CN101953829A

CN101953829A - 欧芹素乙在制备抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN101953829A
Application number: CN 201010243897
Authority: CN
Inventors: 张黎; 刘厚佳; 芮耀诚; 李铁军; 马建丽; 辛海量; 霍炎; 王晓黎; 高申; 王卓; 卫立辛; 韩志鹏; 陶双芬; 李蓉; 杨阳
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-08-03
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是香豆素类化合物欧芹素乙用于制备抗肿瘤药物的新用途。经体内、外药理实验表明，香豆素类化合物欧芹素乙具有确切的抗肿瘤活性，因此可用于制备抗肿瘤药物。欧芹素乙制备方便、价格低廉、安全性高，具有良好的开发利用前景。本发明为欧芹素乙提供了一种新用途，也为防治肿瘤提供了一种新的药物来源。

Description

欧芹素乙在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是香豆素类化合物欧芹素乙在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

香豆素类化合物在结构上可以看成是顺式邻羟基桂皮酸脱水而形成的内酯类化合物。自1812年Vauquelin从植物Daphnealpina中首次得到香豆素类化合物瑞香苷(daphnin)，至今已得到数百种香豆素类化合物。此类化合物广泛存在于植物界，特别是在伞形科、芸香科、菊科、豆科、茄科等植物中分布广泛。如蛇床子、独活、白芷、枳壳、前胡、秦皮、茵陈、补骨脂、续随子等中药均含有这类成分。[罗雄明，漆淑华，尹浩，李敏一，高程海，张偲。直线型呋喃香豆素类化合物及其药理活性的研究进展。天然产物研究与开发。2009；21(B05)：230-235。]

欧芹素乙(别名欧前胡素，Imperatorin)属于香豆素类化合物，其化学结构式如下：

欧芹素乙可以从中药欧前胡(Peucedanum ostruthium)和白芷(Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan)根部中分离获得[中华人民共和国卫生部药典委员会。中华人民共和国药典一部。2010：97-98]。香豆素类化合物欧芹素乙不仅可以从植物中提取获得，也可采用香豆素类化合物前体进行半合成的方法获得。已有研究报道其具有较好的抗炎、抑制血小板聚集及保护内皮细胞的作用[1.刘厚佳，李铁军，邱彦，芮耀诚，卫立辛，吴孟超，张黎。欧芹素乙对人脐静脉内皮细胞的保护作用及对血管内皮生长因子表达的影响。药学实践杂志。2009；27(2)：94-98。2.嵇扬，曾国钱。欧芹素乙和异欧芹素乙对小鼠腹腔巨噬细胞体外释放肿瘤坏死因子的影响。第二军医大学学报。1994；15(6)：511-513。3.李铁军，徐添颖，芮耀诚，邱彦，张黎，杨鹏远。欧芹素乙对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。第二军医大学学报。2004；25(4)：431-433。]。尚未见有关欧芹素乙具有抗肿瘤作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供香豆素类化合物欧芹素乙在制备抗肿瘤药物中的应用。

经体内、外实验表明，香豆素类化合物欧芹素乙具有确切的抗肿瘤活性，因此可用于制备抗肿瘤药物。

欧芹素乙制备方便、价格低廉、安全性高，具有良好的开发利用前景。本发明为欧芹素乙提供了一种新用途，也为防治肿瘤提供了一种新的药物来源。

附图说明

图1为.欧芹素乙对不同肿瘤细胞株的IC₅₀值图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1欧芹素乙的制备

白芷生药饮片(上海杨浦中药饮片厂)粉碎后过120目筛，取1kg粉末，用5L 95％乙醇热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩，回收乙醇，趁热分离水层。水层放置凝固后，用100ml 40℃无水乙醇溶解，放置析晶。所得结晶再用10ml 40℃95％乙醇重结晶3次，用大孔吸附树脂纯化，得欧芹素乙9.6mg。经HPLC检测，欧芹素乙纯度为93.2％。

实施例2欧芹素乙对肿瘤细胞生长的抑制作用(MTT法)

选择8种肿瘤细胞株(由上海市东方肝胆外科医院肿瘤免疫与基因治疗研究中心提供)对欧芹素乙的细胞毒活性进行测试，分别是小鼠白血病细胞株P388、人慢性髓系白血病细胞株K562、人前列腺癌细胞株PC-3、人结肠癌细胞株HCT116、人胰腺癌细胞株SW1990、人乳腺癌细胞株MDA-MB231、人宫颈癌细胞株HeLa和人胃癌细胞株SGC-7901。

欧芹素乙由上海尚谊化工科技有限公司提供，纯度为98％。

实验分组：

阴性对照组，加细胞不加药物，加等体积的DMEM溶液；

欧芹素乙不同浓度组(简称药物组)：细胞+不同浓度的欧芹素乙溶液，所说欧芹素乙溶液是用DMEM培养液配成浓度分别为0.1，1，10，100，1000mg/L的溶液。

取对数生长期的肿瘤细胞株，分别用体积分数为10％新生牛血清(NBS)的DMEM培养液制成单细胞悬液，细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，每孔0.2mL，在体积分数5％CO₂，37℃，饱和湿度下培养24小时。第二天将96孔板置于离心机离心5min，去上清，药物组按上述分组每孔加入0.2mL相应浓度的欧芹素乙溶液，每组设6个复孔，阴性对照组每孔加入0.2mL DMEM溶液。在体积分数5％CO₂，37℃，饱和湿度下培养48h，实验终止前4h加入20μL浓度为5mg/mL的MTT，在37℃继续培养4h，将96孔板置于离心机离心5min，去上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，震荡混匀，使沉淀充分溶解，10min后于酶标仪上测定吸光度A值，测定波长为490nm，按下列公式计算抑制率和半数抑制浓度(IC₅₀)。抑制率(％)＝(阴性对照组A值-药物组A值)/阴性对照组A值×100％；半数抑制浓度(IC₅₀)采用对数机率单位法，以直线回归方程计算肿瘤细胞生长抑制率为50％的药物浓度。结果见图1。

