CN103163001B - 一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素lr、rr的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法，包括以下几个步骤：A、用生物网捞取滇池爆发期的水华，再通过过滤筛过滤藻样；B、对处理后的藻样进行反复冻融处理；C、将经过B步骤处理后的藻样浸泡在乙酸溶液中，浸泡过程中，同时配以超声波仪，进一步破坏细胞壁，离心，取上清液；D、上清液经活化后的固相萃取柱；E、富集结束后固相萃取柱清洗后，待干燥后，再洗脱微囊藻毒素；F、将步骤E获得的洗脱液通过硅胶小柱，用甲醇洗脱硅胶小柱，从甲醇中吸附溶解于其中的微囊藻毒素；G、洗脱液上旋转蒸发仪浓缩；H、利用高效液相色谱，分离微囊藻毒素LR、RR；I、提纯。本发明制出的成品纯度高。

Description

一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法。

背景技术

滇池的富营养化过程从二十世纪70年代后期开始，进入二十世纪80年代，特别是90年代，富营养化日趋严重。20世纪60年代末无论草海还是外海水质均为Ⅱ类；70年代为Ⅲ类；70年代后期，水质开始恶化，草海水质80年代变为Ⅴ类，90年代为劣Ⅴ类，严重富营养化，局部沼泽化；外海水质二十世纪80年代为Ⅳ类，90年代为Ⅴ类，严重富营养化。

湖泊富营养化致使藻类异常增殖，并释放生物毒素，这些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的安全。其中以微囊藻产生的微囊藻毒素引起了人们的广泛重视，特别是其中的微囊藻毒素LR是目前已知急性最强、危害最大的一种淡水蓝藻毒素。微囊藻毒素的化学结构如图1所示。

微囊藻毒素对人类健康所构成的风险主要体现在以下几个特性的结合：

1、微囊藻毒素在环境中出现的可能性将越来越大。随着内陆湖泊水体富营养化现象的日趋严重，蓝藻爆发现象时有发生。水华蓝藻中常含有能产生微囊藻毒素的藻类，如：微囊藻、鱼腥藻、念珠藻等。微囊藻毒素虽然产生于藻类细胞内，但随着细胞的死亡和细胞膜破裂而被释放到水中。

2、微囊藻毒素的稳定性较好，有较好的热稳定性和在光照条件下的稳定性。Wannemacher(1989)在实验条件下证实，微囊藻毒素LR在300℃条件下仍然稳定。Harada等（1996a）在实验条件下模拟日本夏季蓝藻水华发生时湖水常见的pH（9-10）和温度（25-30℃）发现，微囊藻毒素LR很少分解；当温度为40℃时，微囊藻毒素LR的半衰期为3周（pH1）或10周（pH9）；模仿夏季自然条件下的降解速率比温度为40℃、pH9条件下稍慢，即半衰期可能大于10周。Tsuji等（1994）将溶解于蒸馏水中的微囊藻毒素及其几何异构体至于太阳光照射或日光灯下照射，经过26天，仍然有86%以上的微囊藻毒素LR的存在。

3、微囊藻毒素LR具有强烈的肝毒性。一旦摄入人体，能够专一性结合并强烈抑制肝细胞内蛋白磷酸酶的活性，从而引发肝脏的损伤。特别是其中的微囊藻毒素LR是最常见和毒性最强的一种藻毒素，世界卫生组织(WHO)和我国《生活饮用水卫生标准》GB5749—2006对饮水中的藻毒素含量的限制为1ug/L,并都为微囊藻毒素-LR的含量。

以上几种特性的组合构成了对人类健康的潜在风险。考虑到微囊藻毒素在环境中出现的可能性将越来越大，在环境监测领域开展对水体中，特别对集中式饮用水源地中微囊藻毒素LR含量的监测显得尤为重要。

目前水中微囊藻毒素的监测已有标准检测方法——GB/T20466-2006《水中微囊藻毒素的测定》，该标准中的液相色谱法是使用最为广泛的方法。该方法需要使用含有浓度已知的微囊藻毒素标准溶液制作工作曲线和了解微囊藻毒素在色谱柱上的保留时间以及其它一些光谱信息，从而达到定量、定性分析的目的。

