CN101966192A

CN101966192A - 连翘酯苷在制备治疗单纯疱疹药物中的用途

Info

Publication number: CN101966192A
Application number: CN2009100576477A
Authority: CN
Inventors: 玄振玉
Original assignee: SHANGHAI YOUSEEN NEW MEDICINE EXPLOITATION CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI YOUSEEN NEW MEDICINE EXPLOITATION CO Ltd
Priority date: 2009-07-27
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2011-02-09

Abstract

本发明属中药制药领域，涉及中药提取物连翘酯苷在制备治疗单纯疱疹药物中的用途。本发明通过体外和小鼠体内试验对连翘酯苷的抗单纯疱疹病毒作用进行研究。实验结果揭示，连翘酯苷在体内外均对小鼠单纯疱疹II型病毒具有明显抑制作用，效果与剂量呈现量效关系。

Description

连翘酯苷在制备治疗单纯疱疹药物中的用途

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及连翘酯苷的医药新用途。

背景技术

单纯疱疹病毒直径约为120-150微米，向外依次由包膜、体被、衣壳三种同心结构组成，它在低温下可生存数月，在湿热50℃及干燥90℃条件下30分钟可消灭。人类是单纯疱疹病毒的唯一自然宿主，人群感染高达80-90％，10％无症状。

单纯疱疹病毒可分为I型和II型二种，I型疱疹病主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官。如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹，99％是由I型疱疹病毒感染引起的。II型疱疹病毒主要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。据有关统计资料显示，生殖器疱疹的病原体90％为II型疱疹病毒，仅10％为I型疱疹病毒。经性器官接触后，潜伏约2-20天(平均6天)，有免疫缺陷或免疫功能不全的人，如应用免疫抑制剂、肾移植、严重烧伤、重度营养不良、血液淋巴系统恶性肿瘤病人等感染后症状加重，可出现疱疹性湿疹、复发性角膜溃疡，甚至全身播散性疱疹而致命。感染1-3周后体内产生中和抗体及补体结合抗体，残存的病毒可能向周围神经沿神经轴转入三叉神经节(I型疱疹病毒)或骶神经节(II型疱疹病毒)，而长期潜伏，进入静止状态。当某种诱发因素如焦虑、精神创伤、受凉、日晒、吹风、创伤、感染、药物过敏、高热、月经、妊娠等破坏身体生理平衡时，神经细胞中出现病毒增殖所需的特异性转录酶，激活病毒而引起复发，体液抗体并不能制止疱疹病毒复发，细胞免疫减弱对复发有重大影响。在国外，生殖器疱疹的发病率在性病中仅次于淋病和梅毒，居性病发病率的第三位，在由病毒所引起的性传播疾病中占第一位。

连翘酯苷(Forsythiaside)是从木犀科连翘属植物连翘中提取的有效成分。近年来，有文献报道，连翘酯苷有良好的抗菌作用：如王宏军等报道连翘酯苷在体外和对引发奶牛乳房炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌均有较好的抑制作用；如冯淑怡等报道，连翘酯苷对绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡菌球菌致病的模型小鼠具有很好地抗感染作用。连翘酯苷，结构式如下：

发明人在以往的研究中，对连翘进行了大量的研究，并获得了连翘酯苷，可见中国专利CN101081855A、CN101081856A、CN101081857A、CN1899382A或CN101209286A等。

目前现有技术对连翘酯苷的抗疱疹病毒药理活性研究很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供连翘酯苷在制药中的新用途，具体涉及连翘酯苷在制备治疗单纯疱疹病毒药物中的用途。

本发明通过连翘酯苷体外抗单纯疱疹II型病毒试验，观察连翘酯苷抗体外单纯疱疹II型病毒的药效作用。

本发明通过连翘酯苷体内抗单纯疱疹II型病毒试验，观察连翘酯苷体内抗单纯疱疹II型病毒的药效作用。

本发明随后的连翘酯苷抗单纯疱疹II型病毒试验结果表明：连翘酯苷在体内外均对小鼠单纯疱疹II型病毒具有明显抑制作用，效果与剂量呈现量效关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