由图1可见，欧芹素乙可以抑制8种细胞株的增殖，其中对白血病细胞株P388和K562的抑制作用最显著。

实施例3欧芹素乙对动物皮下移植瘤生长的抑制作用

BALB/c裸鼠，雌雄各半，体重18±2g，由第二军医大学动物中心提供。动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。

环磷酰胺粉针剂(CTX)系上海华联制药有限公司生产；

细胞裂解液购于BD Pharm Lyse^TM；

欧芹素乙由实施例1制备(下同)。用生理盐水分别配成浓度为5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL的欧芹素乙溶液。

实验分组：

阴性对照组：BALB/c裸鼠造模后尾静脉注射等体积生理盐水；

阳性对照组(CTX组)：用生理盐水配成3mg/mL的CTX溶液，BALB/c裸鼠造模后按体重每次尾静脉注射剂量为30mg/kg的CTX溶液；

欧芹素乙低剂量组：BALB/c裸鼠造模后按体重尾静脉注射上述配制的欧芹素乙溶液，每天剂量为50mg/kg；

欧芹素乙中剂量组：BALB/c裸鼠造模后按体重尾静脉注射上述配制的欧芹素乙溶液，每天剂量为100mg/kg；

欧芹素乙高剂量组：BALB/c裸鼠造模后按体重尾静脉注射上述配制的欧芹素乙溶液，每天剂量为200mg/kg。

实验方法：

按常规在BALB/c裸鼠皮下接种小鼠结肠癌细胞株(C26)细胞，待肿瘤直径长至1.5cm左右，处死，酒精浸泡3min后，取出肿瘤块，放入冰的无血清的DMEM培养基中，用剪刀剪成1mm³的小块，组织研磨后移入六孔板，加入消化液(含1g/LIV型胶原酶，2mg/L DNA酶，10mg/L透明质酸)，37℃消化1h。用含10％NBS的DMEM培养基1mL终止消化，离心弃上清。用PH 7.2的PBS缓冲液10mL洗2次，离心弃上清。将2mL 1×细胞裂解液加入到细胞沉淀中，混匀，室温放置10min。加入PH 7.2的PBS缓冲液10mL洗2次，将细胞沉淀重悬于无血清的DMEM培养基中得到单细胞悬液。台盼蓝染色细胞计数，活细胞不小于95％，根据活细胞计数，用生理盐水稀释成含细胞数为1×10⁷个/mL备用，每只BALB/c裸鼠于右腋皮下接种0.2mL细胞。接种后次日随机分为5组，每组10只，雌雄各半，按上述分组尾静脉注射给药，给药体积为每鼠0.2mL。

阴性对照组：尾静脉注射0.2mL生理盐水注射液，每天1次，连续10天；

阳性对照组：尾静脉注射0.2ml的3mg/mL CTX溶液，给药剂量为按体重每次30mg/kg CTX，隔日1次，共用5次；

欧芹素乙高剂量组：尾静脉注射0.2mL欧芹素乙溶液，每天剂量为200mg/kg，每日1次，连续10天；

欧芹素乙中剂量组：尾静脉注射0.2mL欧芹素乙溶液，每天剂量为100mg/kg，每日1次，连续10天；

欧芹素乙低剂量组：尾静脉注射0.2mL欧芹素乙溶液，每天剂量为50mg/kg，每日1次，连续10天。

末次给药后的次日处死动物，解剖并完整分离肿瘤，称瘤重量，计算肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率(％)＝(阴性对照组平均瘤重-药物组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。数据采用Mean±SD表示，用SPSS13.0软件进行方差分析。结果见表1。

表1欧芹素乙对小鼠C26皮下移植瘤的作用(Mean±SD)

註：*P＜0.05vs阴性对照组

由表1可见，欧芹素乙对C26皮下移植瘤的的生长具有抑制作用，中、高剂量组的平均瘤重显著低于阴性对照组，抑瘤率虽然低于阳性对照药CTX，但均具有统计学意义，P＜0.05。

实施例4欧芹素乙的急性毒性研究

1.实验材料：

ICR小鼠50只(由第二军医大学动物中心提供)，雌雄各半，体重18～25g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。

欧芹素乙由实施例1制备，用0.25％CMC-Na分别配制成浓度为450mg/mL和270mg/mL的混悬液。

2.实验方法：

ICR小鼠按体重单次灌胃欧芹素乙4.5g/kg，或ICR小鼠按体重单次腹腔注射欧芹素乙2.7g/kg，观察给药后动物14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次灌胃给药后，小鼠活动滞缓，静卧少动，30-50分钟后即恢复正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。小鼠腹腔注射给药，20分钟后，3只小鼠出现精神萎靡、蜷缩，活动减少，给药后1h后，全部小鼠恢复正常，给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。

3.实验结果：

上述急性毒性实验结果表明，灌胃给药最大耐受量MTD不低于4.5g/Kg，腹腔注射给药最大耐受量MTD不低于2.7g/Kg，说明欧芹素乙的急性毒性较低。

Claims

1.香豆素类化合物欧芹素乙在制备抗肿瘤药物中的应用。