对于微囊藻毒素的提取、纯化方法，1970年Murthy最先报道了对微囊藻毒素进行提取,他们利用透析、溶剂萃取和DEAE-SephadexA-25色谱柱进行毒素的提取,而直到1982年才获得足够的纯毒素进行结构分析。以后又出现许多不同的提纯方法,比较典型的方法是以蓝藻细胞为对象,经过提取、浓缩和分离等过程,获得微囊藻毒素纯品。对藻毒素提取的方法中，经常采用不同比例的甲醇溶液或5%的乙酸溶液对藻样进行浸泡，并配以搅拌和振荡,以及(超)声波降解的方法，但很少有明显的证据表明哪种提取方法是最好的。在浓缩方面，近年来，固相萃取成为藻毒素提取的重要方法，采用反相C18填料作为固体萃取相，采用甲醇为洗脱液或采用含0.1%三氟乙酸(TFA)的90%甲醇溶液为洗脱液。在分离方面，色谱技术被用来提纯大量的微囊藻毒素和微囊藻毒素变体,最常采用的有尺寸排阻色谱、离子交换色谱、薄层色谱、高效液相色谱等。制备微囊藻毒素的原料方面，常常以实验室分离培养产毒藻种为原料，但这种方式一方面提高了生产成本，另一方面由于原料的限制也无法进行大规模的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

A、用生物网捞取滇池爆发期的水华，再通过过滤筛过滤藻样；

B、对处理后的藻样进行反复冻融处理；

C、将经过B步骤处理后的藻样浸泡在乙酸溶液中，浸泡过程中，同时配以超声波仪，进一步破坏细胞壁，离心，取上清液；

D、上清液经活化后的固相萃取柱，以富集其中的微囊藻毒素；

E、富集结束后固相萃取柱清洗后，待干燥后，再洗脱微囊藻毒素；

F、将步骤E获得的洗脱液通过硅胶小柱，用甲醇洗脱硅胶小柱，从甲醇中吸附溶解于其中的微囊藻毒素。

G、洗脱液上旋转蒸发仪浓缩；

H、利用高效液相色谱，分离步骤G中的微囊藻毒素LR、RR。

I、提纯微囊藻毒素LR、RR。

优选的，所述生物网采用25号浮游生物网，孔径为63μm。

优选的，所述过滤筛采用孔径为230μm的60目筛和孔径为76μm的200目筛。

优选的，步骤C中乙酸采用质量分数为5%的乙酸溶液，乙酸溶液的体积为藻样连同其流出液的5倍体积。

优选的，展开液采用体积比为60%的三氯甲烷、30%的甲醇和10%的水。

优选的，所述步骤H中，流动相采用pH=3、0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液和甲醇。

优选的，流磷酸二氢钾缓冲溶液和甲醇的质量比为35%:65%。

优选的，流动相的流速为10mL/min。

本发明公开了一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法。该方法以滇池水华为原料，经处理制成主要含微囊藻的藻粉。藻粉经过提取、富集、分离、精制等步骤制备出纯化的微囊藻毒素LR、RR。本发明中的方法具有原料易获得、效率高、成本低、安全性高、纯度高、对环境污染小等特点。制出的成品经过适当的溶液溶解稀释后，可制备成适用于实验室水质监测所需微囊藻毒素标准溶液。该溶液经高效液相色谱分离（HPLC），二极管阵列检测器(DAD)多波段的检测分析，纯度≥95%。

附图说明

图1是微囊藻毒素的化学结构。

图2是制备型液相色谱分离藻毒素LR、RR色谱图。

图3是瑞士ALEXIS公司LR标样色谱图。

图4是美国BEACON公司LR标样色谱图。

图5是自制LR样品色谱图。

图6是瑞士ALEXIS公司RR标样色谱图。

图7是美国BEACON公司RR标样色谱图。

图8是自制RR样品色谱图。

图9是瑞士ALEXIS公司LR标样光谱图。

图10是美国BEACON公司LR标样光谱图。

图11是自制样LR光谱图。

图12是瑞士ALEXIS公司RR标样光谱图。

图13是美国BEACON公司RR标样光谱图。

图14是自制RR样品光谱图。

图15是瑞士ALEXIS公司LR标样质谱图。

图16是美国BEACON公司LR标样质谱图。

图17是自制LR样品质谱图。

图18是瑞士ALEXIS公司RR标样质谱图。

图19是美国BEACON公司RR标样质谱图。

图20是自制RR样品质谱图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1：

1、用25号浮游生物网（孔径63μm）从滇池捞取新鲜藻样，在实验室内用60目的筛(孔径：230μm)过滤藻样，除去较大群体和杂质；而后又用200目的筛(孔径：76μm)过滤，除去个体较小的藻，以提高藻样中微囊藻的优势度。

