。
(2)培养1天后，用PBS洗涤细胞，室温下用4％PFA固定15分钟，用PBS反复洗涤.
(3)细胞使用10％FBS、0.3％Triton x100和1:500Alexa Fluor TM 555-拟单抗阻断、渗透和染色1小时。
(4)细胞在PBS中用300nm DAPI孵育5分钟进行核染色，然后用PBS洗涤。
(5)样品用Mowiol+DABCO安装在显微镜载玻片上。
(6)用3i旋转圆盘显微镜采集图像。
2、结果
图4中(c)中呈圆形的为染色后细胞核，呈现丝状的为染色后的肌纤维蛋白，显示了在普通盖玻片和本申请的培养平台的荧光成像效果。
当使用传统的样品制备方式时，在聚脂薄膜上生长的细胞的成像显示比在盖玻片上的细胞成像的分辨率更低，传统的成像样品制备方式包括将固定/染色细胞直接滴加到显微镜载玻片上，细胞在基质和显微镜直接滑动。盖玻片玻璃的厚度在130-160微米之间，光谱传输率高，折射率约为1.5230，聚酯薄膜的厚度为125微米，光谱传输率稍低，折射率超过1.6，雾度为0.4％，当通过基板成像时，材料之间的差异会导致成像分辨率的损失。
通过对传统的样品制备方法的改进，可以提高叠层细胞培养平台对高分辨率成像的兼容性。基板安装在显微镜载玻片上，固定/染色细胞朝外，然后在细胞顶部安装一个盖玻片，这样细胞位于基质和盖玻片之间，成像是通过盖玻片进行的，图4中(c)中第三排图像显示改造后成像情况，结果得到的图像分辨率与在盖玻片上生长细胞获得的图像相当，即使使用100倍的物镜也不会受到基质的干扰。
实施例5缺氧状态对细胞培养情况的影响
1、材料和方法
(1)使用实施例1中组装的细胞培养平台，接种前使用培养基预先湿润两个培养平台中的培养孔，每个培养孔中接种15000个细胞，接种100μL。
(2)一个培养平台正常培养细胞，另一个培养平台用1mM氯化钴处理细胞，诱导缺氧。
(3)将细胞孵育24h，室温下使用PBS洗涤，4％PFA固定15min，并用PBS反复洗涤，用10％FBS和0.3％Triton X-100在PBS中封闭/渗透30分钟，然后在PBS中用抗hif-1α抗体(用PBS稀释1:100)在4℃培养过夜，第二天，在PBS中反复清洗之后，样品在室温下用10％胎牛血清和山羊抗兔IgG(H+L)二级抗体Alexa Fluor Plus 555(用PBS稀释1:100)。
(4)用DAPI染色，用PBS洗涤，然后用mowiol+dabco固定在显微镜载玻片上，用3i旋转圆盘显微镜采集图像。
2、结果
实体肿瘤的外周环境氧气含量很低，因此研究验证缺氧环境下的药物对肿瘤细胞的作用对模拟体内肿瘤杀伤有重要的临床意义。通过本装置，可以调节平台各层间的密封程度，并在各层间设计氧气的通道，从而调节各层间的氧气含量。例如在通道连接的中心，细胞不会缺氧，但靠近培养平台边缘的位置会干得更快，而干燥不均匀会引起内部细胞缺氧状态的不同。图5显示细胞培养平台中心孔和侧孔的细胞的免疫荧光染色图，B1为培养平台侧面培养孔，B2指培养平台中心位置培养孔，染色包括使用DAPI和HIF-1α染色，当hif-1α荧光信号围绕DAPI标记的细胞核时，可以作为缺氧的指标。

Claims (8)

1.一种细胞培养平台，其特征在于，包括下层基底、内层垫片和上层覆盖层，内层垫片上连上层覆盖层，下连下层基底，使用既保证足够氧气流量又保证层与层之间密封的连接方式对齐连接；
所述下层基底和上层覆盖层均设计细胞培养区域，细胞培养区域外周为疏水边界，所述内层垫片内部结构为独立多通道，通道数量为1-10条；
所述内层垫片在其通道垂直方向上有穿透性孔洞，所述内层垫片的孔洞与下层基底分隔出的细胞培养区域、上层覆盖层分隔出的细胞培养区域叠加对齐后完全重合，形成细胞培养空间；
所述内层垫片孔洞侧边上下各设计一条2-3毫米宽的疏水线，疏水线与疏水边界完全闭合相连。
2.如权利要求1所述的细胞培养平台的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)设计图层：设计上层覆盖层和下层基底的细胞培养区域，细胞培养区域外周设计疏水边界，内层垫片孔洞侧边上下各设计2-3毫米宽的疏水线，内层垫片内部设计1-10条独立通道；
2)选择制片材料：选用高度透明具有光学清晰度、可印刷、具有生物相容性的薄膜作为制片材料制作下层基底、内层垫片和上层覆盖层；
3)打印疏水边界：利用打印的方法将疏水材料制作成步骤1)所述的疏水边界和疏水线，获得可组合成培养平台的下层基底、内层垫片和上层覆盖层；
4)切割图层：使用切割机切割步骤3)中获得的下层基底、内层垫片和上层覆盖层；
5)灭菌：对步骤4)中获得的下层基底、内层垫片和上层覆盖层进行灭菌处理；
6)组装：使用既保证足够氧气流量又保证层与层之间密封的连接方式组装步骤5)中下层基底、内层垫片和上层覆盖层，使所有层对齐并保持在一起。
3.如权利要求2所述的细胞培养平台的制作方法，其特征在于，步骤1)中所述的疏水边界厚度大于2毫米。
4.如权利要求2所述的细胞培养平台的制作方法，其特征在于，步骤1)中所述的疏水材料是PDMS或蜡中的一种。
5.如权利要求2所述的细胞培养平台的制作方法，其特征在于，步骤2)使用电晕技术在上层覆盖层和下层基底表面额外添加生物材料涂层。
6.如权利要求2所述的细胞培养平台的制作方法，其特征在于，步骤2)中所述的薄膜是聚酯膜、柔性玻璃、纸基微流体中的一种。
7.如权利要求2所述的细胞培养平台的制作方法，其特征在于，步骤3)中所述的打印的方法指喷墨印刷、彩色打印、喷涂或柔板印刷中的一种。
8.如权利要求2所述的细胞培养平台的制作方法，其特征在于，步骤6)中所述的连接方式为铂针连接、纽扣连接、粘合剂连接和3D外壳组装中的一种。
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