CN101974505A

CN101974505A - 一种表达高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle5三聚体工程菌的高密度发酵方法及其相应蛋白的分离纯化方法

Info

Publication number: CN101974505A
Application number: CN2010102985122A
Authority: CN
Inventors: 边六交; 冀旭; 马丽娜
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2011-02-16

Abstract

本发明涉及一种表达高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵培养方法以及相应三聚体蛋白的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：1)对重组菌的种子进行活化得到重组菌种子液；2)将重组菌种子液接种于二级种子培养基进行三角摇瓶扩大培养；3)将步骤2)进行扩大培养后的重组菌接种于半合成培养基进行扩大培养；半合成培养基中的碳氮比约为4.2。本发明提供了一种适宜于重组工程菌生长以及血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白高效表达的高密度发酵培养方法及其相应三聚体蛋白的分离纯化方法。

Description

一种表达高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle5三聚体工程菌的高密度发酵方法及其相应蛋白的分离纯化方法

技术领域

本发明属分子生物学领域，涉及一种工程菌的发酵培养方法，尤其涉及一种表达高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵培养方法以及相应三聚体蛋白的分离纯化方法。

背景技术

Folkman等于1972年首次提出：肿瘤的生长依赖于血管的生成，虽然小的瘤体可以通过渗透作用从周围组织中获得营养，但它的进一步生长则依赖于形成新的血管以获得充分的营养。血管生成是肿瘤组织得以快速生长和转移的基础。利用高效低毒的血管生成抑制剂抑制新生血管的形成从而切断肿瘤的营养供给以达到治疗肿瘤的目的，是当前肿瘤治疗领域研究的热点之一。

1994年，O’Reilly等发现内源性血管生成抑制剂Angiostatin是由纤溶酶原前四个饼环区组成。1997年，Cao等发现纤溶酶原N端的第五个饼环区(plasminogenkringle 5)同样具有抑制血管内皮细胞增殖和肿瘤生长的能力，而且抑制能力比Angiostatin更强。Kringle5被认为是迄今为止动物实验中抗肿瘤血管生成最有效的药物之一，而我们设计和表达的血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白具有比血管生长抑制剂Kringle 5更高的抑制血管生成活性。

近年来，国内外先后报道了有关肿瘤血管生长抑制剂Kringle 5基因的克隆和表达，以及Kringle1-4、Kringle1-3和Kringle5基因大肠杆菌的发酵工艺研究。血管生长抑制剂Kringle 5被认为是目前抑制血管内皮细胞增殖和迁移活性最强的纤溶酶原片段。目前用于培养抑制剂Kringle 5工程菌的培养基很多，但所用培养基均不能有效培养可表达高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种适宜于重组工程菌生长以及血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白高效表达的高密度发酵培养方法及其相应三聚体蛋白的分离纯化方法。

本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种表达高活性可溶型血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特殊之处在于：所述表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法包括以下步骤：

1)对重组菌的种子进行活化得到重组菌种子液；

2)将重组菌种子液接种于二级种子培养基进行三角摇瓶扩大培养；

3)将步骤2)进行扩大培养后的重组菌接种于半合成培养基进行扩大培养；所述半合成培养基中的碳氮比约为4.2。

上述半合成培养基成分包括酵母提取物、NH₄Cl、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O以及葡萄糖。

上述半合成培养基成分还包括KH₂PO₄或K₂HPO₄。

上述半合成培养基的组成为：酵母提取物10g·L^-1、NH₄Cl 0.30g·L^-1、NaH₂PO₄2.0g·L^-1、Na₂HPO₄5.0g·L^-1、MgSO₄·7H₂O 1.0g·L^-1以及葡萄糖6.0g·L^-1。

上述步骤1)的具体实现方式是：取-70℃20％甘油保藏的工程重组菌菌种，以8％的接种量接种于含LB培养基的试管中，30℃260r/min培养过夜，作为重组菌种子液。

上述步骤2)的具体实现方式是：取重组菌种子液按8％接种量接种于装有50.0mL二级种子培养基的250mL三角瓶中，30℃260r/min培养6h，得到20.0L发酵罐的菌种。

上步骤3)的具体实现方式是：取20.0L发酵罐的菌种按8％接种量接种于装有半合成培养基的20.0L自控罐中进行扩大培养，所述20.0L自控罐自动流加30％的氨水和13％的盐酸控制溶液的pH，通过搅拌转速的自动调节和空气流量的调节来调节溶氧量。

