CN101955516A

CN101955516A - 一种制备微囊藻毒素-lr的方法

Info

Publication number: CN101955516A
Application number: CN 201010507609
Authority: CN
Inventors: 刘思全; 王立国; 贾瑞宝; 陈永芳
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明涉及一种制备微囊藻毒素-LR的方法。本方法以从云南滇池得到的蓝藻为原料，用50～90％(v/v)的乙腈水溶液提取得到微囊藻毒素粗品，膜过滤去除杂质。采用固相萃取进行初步纯化与富集，半制备高效液相色谱进行分离纯化。本方法前处理步骤除去了大部分杂质，减轻了高效液相色谱的纯化难度，且方法简单，易于操作，微囊藻毒素损失较少，最终得到微囊藻毒素-LR的纯度较高(91.35％)。

Description

一种制备微囊藻毒素-LR的方法

技术领域

本发明涉及一种从蓝藻中制备微囊藻毒素-LR的方法，该方法是从天然蓝藻中提取微囊藻毒素异构体混合物，分离纯化后得到微囊藻毒素异构体-LR。

背景技术

水体富营养化的加剧，引起藻类的大量繁殖。我国云南滇池、江苏太湖和安徽巢湖等多个淡水湖泊都相继发生了不同程度的蓝藻“水华”现象，蓝藻“水华”的次生代谢产物微囊藻毒素对水环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。随着对微囊藻毒素研究的不断深入，对微囊藻毒素异构体纯品的需求也越来越大。

目前，我国尚未有成熟的微囊藻毒素异构体纯品制备技术，所需的微囊藻毒素异构体纯品全部依靠国外进口。随着国际上将微囊藻毒素列入生化武器一类的“禁药”，订购过程中存在很多限制和困难。高纯度微囊藻毒素异构体纯品的缺乏，严重阻碍了我国微囊藻毒素的基础研究(如微囊藻毒素的产生机制、环境浓度的测定、毒理学研究、生物降解研究等)。文献报道了很多微囊藻毒素异构体的分离方法，如尺寸排阻色谱、快速色谱、离子交换色谱、制备型高压液相色谱等。但用于异构体纯品的大量制备的方法尚不成熟。

发明内容

本发明提供了一种制备微囊藻毒素-LR异构体的方法，其特征在于该异构体的制备是通过固相萃取预纯化与半制备高效液相色谱分离技术相结合。

本发明的技术方案如下：

1、微囊藻毒素的粗提：称取一定量的蓝藻干粉，按20～30mL/g的比例加入50～90％(v/v)的乙腈/水溶液，室温下磁力搅拌30～90min，超声震荡10～40min，液氮冷冻10～30min，解冻后以10000rpm的转速离心5～20min，取出上清液。残渣以上述步骤重复两次，合并上清液。将合并的上清液进行膜过滤，除去纤维等杂质，得到微囊藻毒素粗品。

2、富集与初步纯化：步骤1中所制得的微囊藻毒素粗品通过ODS C₁₈反相固相萃取柱富集，依次用10mL 100％甲醇、10mL超纯水活化固相萃取柱，再将粗提液以1mL/min的流速流经固相萃取柱进行浓缩富集，5mL 40％(v/v)的甲醇/水溶液淋洗，10mL 60～90％(v/v)乙腈/水溶液洗脱，收集洗脱液，30℃旋蒸浓缩至2mL。

3、分离：利用高效液相色谱法对微囊藻毒素异构体进行分离。色谱条件：Kromasil C₁₈色谱柱(250*21mm，5μm)；流动相：乙腈/水溶液；柱温：20～30℃；检测波长：238nm；流速：0.5mL/min。进样量：100μL。

收集保留时间与标样一致的微囊藻毒素-LR异构体，旋干，得到目标产品，利用质谱手段表征，纯度大于90％。

附图说明

图1微囊藻毒素异构体混合物的高效液相色谱图

图2制备得到微囊藻毒素-LR的高效液相色谱图

实施例1

在150mL的锥形瓶中，加入2g采集自滇池的蓝藻干粉和40mL 65％(v/v)的乙腈/水溶液，室温下磁力搅拌60min，超声震荡20min，液氮冷冻10min。解冻后以10000rpm的转速离心10min，取出上清液。残渣采用上述步骤重复提取两次，合并上清液。以0.45μm的微滤膜过滤，得微囊藻毒素粗品。采用固相萃取方法对粗品初步提纯：依次用10mL 100％甲醇、10mL超纯水活化固相萃取柱，将粗提液以1mL/min的流速流经固相萃取柱进行浓缩富集，5mL 40％(v/v)的甲醇/水溶液淋洗除去杂质，10mL 70％(v/v)乙腈/水溶液洗脱并收集样品组分，洗脱液30℃条件下旋蒸浓缩至2mL。利用半制备型高效液相色谱对微囊藻毒素异构体进行分离，质谱表征，收集微囊藻毒素-LR异构体，得到0.11mg微囊藻毒素-LR，纯度91.35％。

