CN101955461A - 一种Hsp90抑制剂Xbj-B11及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的Hsp90抑制剂及其制备方法与应用。该Hsp90抑制剂是2-(4-乙酰氧环己氨基)-4-(1-(3，6，6-三甲基-4-氧-4，5，6，7-四氢吲唑))苯甲酰胺。这种Hsp90抑制剂能有效抑制白血病、宫颈癌、乳腺癌、人喉上皮癌和恶性黑色素瘤等癌细胞的增殖，并能有效抑制单纯疱疹病毒的活性，对正常细胞的最大无毒浓度较大，仅对癌细胞具有特异性的抑制作用。

Description

一种Hsp90抑制剂Xbj-B11及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新型的Hsp90抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

热休克蛋白(Heat shock protein，Hsp)是细胞在一些应激条件，如热休克、葡萄糖饥饿或受到病原微生物感染时产生的一种蛋白质，在正常状态的细胞中也广泛存在。Hsp是生物在进化中表达的一组高度保守的蛋白质家族，它们作为分子伴侣参与细胞对多种刺激(包括冷、热、缺氧、重金属离子、及病毒感染等)的保护作用。Hsp主要参与细胞内新生肽链的折叠及转运，以及识别变性蛋白质，从而发挥调节细胞生长分化、生存的功能。Hsp不仅参与应激保护、信号传导、免疫应答、发育分化等重要生理过程，还与许多疾病，例如感染、自身免疫病、动脉粥样硬化及肿瘤等的形成有关。

根据分子量大小可分为Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小Hsp五大家族。Hsp90是细胞内最活跃的分子伴侣之一，广泛参与细胞的信号转导、激素应答及转录调控过程，其主要功能是维持细胞蛋白质稳定，提高细胞对应激的耐受性，增强抗氧化作用，使细胞维持正常的生理功能。Hsp90本身并不参与靶蛋白的组成。Hsp90是胞质蛋白，在哺乳动物细胞中，Hsp90家族由3个成员组成：胞质伴侣Hsp90-a(可诱导型/主要型)和Hsp90-b(组成型/次要型)，同功异质体内质网伴侣GRP94(葡萄糖相关蛋白94)，线粒体同族体Hsp75/TRAP1(肿瘤坏死因子受体相关蛋白1)。在发生应激反应时，Hsp90可以和那些由于环境刺激而使自身构象发生改变的蛋白相互作用，保证蛋白进行适当的折叠并防止其非特异性聚集，从而维持细胞的正常活性。蛋白质在距膜转运前必须解折叠，跨膜后又要重新折叠以形成成熟型，Hsp90作为分子伴侣具有解折叠酶功能，能识别蛋白质解折叠后局部暴露的疏水面，并与之结合，防止相互作用产生凝聚，直至跨膜运送。肿瘤细胞中所存在的异常活化与突变增殖信号分子需与Hsp90结合稳定其结构，以维持肿瘤细胞的生长优势特性。Hsp90在肿瘤细胞中主要处于活化态(activated state)，在正常细胞中则主要处于静默态(latent state)。处于活化态时，Hsp90与受体蛋白及辅分子伴侣Hsp70、Hsp40、Hop(Hsp70organizing protein)、p23、CDC37等形成复合物，维持受体蛋白处于成熟有功能的构象，保护受体蛋白不被蛋白酶体(proteasome)所降解。

正常状态下Hsp90表达量较低，且受细胞周期调控，主要存在于胞质中，应激时Hsp90迅速进入胞核，其诱导合成在转录和翻译两个水平上调，能提高细胞抗应激能力。但在肿瘤细胞中Hsp90呈现出持续的高诱导表达，这种高表达不需要热刺激，突变或异常蛋白质也可以刺激其合成，这也是肿瘤细胞对Hsp90抑制剂特别敏感的原因之一。

1999年，Klein首先提出了肿瘤多点攻击(Multi-enzyme-targeted)理论。该理论的核心是利用某一靶位实现对肿瘤信号通路网络的多点阻断，从而彻底摧毁肿瘤赖以生存的整个信号通路网络。因此，寻找有效的靶点是应用于肿瘤治疗的关键。以分子伴侣为基础的抑制剂并不与激酶本身直接作用，而是抑制维持激酶活性构象的相关分子伴侣，通过泛素-蛋白酶体途径导致大量激酶被蛋白酶体降解，使其介导的信号转导通路失活无法收到来自上游的信号。与传统激酶直接抑制剂相比，抑制Hsp90单一靶点能够同时产生多路径抗肿瘤效应的特点，既能单一用药又能减少耐药性发生，使Hsp90成为令人兴奋的肿瘤治疗分子靶点。