上述20.0L自控罐中进行培养时溶氧是40％。

上述二级种子培养基的组成是：胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L以及氯化钠5g/L。

上述LB培养基的组成是：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L以及氯化钠10g/L。

一种表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的分离纯化方法，其特殊之处在于：所述方法包括以下步骤：

1)将发酵好的Kringle 5三聚体工程菌进行离心收集菌体；

2)将步骤1)所得到的菌体破碎并离心，收集上清液，丢弃沉淀；

3)将步骤2)所得到的上清液进行等度+梯度方式进行洗脱，收集梯度开始后的紫外吸收峰，所述梯度开始后的紫外吸收峰为Kringle 5三聚体组分。

上述步骤1)的具体实现方式是：将发酵好的Kringle 5三聚体工程菌经过发酵培养和诱导表达后，用0.1M Tris-HCl重悬菌体并洗涤，于5000rpm离心5分钟，弃去上清液，所述0.1M Tris-HCl的pH为8.0。

上述步骤2)的具体实现方式是：

将菌体加入到0.1M Tris-HCl破碎缓冲液中，进行超声波破碎，破碎后于12000rpm离心10分钟，收集上清，丢弃沉淀，所述0.1M Tris-HCl的pH为8.0。

上述步骤3)的具体实现方式是：

取破碎后的上清液用5％B液充分平衡过的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱上，采用等度+梯度方式进行洗脱，所述洗脱程序为：先用5％B液冲洗至电导平衡，等紫外线平稳后进行梯度洗脱，洗脱方式为5％B液线性变化到100％B液；缓冲液A为0.05mol/L HAc-NaAc，缓冲液B为0.05mol/L HAc-NaAc+1.0mol/L NaCl。所述HAc-NaAc的pH是5.0；所述1.0mol/L NaCl的pH是5.0。

本发明的优点是：

本发明提供了一种表达非融合可溶型高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，该方法通过改变培养基成分，确定了适宜于重组工程菌生长和血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白高效表达的最佳培养基；采用正交实验，对重组工程菌生长和血管生长抑制剂Kringle 5三聚体的发酵和诱导表达条件进行了优化；通过发酵罐中重组工程菌的分批培养，确定了培养液中的最佳溶氧量；并对可溶性表达的血管生长抑制剂Kringle 5三聚体采用一步SPSepharose Fast Flow介质在梯度洗脱方式下进行了纯化。结果表明：经高效凝胶排阻色谱和反相色谱分析检测其纯度在96％以上；经鸡胚尿囊膜刺激实验表明表达的血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白具有抑制血管生成作用，且比血管生长抑制剂Kringle 5具有更高的抑制血管生成活性；采用优化后的发酵和分离纯化工艺，在20L发酵罐中血管生长抑制剂Kringle 5三聚体的表达量可达0.86g·L^-1。本发明明显提高了血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白的表达量，可以方便、快速地纯化血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白，其纯度和生物活性均可达到药用标准。基于本发明所提供的培养基能够表达的血管生长抑制剂Kringle 5三聚体蛋白比血管生长抑制剂Kringle 5蛋白具有更高的抑制血管生成活性，在肿瘤治疗方面具有巨大的潜在价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1是重组工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5的生长曲线图；

图2是重组工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5在发酵罐中分批发酵时各参数的变化示意图；

图3是经IPTG诱导后的菌体蛋白电泳图；

图4是重组Kringle 5三聚体蛋白表达的电泳图；

图5是重组Kringle 5三聚体蛋白分离纯化的离子交换层析图；

图6是离子交换层析分离后各馏分的电泳图；

图7是纯化后重组Kringle 5三聚体在凝胶排阻色谱上的分析检测图；

图8是纯化后的重组Kringle 5三聚体在反相色谱上的分析检测图；

图9是重组Kringle 5三聚体在质谱上的分子量；

图10是鸡胚尿囊膜法检测纯化后重组Kringle 5三聚体的生物活性图。

具体实施方式

本发明所选择的实验材料是：

1、主要试剂：限制性内切酶Nco I和Xho I、T4DNA连接酶、高保真Taq酶均购自Promega公司，Taq酶购自MBI；质粒小量提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒均购自OMEGA；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2、菌株和质粒：大肠杆菌BL21(DE3)plys、质粒pET15b以及带有Kringle 5基因的BL21(DE3)plys/pET 15b-K5工程菌。