实施例1(连翘酯苷体外抗单纯疱疹II型病毒试验)

一、实验目的：观察连翘酯苷体外对单纯疱疹II型病毒的抑制效果。

二、实验材料：

1、受试药物：连翘酯苷，由上海玉森新药开发有限公司提供，批号：060909(该药物制备方法可参见中国专利CN101081855A、CN101081856A、CN101081857A、CN1899382A、CN101209286A。)

2、阳性对照药物：注射用阿昔洛韦，湖北潜江制药股份有限公司生产，批号为20070302

3、毒株：单纯疱疹病毒(HSV)标准毒株II型333株，由北京中国医学科学院医药生物技术研究所提供。

4、Vero细胞

三、实验方法

1、药物细胞毒性试验：

Vero细胞在96孔培养板单层培养37℃，5％CO₂培养24小时，分别加入不同浓度受试药物药液(4000、2000、1000、500、250、125、62.5μg/ml)，经72小时观察细胞形态及用MTT法测定OD值，计算药物致细胞毒性TC₅₀。得到受试药物药液对Vero细胞的最大无毒浓度供细胞病变抑制试验使用。

2、细胞病变抑制试验：

Vero细胞在96孔培养板单层培养37℃，5％CO₂培养24小时，加入10TCID₅₀单纯疱疹病毒II型病毒液，37℃，5％CO₂吸附2小时，吸去病毒，加入最大无毒浓度下受试药物药液7个浓度(1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6μg/ml)，经37℃，5％CO₂培养72小时，观察致细胞病变作用(CPE)。另设阿昔洛韦阳性对照组，给药浓度为2.0μg/mL。与受试药物组同时观察CPE，用MTT法测定OD值，计算半数有效抑制浓度(IC₅₀)及治疗指数(TI)。

四、试验结果(见表1、2、3)：

体外试验，数据经SPSS软件处理，并采用改良寇氏法计算TC₅₀、IC₅₀结果显示受试药物对Vero细胞半数中毒浓度(TC₅₀)在2518μg/ml，在854.9μg/ml浓度下能半数有效抑制(IC₅₀)单纯疱疹II型病毒，抑制效果与2.0μg/ml阿昔洛韦相接近。

表1受试药物对Vero细胞的毒性

表2受试药物体外对小鼠单纯疱疹病毒HSV-II抑制试验(I)

表3受试药物体外对小鼠单纯疱疹病毒HSV-II抑制试验(II)

五、结论：

汇总两次实验，连翘酯苷在2518μg/ml浓度下对50％Vero细胞有毒。在854.9μg/m能半数有效抑制(IC₅₀)单纯疱疹II型病毒，抑制效果与2.0μg/ml阿昔洛韦相接近，连翘酯苷体外抑制单纯疱疹II型病毒治疗指数TI值为2.94。

实施例2(连翘酯苷体内抗单纯疱疹II型病毒试验)

一、试验目的：

观察连翘酯苷体内对小鼠单纯疱疹病毒HSV-II感染阴道炎抑制试验的药效作用。

二、试验材料：

受试药物：同实施例1的受试药物。

阳性对照药物：同实施例1的阳性对照药物。

动物：昆明小鼠，体重17～20克，雌性。复旦大学实验动物科学部提供，许可证号：scxk沪2007-0002。

毒株：单纯疱疹病毒(HSV)标准毒株II型333株，由北京中国医学科学院医药生物技术研究所提供。

实验药物药液配制：

(1)受试药物供试液

A.24mg/cm²剂量组：取连翘酯苷冻干粉用生理盐水溶解配成200mg/ml连翘酯苷溶液(a液)。

B.12mg/cm²剂量组：取上述a液用生理盐水稀释1倍，配成100mg/ml连翘酯苷溶液(b液)。

C.6mg/cm²剂量组：取上述b液用生理盐水稀释1倍，配成50mg/ml连翘酯苷溶液。

(2)阿昔洛韦供试液：

50mg/ml阿昔洛韦溶液：取阿昔洛韦针剂250mg，加入无菌水5ml，配成50mg/ml溶液。

注：小鼠阴道周长约0.5cm，长(给药深度)约0.5cm，给药面积约0.25cm²。

三、试验方法

1、受试药物对小鼠阴道HSV-II感染后生命保护试验

取雌性小鼠，随机分组，每组6只，实验设：(1)、正常对照组；(2)、病毒对照组；(3)、阳性药物对照组；(4)、受试药物组：大剂量24mg/cm²、中剂量12mg/cm²和小剂量6.0mg/cm²。