另外Hsp90亦与病毒感染有密切的关系，目前已证实，病毒侵入宿主后诱导产生的HSP可与病毒蛋白结合形成复合物，这一过程可能与病毒复制相关。多种类型的病毒感染诱导宿主细胞产生的HSP，可在病毒复制的多个环节与病毒蛋白结合，形成HSP-病毒肽复合物，协助病毒蛋白正确折叠、跨膜转运以及病毒装配、成熟等，因此对病毒的复制是有利的。

有报道称，单纯疱疹病毒可诱导70Kda的热体克蛋白Hsp70，需要早期病毒蛋白的合成但不需要病毒DNA的复制。Hsp70在非胁迫的臼齿类的细胞中很少表达，但HSV的感染可诱导它的表达，在HSV-1和HSV-2感染4小时内就有水平的升高，在感染细胞中有Hsp70的合成和蓄积的增加，用UV辐射过的HSV-1丧失了诱导Hsp70的活性，对病毒DNA的抑制并不影响Hsp70的诱导，但感染后2小时以内的蛋白合成是诱导Hsp70所必需的。

单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科，是最早发现的人类疱疹病毒，分为I型(HSV-1)与II型(HSV-2)两个血清型，其感染十分普遍，主要侵犯皮肤、粘膜和神经组织，引起人和许多动物感染。HSV-1多感染口、唇、眼的皮肤与粘膜，以及中枢神经系统，偶见于生殖器感染；HSV-2多与生殖器感染和新生儿感染相关。

目前，由于缺乏有效的病毒疫苗，药物治疗成为治疗HSV感染的主要途径。临床常用的治疗药物主要是无环鸟苷等核苷类，其作用靶点是病毒DNA聚合酶，进而影响病毒的复制。目前广泛使用的是以阿昔洛韦(Acyclovir，ACV)为代表的无环鸟苷类似物，包括阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦、泛昔洛韦以及更昔洛韦。此外还有以焦磷酸钠为代表的非核苷类似物。但是部分核苷类似物如碘脱氧尿苷、三氟胸苷、阿糖腺苷及更昔洛韦等具有诱变性，安全性低。而且在上世纪80年代ACV耐药株就有出现，且在骨髓移植病人和艾滋病人群体中更易出现耐药。所以有必要寻找新作用机制的抗病毒药物，而由于Hsp90在病毒感染中的重要作用，也成为潜在的抗病毒靶点。

第一个Hsp90抑制剂药物格尔德霉素(geldanamycin，GA)是作为抗真菌药筛选发现的苯醌类药物。GA是一种特异的Hsp90抑制剂，在结构上主要是由一个苯醌部分和一个平面性大环安莎桥相连。研究揭示其抗肿瘤能力依赖于致瘤性蛋白激酶在蛋白酶体中的降解，但是GA对肾脏、肝脏毒性较大，可能与其脱靶效应有关。美国国家癌症研究所筛选毒性较低的衍生物，发现将GA一个侧链进行置换的17-烯丙氨基格尔德霉素(17-AAG)，17-AAG具有GA全部特征，且毒性更低，保持了Hsp90抑制作用和抗肿瘤活性。但是17-AAG水溶性较差，不能口服，又继而研发出GA的新的衍生物17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin(17-DMAG)，该化合物表现出良好的水溶性和口服生物利用度，针对实体瘤和恶性血液病已进入II期/III期临床试验。

根赤壳菌素(Radicicol)是从单孢霉Bonorden中分离出来的大环类抗生素，具有类似GA逆转恶性表型的潜能，在Hsp90受体蛋白降解中起作用。根赤壳菌素可以逆转转染了v-src和v-Ha-Ras的纤维细胞的恶化程度。Radicicol结合于Hsp90的N-末端区域，在体外有较好的抗肿瘤活性，但其在体内没有抗肿瘤能力，这主要是由于它的化学结构不稳定，进入体内后易降解。近年来研究表明新生霉素(Novobiocin)能显著减少细胞内p185erb2、p60v-src、Raf-1和突变型p53的水平，并且点突变实验证明新生霉素是Hsp90的C-端抑制剂。Neckers等研究表明香豆霉素类的3种化合物(新生霉素、氯新生霉素、香豆霉素A1)均显著减少细胞内P185erb2、p60v-src、缺氧诱导因子1和突变型P53的水平。新生霉素是已在临床使用、毒性较小的香豆素类抗生素，有较好的药代动力学特征。新生霉素是Hsp90的C-端抑制剂，对多种癌细胞有抑制作用，并能与抗癌药联合应用，逆转抗癌药的耐药性，但新生霉素作为Hsp90的抑制剂所用的浓度高达700μM，这也限制了其做为体内抗肿瘤药物的进一步开发。