3、培养基：

3.1试管种子培养基(LB，g/L)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

3.2二级种子培养基(2YT，g/L)：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L。

3.3半合成培养基：含有酵母提取物、氯化铵、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O和葡萄糖。

以上各培养基中都加入氨苄青霉素100μg/mL，121℃灭菌20分钟。

4、实验方法：依据上述的实验试剂以及菌株和质粒，本发明提供了一种表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，该方法包括以下步骤：

4.1种子的活化

取-70℃20％甘油保藏的工程菌种，以8％的接种量接种于含LB培养基的试管中，30℃260r/min培养过夜，作为种子液。

4.2重组菌发酵和诱导表达条件的优化

4.2.1培养方法：培养基的筛选和培养条件的优化在摇瓶中进行，重组菌的分批培养在德国B.Braun公司的micro DCU-400型20.0L自控罐中进行。三角摇瓶培养按8％接种量将种子液接种于装有50.0mL 2YT培养基的250mL三角瓶中，30℃260r/min培养6h，作为20.0L发酵罐的菌种；工程菌的分批发酵在德国B.Braun公司micro DCU-400型20.0L自控罐中进行，自动流加30％的氨水和13％的盐酸控制溶液的pH，通过搅拌转速的自动调节和空气流量的调节来调节溶氧量。

4.2.2培养基成分的选择：根据培养基中氮源和无机盐的种类和含量以及碳氮比，设计了五种发酵培养基，它们的成份和含量见表1。

表1几种发酵培养基的成份和含量

这五种培养基又根据其中葡萄糖含量的不同(6g·L^-1，10g·L^-1，15g·L^-1)分别平行分为三组，所有培养基的pH值均为7.0，含Amp 100μg/mL。在以上十五种培养基中，重组菌在30℃下分别连续培养8h，每小时取样测定菌体的光密度OD600，以光密度对数lnOD600对培养时间t作图，计算工程菌在各培养基中的比生长速率。结果表明，重组菌在B1培养基中有最大的比生长速率(0.262h-1)，在A1和A2培养基也有较高的比生长速率(0.250h-1和0.243h-1)，在其它培养基中的比生长速率则较小。

在A1、A2和B1三种具有较高比生长速率的培养基中，在同样条件下培养和诱导重组工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5，Kringle5三聚体在其中的表达量分别为0.45g·L-1，0.38g·L-1和0.40g·L-1。由于在培养基A1中Kringle5三聚体蛋白的表达量最大，因此，综合考虑到菌体的比生长速率和蛋白的表达量，选择A1为以后的发酵培养基。A1培养基的组成为(g·L-1)：酵母提取物10，NH₄Cl 0.30，NaH₂PO₄2.0，Na₂HPO₄5.0、MgSO₄·7H₂O 1.0，葡萄糖6。

发酵培养基中碳源、氮源、无机盐、微量元素的种类和含量以及碳氮比都会影响重组菌的生长和目标蛋白的表达。在表1中，与A培养基相比较，B培养基中的速效氮源NH4Cl含量较高，C培养基和D培养基中分别不含迟效氮源Yeastextract和速效氮源NH4Cl，而E培养基中钠盐和镁盐的含量较高。无机含氮化合物NH4Cl是一种速效氮源，容易被细胞吸收和利用，而Yeast extract中以蛋白形式存在的迟效氮源则有利于代谢产物的合成，同时其中也含有其它一些有利于重组菌生长和产物合成的生长剂和微量元素等营养物质。尽管重组菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5在B1培养基中有最大的比生长速率，但A1培养基中迟效氮源Yeast extract的含量较高，更有利于Kringle 5三聚体蛋白的表达；由于D和C培养基中分别不含速效氮源NH4Cl和迟效氮源Yeast extract，因此工程菌在其中的生长和Kringle5三聚体蛋白的表达均受到影响；重组菌在E培养基中的生长结果则表明，除了碳源和氮源之外，培养基中无机盐的含量对重组菌的生长也具有较大的影响，无机盐在低浓度时对微生物的生长和产物的合成有促进作用，而在高浓度时常会表现出明显的抑制作用；同时，在工程菌的培养过程中，培养液中的碳氮比也要合适，培养液中葡萄糖浓度过高，细菌分解代谢的有害废物(特别是乙酸)积累就会过多，从而可能会抑制细菌的生长和降低外源蛋白的表达。因此，综合考虑工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5的生长速率和外源基因的表达水平两个主要因素，选择A1为发酵培养基。在A1培养基中，碳氮比约为4.2。