除正常对照组外，小鼠均阴道感染5×LD₅₀病毒量，病毒感染2小时后即开始给药。

阳性药物对照组：阿昔洛韦阴道给药，每次给药0.03ml/0.25cm²，每日1次，共给药7天，观察2周。

受试药物组：每次给药0.03ml/0.25cm²，每日1次，共给药7天，观察2周。记录死亡数，用SPSS11.5软件作统计学处理，计算死亡率、平均生存天数和生命延长％；并根据动物死亡情况计算药物半数有效剂量(ED₅₀)。

2、受试药物对小鼠阴道HSV-II病毒滴度的抑制试验

除正常对照组外，小鼠均阴道感染5×LD₅₀病毒量，病毒感染2小时后即开始给药，给药量同生命保护试验，感染和给药后第4天取样分离病毒检测TCID₅₀。

四、试验结果

1、小鼠生命保护试验结果(见表4、5、6、7)

结果显示外用受试药物对小鼠HSV-II感染阴道炎与病毒对照组比较，给药24、12、6mg/cm²受试药物可抑制HSV-II病毒，生命延长83.3％、63.0％和51.9％。在感染和给药后第8天时病毒组小鼠全部死亡，因此采用改良寇氏法计算第8天时受试药物对雌性小鼠HSV-II感染的阴道炎抑制半数有效浓度(EC₅₀)为15.1mg/cm²。

表4受试药物对小鼠生命的保护(I)

^*：p＜0.05；^**：p＜0.01

表5受试药物对小鼠生命的保护(II)

^*：p＜0.05；^**：p＜0.01

表6受试药物对小鼠生命的保护(汇总)

^*：p＜0.05；^**：p＜0.01

表7第8天时小鼠存活数及受试药物保护生命50％计算

ED₅₀＝15.1mg/cm²

2、受试药物对小鼠阴道HSV-II病毒滴度的抑制(见表8，9，10)

感染给药后第4天，从小鼠的阴道中分离病毒，与病毒对照组相比，给药组病毒毒力下降，病毒对照组的病毒TCID₅₀为10^-2.67，受试药物给药剂量24mg/cm²、12mg/cm²、6mg/cm²时，病毒TICD₅₀分别为10^-1.04，10^-1.54，10^-1.64，病毒毒力的抑制率分别为97.6％，92.6％，90.6％。

表8受试药物对小鼠阴道HSV-II病毒毒力的抑制(I)

表9受试药物对小鼠阴道HSV-II病毒毒力的抑制(II)

所有组别都与病毒对照组数据比较。^*：P≤0.05，^**：P≤001

表观稀释倍数(X)表示真实稀释倍数10X，X越大表示需要稀释的倍数越大，病毒的毒力越强。

表10受试药物对小鼠阴道HSV-II病毒TCID₅₀的抑制

五，结论：

体内试验结果显示连翘酯苷阴道给药对小鼠HSV-II感染阴道炎有治疗效果。与病毒对照组比较，连翘酯苷给药24mg/cm²、12mg/cm²、6mg/cm²可保护HSV-II病毒感染导致的小鼠死亡，生命延长83.3％、63.0％和51.9％，抑制半数有效浓度(EC₅₀)为15.1mg/cm²。

感染给药后第4天，从小鼠的阴道中分离病毒，与病毒对照组相比，给药组病毒毒力下降，结果有显著性差异。给药剂量24mg/cm²，12mg/cm²，6mg/cm²时，连翘酯苷病毒毒力的抑制率分别为97.6％，92.6％，90.6％。