除上述几种Hsp90抑制剂外，近年来又相继合成、筛选出一些Hsp90抑制剂。PU3，一种嘌呤骨架Hsp90抑制剂(purine-scaffold inhibitors)，是根据X-射线晶体衍射的结果设计得到的小分子化合物，PU3的作用位点与GA一致，作用于Hsp90的N端ATP/ADP结合位点，在抑制Hsp90受体蛋白降解和抗肿瘤能力方面也类似GA。修饰和改善PU3形成其衍生物，后者与Hsp90 N-末端结合，亲和力是PU3的30倍，但活性没有17-AAG那么强。然而，该衍生物不表现特异的细胞间累积，而这种特性对于更疏水的GA衍生物来说是典型的。IPI-504(17-AAG对苯二酚)，主要针对多发性骨髓瘤的治疗，目前已进入临床I期实验。该化合物具有高度水溶性，在体内可以转变为17-AAG的活性形式，其抗癌机制现在还在研究中。NVP-AUY922是异恶唑衍生物，也属于小分子Hsp90抑制剂，对于ER和ERBB2-阳性的乳腺癌患者有潜在的治疗作用。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种新型的Hsp90抑制剂。

本发明的另一目的在于提供上述Hsp90抑制剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述Hsp90抑制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种Hsp90抑制剂，是2-(4-乙酰氧环己氨基)-4-(1-(3，6，6-三甲基-4-氧-4，5，6，7-四氢吲唑))苯甲酰胺(2-(4-acetyloxycyclohexylamino)-4-(3，6，6-trimethyl-4-oxo-4，5，6，7-tetrahydro-1H-indazol-1-yl)benzamide)，代号为Xbj-B11，其结构式如式I所示。

上述Hsp90抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

将式II所示化合物与乙酸以5mol∶1L的比例混合，加入N，N′-二环己基碳二酰亚胺(DCC)，20～30℃下搅拌反应10～15h；反应结束后滤去不溶物，将滤液进行萃取，把萃取得到的有机层洗涤、干燥、减压除去溶剂，再将产物纯化，得到式I所示的Hsp90抑制剂。

上述Hsp90抑制剂可用作制备抗肿瘤或者抗病毒的药物。

所述肿瘤为白血病、宫颈癌、乳腺癌、人喉上皮癌或者恶性黑色素瘤。

所述病毒为单纯疱疹病毒。

Xbj-B11以苯甲酰胺为基本骨架，侧链配以不同取代基团，这种新型结构不同于以往公布的任何一种Hsp90抑制剂，X衍射证实其可以竞争性地与Hsp90上ATP位点结合，能够有效抑制蛋白质和嘌呤结合。实验表明Xbj-B11在体外可以抑制多种实体瘤和白血病细胞的增殖并诱导其凋亡。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)Xbj-B11能有效抑制白血病、宫颈癌、乳腺癌、人喉上皮癌和恶性黑色素瘤等癌细胞的增殖，并能有效抑制单纯疱疹病毒的活性。

(2)Xbj-B11对正常细胞的最大无毒浓度较大，仅对癌细胞具有特异性的抑制作用。

附图说明

图1是药物对正常细胞(Vero)的毒性测定结果图，其中，A为Xbj-11，B为抗肿瘤阳性药物17-AAG。

图2是HSV-1、HSV-2所致的细胞病变图(100×)，其中，A.是正常细胞，B是HSV-1所致的细胞病变，C是HSV-2所致的细胞病变。

图3是药物对Vero细胞的毒性和抗HSV活性测定结果图，其中，B图为药物对细胞的毒性测定结果，b图为药物抗病毒的空斑统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1Hsp90抑制剂Xbj-B11的制备

(1)合成式II所示的化合物：式II所示化合物的合成参见中国专利ZL200610087495.1；

(2)合成Hsp90抑制剂：将式II所示化合物(0.10g，0.25mmol)置于25mL茄型瓶中，依次加入冰醋酸0.05mL，DCC(57mg，0.28mmol)，DMAP(15mg，0.13mmol)和1mL DMF，25℃搅拌反应12h。反应结束后滤去不溶物，滤液用100mL二氯甲烷萃取产物，有机层用饱和食盐水洗涤、无水MgSO₄干燥。减压除去溶剂，得到的残余物用硅胶柱层析纯化(二氯甲烷∶甲醇(是否为体积比？)＝70∶1)，得白色固体产物1(83mg，产率73％)。