2、将处理后的藻样进行反复3次冻融，并置于-20℃低温冰箱中储存待用。

3、利用真空冻干机，对藻样进行脱水。称取约80克干藻粉浸泡在5L，5%的乙酸溶液中，加以超声波仪震荡，经1个小时的浸泡后，以转速5000转/分钟离心20分钟，取上清液。

4、上清液以每分钟10mL的速度通过经活化的C18固相萃取小柱，以富集其中的微囊藻毒素。小柱的用量取决于原料的量。一般一支规格为500mg的C18小柱可富集8-10克干藻粉浸泡而得的溶液。本次将约5L上清液平均分为10份，共使用了10支规格为500mg的C18小柱。

5、富集结束后每只C18小柱先用6mL20%的甲醇（80%水，体积比）清洗，以去除一部分杂质，待C18小柱干燥后，用6mL100%的甲醇洗脱微囊藻毒素。

6、将洗脱液等分为5份，每份以每分钟10mL的速度通过1支活化的硅胶柱。（活化方法：先后用6mL、6mL纯甲醇通过硅胶柱），然后用70%甲醇（30%水，体积比）将吸附在硅胶柱上微囊藻毒素洗脱下来，并置于50mL旋转蒸发瓶中。

7、将装于旋转蒸发平中的洗脱液利用旋转蒸发仪进行浓缩。浓缩倍数视液相色谱柱的承载力而定，在色谱柱不过载的情况下，小的样品体积，可减少进样次数和后续浓缩的工作量。本次浓缩使洗脱液体积减少至原来的15%。

8、利用制备型高效液相色谱，分离上步浓缩液中的微囊藻毒素LR、RR和杂质，每次进样量为5mL。色谱条件为：

为了收集到正确的组分，在收集之前，应利用由国外购买得到的微囊藻毒素LR、RR纯品确定保留时间，如图2所示，按照保留时间，分别收集含有微囊藻毒素LR、RR组分的液相色谱流出液。

9、将收集到的含有微囊藻毒素LR、RR组分的液相色谱流出液，分别用旋转蒸发仪进行浓缩，直至溶液中的甲醇浓度降至20%以下。分别将含有微囊藻毒素LR、RR组分的浓缩液以每分钟10mL的速度通过经活化的C18固相萃取小柱以富集其中的微囊藻毒素LR、RR。由于大部分杂质已被去，可以减少小柱的用量。本次共使用了6支小柱，两种毒素各用3支。富集完成后，每支小柱用6mL纯水去盐，用6mL纯甲醇洗脱微囊藻毒素LR、RR。

10、将上步骤获得到的含有微囊藻毒素LR、RR的甲醇溶液分别用氮吹仪进行浓缩，浓缩的程度以微囊藻毒素LR、RR不析出为准（当有白色物质出现即表明微囊藻毒素已经析出，此时可适当加入少许纯甲醇）。

11、将上步骤得到的微囊藻毒素LR、RR的甲醇溶液，用毛细管沾取，涂到薄层层析板距下端1.5cm处。在涂薄层层析板的过程中，需要注意不要将板子上的硅胶层划破，在反复涂抹时应等待板子上的甲醇溶液干燥后，再涂抹下一次。本次共使用了4块薄层层析板，每种毒素各2块。

12、配制组分为：体积比：三氯甲烷60%、甲醇30%、水10%的展开液。配制体积视层析缸容积而定。将展开液加入层析缸中，将薄层层析板被涂抹过的一端作为下端放入层析缸中。需要注意的是展开液在层析缸中的液面的高度应在1cm左右，切勿浸泡到薄层板上微囊藻毒素的位置。

13、当展开液上升到距离薄层层析板上端约1cm处，即可结束展开过程。将薄层层析板取出干燥后，置于紫外灯下观察，确定藻毒素所在位置，并用铅笔将该区域画出(LR和RR所在位置不同，一般情况RR在层析板中部、LR在层析板上部)。刮下并收集薄层层析板上藻毒素所在区域的硅胶。