实施例2

在150mL的锥形瓶中，加入4g采集自滇池的蓝藻干粉和100mL 65％(v/v)的乙腈/水溶液，室温下磁力搅拌90min，超声震荡20min，液氮冷冻10min。解冻后以10000rpm的转速离心10min，取出上清液。残渣采用上述步骤重复提取两次，合并上清液。以0.45μm的微滤膜过滤，得微囊藻毒素粗品。采用固相萃取方法对粗品初步提纯：依次用10mL 100％甲醇、10mL超纯水活化固相萃取柱，将粗提液以1mL/min的流速流经固相萃取柱进行浓缩富集，5mL40％(v/v)的甲醇/水溶液淋洗除去杂质，10mL 80％(v/v)乙腈/水溶液洗脱并收集样品组分，洗脱液30℃条件下旋蒸浓缩至3mL。利用制备型高效液相色谱对微囊藻毒素异构体进行分离，质谱表征，收集微囊藻毒素-LR异构体，得到0.25mg微囊藻毒素-LR，纯度90.51％。

比较例：

在150mL的锥形瓶中，加入4g采集自滇池的蓝藻干粉和100mL 65％(v/v)的甲醇/水溶液，室温下磁力搅拌60min，超声震荡20min，液氮冷冻10min。解冻后以10000rpm的转速离心10min，取出上清液。残渣采用上述步骤重复提取两次，合并上清液。以0.45μm的微滤膜过滤，得微囊藻毒素粗品。采用固相萃取方法对粗品初步提纯：依次用10mL 100％甲醇、10mL超纯水活化固相萃取柱，将粗提液以1mL/min的流速流经固相萃取柱进行浓缩富集，5mL 40％(v/v)的甲醇淋洗除去杂质，10mL 80％(v/v)甲醇水溶液洗脱并收集样品组分，洗脱液30℃条件下旋蒸浓缩至3mL。利用半制备型高效液相色谱对微囊藻毒素异构体进行分离，质谱表征，收集微囊藻毒素-LR异构体，得到0.1mg微囊藻毒素-LR，纯度78.50％。

Claims

1.一种制备微囊藻毒素-LR异构体的方法，其特征在于该异构体的制备是通过固相萃取预纯化与半制备高效液相色谱技术分离相结合的方法实现的。

2.根据权利要求1所述的微囊藻毒素异构体-LR的分离纯化方法，其特征在于它包括步骤(1)用不同浓度的乙腈溶液从蓝藻细胞中提取微囊藻毒素；步骤(2)对步骤(1)提取的微囊藻毒素粗品进行富集与初步纯化；步骤(3)使用半制备高效液相色谱对步骤(2)得到的微囊藻毒素各异构体进行分离与纯化，得到微囊藻毒素-LR。

3.根据权利要求2所述的分离纯化微囊藻毒素-LR的方法，其特征在于步骤(1)所述的提取工艺是用乙腈/水溶液作为提取溶剂，通过超声和液氮冷冻相结合从蓝藻藻浆中提取微囊藻毒素异构体的混合物。该混合物通过膜过滤，除去植物纤维等杂质。

4.根据权利要求2中步骤(2)所述的微囊藻毒素粗品富集与初步纯化的方法，其特征在于该纯化过程是通过ODS C₁₈反相固相萃取柱完成的，萃取所用流动相为乙腈/水溶液。

5.根据权利要求2中步骤(3)所述的微囊藻毒素-LR制备方法，其特征在于，制备手段为半制备高效液相色谱，色谱条件为：Kromasil C₁₈色谱柱(250*21mm，5μm)；流动相：80％(v/v)乙腈/水溶液；柱温：20～30℃；检测波长：238nm；流速：0.5mL/min。

6.根据权利要求3所述的方法，提取所用的乙腈/水溶液的浓度为50～90％(v/v)，除杂所用膜为截留分子量10000～100000MW超滤膜或0.22～1.0μm微滤膜。

7.根据权利要求4所述的固相萃取过程，用于洗脱微囊藻毒素粗品的乙腈/水溶液的浓度为60～90％(v/v)。