产物的结构表征数据如下：

1H NMR(CDCl3，400MHz)δ：1.25(s，6H)，1.41-1.58(m，4H)，2.05(s，3H)，2.05-2.16(m，4H)，2.41(s，2H)，2.55(s，3H)，2.82(s，2H)，3.41(bs，1H)，4.78(m，1H)，6.61(d，J＝8.3Hz，1H)，6.78(s，1H)，7.48(d，J＝8.4Hz，1H)，8.15(d，J＝7.1Hz，1H).证明所得产物结构如式I所示。

实施例2Xbj-B11对5种肿瘤细胞株的半数致死剂量

在实施例中，阳性对照为17-AAG(购自美国Alexis Biochemicals公司)，所用细胞系K562、Hela、A375、Mcf-7等均购自美国ATCC公司。

(1)将Xbj-B11用H₂O溶解配置成2mM的母液，储存在4℃。

(2)取对数生长期的人宫颈癌细胞(Hela)、人恶性黑色素瘤细胞(A375)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)，用含10％胎牛血清的DMEM培养基(购自美国GIBCO BRL公司)调整细胞浓度为2×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中，100μL/孔，细胞过夜培养，使之贴壁，弃培养液，每孔加入100μL含不同Xbj-B11样品浓度(分别为20μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM、0.05μM)的培养基，每个浓度设4个复孔，实验设实验组、阳性对照组、溶剂对照组和空白组。96孔板置于37℃，5％CO2培养箱培养48h。

取对数生长期的人慢性髓细胞白血病细胞(K562)，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(购自美国GIBCO BRL公司)调整细胞浓度为4×10⁵个/mL的单细胞悬液，每孔加入50μL单细胞悬液和50μL含不同Xbj-B11样品浓度(分别为40μM、20μM、10μM、2μM、0.2μM、0.1μM)的培养基，每个浓度设4个复孔，实验设实验组、溶剂对照组和空白组。96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱培养48h。

(3)参考Mosmann建立的MTT法，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h，小心吸取弃各孔溶液，再每孔加入DMSO100mL，避光与摇床上摇晃15min。酶标读数仪比色(波长570nm，参考波长630nm)，测吸光度A值。计算药物的半数毒性浓度(IC50)。按下列公式计算生长抑制率：生长抑制率(％)＝(1-实验组A570/630/溶剂对照组A570/630)×100，通过改良寇式法计算药物对细胞的半数抑制浓度IC50值，改良寇式法计算公式为：lgIC50＝Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]。

[Xm：lg最大剂量；I：lg(最大剂量/相临剂量)；P：阳性反应率之和；Pm：最大阳性反应率；Pn：最小阳性反应率]

药物对细胞株的半数抑制浓度(IC50)结果见表1。

表1Xbj-B11对各肿瘤细胞株的IC50值

由表1的结果可见Xbj-B11对人宫颈癌细胞(Hela)、人恶性黑色素瘤细胞(A375)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)和人慢性髓细胞白血病细胞(K562)都有明显的抑制增殖作用，且效果优于阳性药物17-AAG。

实施例3Xbj-B11对正常细胞(非洲绿猴肾细胞Vero)的体外毒性试验

取对数生长期的Vero细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养基(购自美国GIBCO BRL公司)调整细胞浓度为2×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中，100μL/孔，细胞过夜培养，弃培养液，每孔加入100μL分别含50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.57μM、0.63μM的Xbj-B11继续培养Vero细胞48h后，采用美国Lonza公司的试剂盒(Vialight HS kit and Toxilight bioassay kit)测定Vero胞内ATP水平和培养液上清中AK的释放量，检测药物在48h时内对Vero细胞的最大无毒浓度，试验以阳性药17-AAG作对照(10μM起始，倍比稀释6个浓度)，结果如图1所示。

图1结果显示，Xbj-B11对正常细胞(非洲绿猴肾细胞Vero)的最大无毒浓度是6.25μM，远远不如对癌细胞敏感；与阳性药物17-AAG相比毒性较小(17-AAG的无毒浓度为0.63μM)，说明药物体外毒性很低。由此可见：Xbj-B11对癌细胞具有特异性的抑制作用。

实施例4：CPE法观察Xbj-B11抗单纯疱疹病毒活性

本实施例正常细胞采用Vero细胞系(ATCC CCL81，购自美国ATCC公司)。单纯疱疹病毒包括：单纯疱疹病毒I型F株(HSV-1F，ATCC VR-733)，单纯疱疹病毒II型333株(HSV-2333)。