14、在一个漏斗指管里（可用10mL移液管枪头代替），垫上一薄层石英棉，再垫上一薄层硅胶粉末，然后将上一步骤获得的硅胶粉末放入，再盖上一薄层硅胶。本次共制作了4套该装置，两种毒素各使用2套。配制组分为：80%甲醇、20%pH=3、0.05moL/L磷酸二氢钾缓冲溶液50mL作为提取液。将10mL提取液从漏斗指管上部加入，自然滤过硅胶，并收集滤出液。需要注意的是，若硅胶粉末数量过多，可能会造成提取液流通不畅，如硅胶数量过少，可能会造成提取液流速过快，降低提取效率。

15、合并上述步骤获得的含同一种毒素的提取液，用氮吹仪进行浓缩，去除其中大部分的甲醇，或加入适量的水使甲醇的比例低于5%。分别将含有微囊藻毒素LR、RR的提取液以10mL/min的流速经过活化的C18小柱，用20%的甲醇清洗小柱，去除磷酸和硅胶。再用80%的甲醇将微囊藻毒素LR、RR从小柱下洗脱下来，并收集该洗脱液。本次共用了2支C18小柱，每种毒素各1支。

16、用氮吹仪将获得的洗脱液吹干，即可获得干燥的微囊藻毒素LR、RR样品。本次共制得，微囊藻毒素LR约4毫克，微囊藻毒素RR约12毫克。

17、得率的计算：按照与制备方法相同的方法，抽取原料中的部分藻样进行测定，每克藻粉生产的藻毒素LR的量约为0.07mg/g；RR的量约为0.23mg/g。本次实验共使用了80克藻粉，共得微囊藻毒素LR约4毫克、微囊藻毒素RR约11毫克，按照重量计算，产率为0.005%——0.014%。

18、①LR纯度计算：在多个波长下，对微囊藻毒素LR样品按照GB/T20466-2006《水中微囊藻毒素的测定》方法进行测定，测量了主峰面积与杂质峰面积，按照面积的比例，计算了样品的纯度，如表1所示：

表1

通过上表1可以看出，微囊藻毒素LR和杂质在238nm波长都有最大响应，因此选取238nm波长作为检测波长。以238nm为检测波长，微囊藻毒素LR峰面积占总面积的比例作为自制样纯度的结果，得到本次自制样品纯度为：95.60%。

②RR纯度计算：在多个波长下，对微囊藻毒素RR样品按照GB/T20466-2006《水中微囊藻毒素的测定》方法进行测定，测量了主峰面积与杂质峰面积，按照面积的比例，计算了样品的纯度，如表2所示：

表2

通过表2可以看出，微囊藻毒素RR和杂质在238nm波长都有最大响应，因此选取238nm波长作为检测波长。以238nm为检测波长，微囊藻毒素RR峰面积占总面积的比例作为自制样纯度的结果，得到本次自制样品纯度为：97.50%。

19、定性试验：通过比较自制样品和从国外2家不同公司购得的微囊藻毒素LR、RR在相同色谱条件下在色谱柱上的保留时间、光谱图和质谱图，对自制产物种类进行了鉴定。鉴定表明几种物质间在保留时间、光谱图和质谱图是相符的，说明自制样品物质种类正确。

用以下方法三种方法对本发明中的样品和两份由不同国家生产的纯品进行比对，以鉴定自制样种类正确。

保留时间

LR保留时间对比

按照国标方法GB/T20466-2006《水中微囊藻毒素的测定》，用高效液相色谱对2份国外标样和自制样品进行分析，获得两者在色谱柱上的保留时间。结果如图3-5所示。

由瑞士ALEXIS公司生产的标样保留时间为：11.031分钟；美国BEACON公司生产的标样保留时间为：11.051分钟；自制样的保留时间为：11.008分钟。保留时间基本一致。

RR保留时间对比，如6-8所示，可知保留时间基本一致。

光谱分析

LR光谱图对比

利用高效液相色谱配合DAD检测器，对2份国外标样和自制标样进行200-400nm波长扫描，获得的光谱图如图9-11所示，可以看出，三者的光谱图的形状基本一致，最大吸收波长均为238nm。

RR光谱图对比图如图12-14所示，可以看出，三者的光谱图的形状基本一致。

质谱分析

利用高效液相色谱质谱联用仪，按以下分析条件对由2家国外生产的标样和自制样分别进行了质量数扫描，通过对比质谱图，对自制样进行定性分析，如表3所示。

表3

LR质谱图对比如图15-17所示，可以看出，三者的质谱图的形状基本一致。

RR质谱图对比如图18-20所示，可以看出，三者的质谱图的形状基本一致。

结论

通过液相色谱联合二极管阵列检测器和质谱仪对两份国外标样和自制样进行了分析，获得可三者的保留时间、光谱图和质谱图。通过比对，三者在这些方面高度一致，能够证明本发明中所制备的样品为微囊藻毒素LR和RR。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种以滇池蓝藻水华为原料提取纯化微囊藻毒素LR、RR的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