4.2.3工程菌生长曲线的测定：在选定的优化培养基上，测定工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5的生长曲线，选定对数生长期。参见图1，其中，重组工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5的生长曲线在OD600分别为0.4、0.6和0.9时，分别对应于工程菌对数生长期的前期、中期和后期。

4.2.4诱导表达条件的优化：由于接种量、温度、pH、摇床转速、诱导剂浓度、诱导时机和诱导时间七个因素是影响重组菌生长和Kringle 5三聚体蛋白表达的主要因素，因此采用优化后的培养基A1，按7因素不同水平安排正交表L18(6×36)，以确定这些因素的最优组合。这七个因素的水平分别为：诱导剂量(mmol·L-1)：a1＝0.4，a2＝0.6，a3＝0.8，a4＝1.0，a5＝1.2，a6＝1.4；诱导时间(h)：b1＝4，b2＝5，b3＝6；诱导时机(OD600)：c1＝0.4，c2＝0.6，c3＝0.9，它们分别对应于工程菌对数生长期的前期、中期和后期；温度(℃)：d1＝25，d2＝30，d3＝35；pH：e1＝6.5，e2＝7.0，e3＝7.5；接种量％(v/v)：f1＝5，f2＝8，f3＝10；摇床转速(r·min-1)：g1＝150，g2＝200，g3＝260。正交实验的结果和极差分析见表2。

表2的极差分析结果表明，在影响重组菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5生长和Kringle 5三聚体蛋白表达的七个主要因素中，溶液中诱导剂浓度的影响最为显著，诱导时间、诱导时机、温度、pH、摇床转速的影响次之，而接种量的影响不显著。表2结果同时显示出这七个因素的最优组合为：温度30℃，pH 7.0，诱导剂量0.8mmol·L^-1，诱导时机OD₆₀₀0.6，诱导时间6h，接种量8％，摇床转速260r·min^-1。

使用重组菌表达蛋白时，一般应当在菌体对数生长期的中后期加入诱导剂，诱导剂加入过早或过迟都会影响外源蛋白的表达。在重组菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5的发酵过程中，如果过早加入IPTG就会诱导外源蛋白的过早表达，从而抑制菌体的生长，而如果诱导过迟，则由于细胞生长停止后各种酶系统的活力下降，也会影响外源蛋白的表达。同时，培养基中诱导剂IPTG 的浓度对重组菌Kringle 5三聚体蛋白的表达也会产生很大影响，过低的IPTG浓度可能会使Kringle 5三聚体蛋白的表达速度降低，甚至于不能诱导Kringle 5三聚体蛋白的表达，但过高浓度的IPTG对含质粒的工程菌的生长又具有抑制作用，从而可能降低菌体Kringle 5三聚体蛋白的表达速度。表2的正交实验结果表明，当重组菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5生长到对数生长期的中期、培养基中诱导剂IPTG的浓度为0.8mmol·L^-1时，Kringle 5三聚体蛋白的表达量最大。

表2重组工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5批式发酵的正交实验和极差分析

4.2.5发酵罐分批培养时溶氧的确定：按照摇瓶培养优化后的培养条件，在20L发酵罐中将溶氧分别控制在30％、40％和50％进行培养，测定Kringle 5三聚体蛋白的表达量。实验结果表明，当溶氧超过40％时，Kringle 5三聚体蛋白的表达量不再升高，故发酵罐分批培养时溶氧控制在40％。

参见图2，纵坐标从左到右依次为：OD，Residual Sugar Concentration/g·L-1，Agitate/r·min-1，pH，DO/％和T/℃；横坐标为：Time/h。图例：在10小时时，从上到下依次为：OD，pH，DO/％，T，Agi和RSC。按照优化后的发酵条件，从重组菌在20L发酵罐中发酵时各参数的变化可以看出，细胞快速生长期内糖消耗速度最快；而发酵前期，由于细胞初级代谢产生了以乙酸为主的中间产物，培养液中的pH不断下降，需不断加入氨水维持pH在7.0。