将不同浓度的Xbj-B11(12.5μM起始，倍比稀释6个浓度)和阳性药物ACV(10μM起始，倍比稀释6个浓度)分别与HSV-1或HSV-2病毒稀释液(100TCID50)各50μL混合后直接加到单层Vero细胞上，37℃，5％CO₂培养箱中培养48h，光镜下观察细胞病变效应(CPE)。

显微镜下观察，正常细胞呈梭形，细胞膜界限清晰，胞浆透明度好，细胞形态完整(如图2A)；HSV-1所致的CPE特征为细胞肿胀、圆缩、融合、脱落与碎裂(如图2B)，HSV-2形成的多核巨细胞或细胞融合更为明显(如图2C)。

CPE统计结果如表2和表3所示：化合物Xbj-B11具有一定的抗单纯疱疹病毒I型和抗单纯疱疹病毒型II型的作用，在0.78μM时既可以完成抑制HSV-1引起的细胞病变，也能够对HSV-2引起的细胞病变起到一定的抑制作用，但总体抑制效果不及阳性药物ACV。CPE统计结果见表2、表3。

表2Xbj-B11对HSV-1的抑制作用

注：CPE等级：0～25％为+，26％～50％为++，51％～75％为+++，76％～100％为++++。

表3Xbj-B11对HSV-2的抑制作用

注：CPE等级：0～25％为+，26％～50％为++，51％～75％为+++，76％～100％为++++。

实施例5：空斑减数测定(PRA)Xbj-B11抗单纯疱疹病毒的综合作用

本实施例正常细胞采用Vero细胞系(ATCC CCL81，购自美国ATCC公司)。单纯疱疹病毒包括：单纯疱疹病毒I型F株(HSV-1F，ATCC VR-733)，单纯疱疹病毒II型333株(HSV-2333)。

Vero细胞(ATCC CCL81，购自美国ATCC公司)在24孔板上培养至单层，弃去培养液，加入病毒稀释液(HSV-1和HSV-2)(50PFU/孔)与5μM、2.5μM、1.25μM、0.63μM、0.32μM的Xbj-B11各100μL，37℃、5％CO₂培养箱培养2h，吸弃病毒稀释液，加入含0.5％羧甲基纤维素细胞维持液(覆盖液)1mL，每个浓度设3个复孔，设病毒对照组和正常细胞对照组，观察72h后，10％甲醛固定30min，1％结晶紫染色30min，清水漂洗、晾干，参照Nitta的方法空斑计数，计算空斑抑制率。

以药物浓度的对数值为横坐标，以空斑抑制率为纵坐标作图，根据空斑抑制率结果做出病毒对药物的敏感性曲线，计算药物的半数抑制浓度(IC50)。空斑抑制率＝(病毒对照组空斑数-药物处理组空斑数)/(病毒对照组空斑数)×100％。

药物的毒性和抗HSV活性测定结果见图3，药物抗单纯疱疹病毒试验结果统计如表4所示。从结果可以看出，药物Xbj-B11具有一定的抗HSV的效果，但是效果不及阳性药物ACV。

表4Xbj-B11抗HSV活性及治疗指数(

n＝3)

TC₅₀：半数致死浓度；TC₀：最大无毒浓度；IC₅₀：50％抑制病变的浓度；TI：治疗指数(TC₅₀/IC₅₀)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种Hsp90抑制剂，其特征在于：所述Hsp90抑制剂是2-(4-乙酰氧环己氨基)-4-(1-(3，6，6-三甲基-4-氧-4，5，6，7-四氢吲唑))苯甲酰胺，其结构式如式I所示：

2.权利要求1所述一种Hsp90抑制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

将式II所示化合物与乙酸以5mol∶1L的比例混合，加入N，N′-二环己基碳二酰亚胺，20～30℃下搅拌反应10～15h；反应结束后滤去不溶物，将滤液进行萃取，把萃取得到的有机层洗涤、干燥、减压除去溶剂，再将产物纯化，得到式I所示的Hsp90抑制剂；

3.权利要求1所述一种Hsp90抑制剂的应用，其特征在于：所述Hsp90抑制剂用于制备抗肿瘤或抗病毒的药物。

4.根据权利要求3所述一种Hsp90抑制剂的应用，其特征在于：所述肿瘤为白血病、宫颈癌、乳腺癌、人喉上皮癌或者恶性黑色素瘤。

5.根据权利要求3所述一种Hsp90抑制剂的应用，其特征在于：所述病毒为单纯疱疹病毒。

Images