步骤1、用25号浮游生物网从滇池捞取新鲜藻样，在实验室内用60目的筛过滤藻样，除去较大群体和杂质；而后又用200目的筛过滤，除去个体较小的藻，以提高藻样中微囊藻的优势度；

步骤2、将处理后的藻样进行反复3次冻融，并置于-20℃低温冰箱中储存待用；

步骤3、利用真空冻干机，对藻样进行脱水，称取80克干藻粉浸泡在5L，质量浓度为5%的乙酸溶液中，加以超声波仪震荡，经1个小时的浸泡后，以转速5000转/分钟离心20分钟，取上清液；

步骤4、将上清液以每分钟10mL的速度通过经活化的C18固相萃取小柱，以富集其中的微囊藻毒素；

步骤5、富集结束后每只C18小柱先用6mL体积浓度20%的甲醇清洗，以去除一部分杂质，待C18小柱干燥后，用6mL100%的甲醇洗脱微囊藻毒素；

步骤6、将洗脱液等分为5份，每份以每分钟10mL的速度通过1支活化的硅胶柱；然后用体积浓度70%甲醇将吸附在硅胶柱上微囊藻毒素洗脱下来，并置于50mL旋转蒸发瓶中；

步骤7、将装于旋转蒸发瓶中的洗脱液利用旋转蒸发仪进行浓缩；浓缩使洗脱液体积减少至原来的15%；

步骤8、利用制备型高效液相色谱，分离上步浓缩液中的微囊藻毒素LR、RR和杂质，每次进样量为5mL；

步骤9、将收集到的含有微囊藻毒素LR、RR组分的液相色谱流出液，分别用旋转蒸发仪进行浓缩，直至溶液中的甲醇浓度降至20%以下；分别将含有微囊藻毒素LR、RR组分的浓缩液以每分钟10mL的速度通过经活化的C18固相萃取小柱以富集其中的微囊藻毒素LR、RR；

步骤10、将上步骤获得到的含有微囊藻毒素LR、RR的甲醇溶液分别用氮吹仪进行浓缩，浓缩的程度以微囊藻毒素LR、RR不析出为准；

步骤11、将上步骤得到的微囊藻毒素LR、RR的甲醇溶液，用毛细管沾取，涂到薄层层析板距下端1.5cm处；在涂薄层层析板的过程中，需要注意不要将板子上的硅胶层划破，反复涂抹；

步骤12、配制组分为：体积比：三氯甲烷60%、甲醇30%、水10%的展开液；将展开液加入层析缸中，将薄层层析板被涂抹过的一端作为下端放入层析缸中；

步骤13、当展开液上升到距离薄层层析板上端1cm处，即可结束展开过程；将薄层层析板取出干燥后，置于紫外灯下观察，确定藻毒素所在位置，并用铅笔将该区域画出，刮下并收集薄层层析板上藻毒素所在区域的硅胶；

步骤14、在一个漏斗指管里，垫上一薄层石英棉，再垫上一薄层硅胶粉末，然后将上一步骤获得的硅胶粉末放入，再盖上一薄层硅胶；配制组分为：体积浓度80%甲醇、20%pH=3、0.05moL/L磷酸二氢钾缓冲溶液50mL作为提取液；将10mL提取液从漏斗指管上部加入，自然滤过硅胶，并收集滤出液；

步骤15、合并上述步骤获得的含同一种毒素的提取液，用氮吹仪进行浓缩，去除其中大部分的甲醇，或加入适量的水使甲醇的比例低于5%，分别将含有微囊藻毒素LR、RR的提取液以10mL/min的流速经过活化的C18小柱，用体积浓度20%的甲醇清洗小柱，去除磷酸和硅胶；再用体积浓度80%的甲醇将微囊藻毒素LR、RR从小柱下洗脱下来，并收集该洗脱液；

步骤16、用氮吹仪将获得的洗脱液吹干，即可获得干燥的微囊藻毒素LR、RR样品；

步骤17、产率的计算：按照与制备方法相同的方法，抽取原料中的部分藻样进行测定；

步骤18、计算纯度。