4.2.6分析方法：在以上实验过程中，菌体密度通过分光光度计测定600nm的光吸收值；目标蛋白占菌体总蛋白的百分含量通过SDS-PAGE凝胶电泳由激光灰度扫描仪来测定；菌体总蛋白用Bradford法测定；葡萄糖浓度用3，5-二硝基水杨酸法测定。

4.3重组蛋白质表达分布位置的鉴定：工程菌体经过发酵培养和诱导表达后，5000rpm离心收集菌体，用0.1M Tris-HCl(pH8.0)重悬菌体并洗涤，于5000rpm离心5分钟，弃去上清液。然后将菌体加入到0.1M Tris-HCl(pH8.0)破碎缓冲液中，进行超声波破碎，破碎后于12000rpm离心10分钟，分别收集上清和沉淀部分，沉淀分别用0.5％Triton X100和2.0M尿素洗涤后用7.0M尿素溶解。上清与沉淀以及未加诱导的对照菌体分别做SDS-PAGE，随后染色、脱色和成像。

参见图3，经IPTG诱导的菌体蛋白电泳图，其中，泳道1表示蛋白质分子量marker；泳道2表示未诱导对照；泳道3-5表示IPTG诱导后电泳结果；结果表明，经IPTG诱导后，重组菌体在分子量约为2.8kD处有明显的表达条带。这表明它们是以Kringle 5三聚体分子形式存在的，其表达量约占菌体总蛋白的25％。

参见图4，重组Kringle 5三聚体蛋白表达上清和沉淀的电泳图，其中，泳道1是2.0M尿素洗涤沉淀一次电泳图；泳道2是2M尿素洗涤沉淀二次电泳图；泳道3是2M尿素洗涤三次电泳图；泳道4是沉淀8M尿素溶解；泳道5是上清电泳图；泳道6是蛋白marker；泳道7是IPTG诱导裂解液；结果表明，所表达的Kringle 5三聚体蛋白不是以包涵体的形式存在的，它们以可溶形式存在于上清中。

4.4重组蛋白质的分离纯化：取破碎后的样品上清上样于用5％B液充分平衡过的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱上，采用等度+梯度方式进行洗脱。洗脱程序为：先用5％B液冲洗至电导平衡，等紫外线平稳后进行梯度洗脱，洗脱方式为5％B液线性变化到100％B液。缓冲液A为0.05mol/L HAc-NaAc(pH5.0)，缓冲液B为0.05mol/L HAc-NaAc+1.0mol/L NaCl(pH5.0)。然后收集色谱峰，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

参见图5，重组Kringle 5三聚体蛋白分离纯化的离子交换层析图，其中，1是流穿蛋白峰；2是洗脱蛋白峰；层析介质：SP Sepharose Fast Flow (1.0×5.0cmi.d)；样品：5.0ml破碎液上清；洗脱液A：0.05mol/L HAc-NaAc(pH5.0)，洗脱液B：0.05mol/L HAc-NaAc+1.0mol/L NaCl(pH5.0)。梯度：0-100min，洗脱液5％B；100-300min：洗脱液B 5-100％；300-400min，100％洗脱液B；流速：0.5mL/min；280nm紫外检测。

参见图6，离子交换层析分离后各馏分的电泳图，其中泳道1是流穿蛋白峰；泳道2-6是洗脱蛋白峰；泳道7是蛋白marker。结果表明，流穿峰中不含有或含很少的Kringle 5三聚体蛋白，绝大多数Kringle 5三聚体蛋白在洗脱峰中，且收集的是一个很纯的馏分。换算到原始发酵体积可知，Kringle 5三聚体蛋白的表达量约为0.86g·L-1。

4.5重组蛋白质的纯度和活性检测：用高效凝胶排阻色谱和反相色谱检测纯化后重组Kringle 5三聚体的纯度，用SDS-PAGE和质谱检测其分子量，用鸡胚尿囊膜法检测纯化后重组Kringle 5三聚体的生物活性。

参见图7，纯化后重组Kringle 5三聚体在凝胶排阻色谱上的分析检测，色谱柱：Shimadzu Diol-300(25×7.9mm i.d.)；样品：20μL；洗脱液：20mmol/L磷酸盐缓冲液+0.2mol/L NaCl，pH 7.4；流速：1.0mL/min；280nm紫外检测。

参见图8，纯化后的重组Kringle 5三聚体在反相色谱上的分析检测，色谱柱：Shim-pack VP-ODS(150mm×4.6mm i.d)；样品：20μL；洗脱液A：含0.1％三氟乙酸的水，洗脱液B：含0.1％三氟乙酸的乙腈；梯度：0-30min，洗脱液B 0-100％；30-40min，100％洗脱液B；流速：1.0mL/min；280nm紫外检测。

以上凝胶排阻色谱和反相色谱结果表明，所收集的洗脱峰纯度在96％以上，几乎不含其多聚体分子。

参见图9，是重组Kringle 5三聚体在质谱上的分子量，结果表明，经IPTG诱导后，所收集的洗脱峰纯度分子量约为2.89kD，表明它们是以Kringle 5三聚体分子形式存在的。

参见图10，用鸡胚尿囊膜法检测纯化后重组Kringle 5三聚体的生物活性，其中，图10.1是加有1.0毫升20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的鸡胚尿囊膜；图10.2是加有1.0mg Kringle 5三聚体的鸡胚尿囊膜。结果表明，所表达的三聚体Kringle5具有血管生长抑制活性。经进一步实验结果表明，三聚体Kringle 5比单体Kringle5具有更强的血管生长抑制活性，其抑制血管生成活性约是Kringle 5蛋白的三倍。

Claims

1.一种表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法包括以下步骤：

1)对重组菌的种子进行活化得到重组菌种子液；

2.根据权利要求1所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述半合成培养基成分包括酵母提取物、NH₄Cl、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O以及葡萄糖。

3.根据权利要求2所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述半合成培养基成分还包括KH₂PO₄或K₂HPO₄。

4.根据权利要求3所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述半合成培养基的组成为：酵母提取物10g·L-1、NH₄Cl 0.30g·L-1、NaH₂PO₄2.0g·L-1、Na₂HPO₄5.0g·L-1、MgSO₄·7H₂O1.0g·L-1以及葡萄糖6.0g·L-1。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：取-70℃20％甘油保藏的工程重组菌菌种，以8％的接种量接种于含LB培养基的试管中，30℃260r/min培养过夜，作为重组菌种子液。

6.根据权利要求5所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述步骤2)的具体实现方式是：取重组菌种子液按8％接种量接种于装有50.0mL二级种子培养基的250mL三角瓶中，30℃260r/min培养6h，得到20.0L发酵罐的菌种。

7.根据权利要求6所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述步骤3)的具体实现方式是：取20.0L发酵罐的菌种按8％接种量接种于装有半合成培养基的20.0L白控罐中进行扩大培养，所述20.0L自控罐自动流加30％的氨水和13％的盐酸控制溶液的pH，通过搅拌转速的自动调节和空气流量的调节来调节溶氧量。

8.根据权利要求7所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述20.0L自控罐中进行培养时溶氧是40％。

9.根据权利要求1所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述二级种子培养基的组成是：胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L以及氯化钠5g/L。

10.根据权利要求5所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的高密度发酵方法，其特征在于：所述LB培养基的组成是：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L以及氯化钠10g/L。

11.一种表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的分离纯化方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)将发酵好的Kringle 5三聚体工程菌进行离心收集菌体；

12.根据权利要求11所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)的具体实现方式是：将发酵好的Kringle 5三聚体工程菌经过发酵培养和诱导表达后，用0.1M Tris-HCl重悬菌体并洗涤，于5000rpm离心5分钟，弃去上清液，所述0.1M Tris-HCl的pH为8.0。

13.根据权利要求12所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)的具体实现方式是：

14.根据权利要求13所述的表达高活性血管生长抑制剂Kringle 5三聚体工程菌的分离纯化方法，其特征在于：所述步骤3)的具体实现方式是：

取破碎后的上清液用5％B液充分平衡过的SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱上，采用等度+梯度方式进行洗脱，所述洗脱程序为：先用5％B液冲洗至电导平衡，等紫外线平稳后进行梯度洗脱，洗脱方式为5％B液线性变化到100％B液；缓冲液A为0.05mol/L HAc-NaAc，缓冲液B为0.05mol/L HAc-NaAc+1.0mol/L NaCl所述HAc-NaAc的pH是5.0；所述1.0mol/L NaCl的pH是5.0。