CN101352490A - 一种抗肿瘤中药提取物及其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤中药提取物及其制备方法及其用途，将圆锥铁线莲粉碎或直接用圆锥铁线莲饮片，加水或乙醇后加热回流提取2－5次，再过滤并合并提取液，过滤或离心后通过大孔树脂，然后先用水洗涤树脂，水洗脱液弃去，再用体积百分比为30－95％的含水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至稠膏，稠膏再减压或喷雾干燥即得到黄酮含量不低于20％、芦丁含量不低于0.1％的圆锥铁线莲提取物。本发明的提取物在体外对白血病Molt－4细胞株、白血病细胞HL60、脑癌U251细胞株、食道癌细胞Eca－109细胞株、肝癌BEL－7402细胞株的增殖均表现出良好的抑制作用。可用于制备治疗肿瘤尤其是消化系统恶性肿瘤等疾病的药物。

Description

一种抗肿瘤中药提取物及其制备方法及其用途

【技术领域】

本发明涉及一种新的抗肿瘤中药提取物以及其制备方法，及其在抗肿瘤药物中的应用。

【背景技术】

肿瘤已经成为严重威胁人类健康的常见病和多发病，全球每年因肿瘤而死亡的人数已达700万人；而国内每年新增肿瘤病人200万，其危害性仅次于心血管疾病，成为导致国内人口死亡的第二大原因。

目前，化学药物治疗是临床肿瘤治疗的重要手段之一。自二十世纪四十年代氮芥用于治疗恶性淋巴瘤后，几十年来药物治疗取得很大进展，已由单一的药物治疗进入了联合化疗和综合化疗的阶段。但现有的抗肿瘤药物依然存在毒副反应太大，缺乏选择性的缺点，加之肿瘤多重耐药性日益严重，因此，如何增强现有抗肿瘤药物的治疗效果，减少毒性，是抗肿瘤药物研究的一个重要领域。中药在减轻和改善化疗药物的副作用及增加化疗效果方面一直发挥着独特的作用。

圆锥铁线莲Clematis terniflora DC.系毛茛科铁线莲属植物，又名锥花铁线莲，铜威灵，蟹沫眼草，小叶力刚，具有祛风除湿、解毒消肿、凉血止血的功能，用于治疗风湿痹痛、疔疮肿毒、恶肿疮瘘、喉痹、蛇犬咬伤及吐血、咳血、崩漏下血等症。主产于浙江、江苏、安徽等地。

目前，尚没有成熟的提取圆锥铁线莲用于抗肿瘤药物的方法。并且，目前的抗肿瘤药物在体外对白血病Molt-4细胞株、白血病细胞HL60、脑癌U251细胞株、食道癌细胞Eca-109细胞株、肝癌BEL-7402细胞株的生长的抑制作用不大。

【发明内容】

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种抗肿瘤中药提取物及其制备方法及其用途，该提取物能够在体外对白血病Molt-4细胞株、白血病细胞HL60、脑癌U251细胞株、食道癌细胞Eca-109细胞株、肝癌BEL-7402细胞株的生长具有良好的抑制作用，能够用于制备治疗肿瘤尤其是消化系统恶性肿瘤等疾病的药物。

为实现上述目的，本发明提出了一种抗肿瘤中药提取物的制备方法，将圆锥铁线莲粉碎或直接用圆锥铁线莲饮片，加水或乙醇后加热回流提取2-5次，再过滤并合并提取液，过滤或离心后通过大孔树脂，然后先用水洗涤树脂，水洗脱液弃去，再用体积百分比为30-95％的含水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至稠膏，稠膏再减压或喷雾干燥即得到圆锥铁线莲提取物。

作为优选，所述大孔树脂的径高比为1∶3-1∶9。

作为优选，所述干的大孔树脂的用量为提取液中黄酮含量的5-10倍。

作为优选，所述提取液的上柱流速为1-4BV/h。

作为优选，所述水洗涤树脂的流量为脂3-8BV，流速为2-4BV/h。

作为优选，所述乙醇洗脱的流速为2-4BV/h。

作为优选，所述加水或乙醇后加热回流提取步骤中加水量为圆锥铁线莲的6-15倍。

作为优选，所述加水量为圆锥铁线莲的8倍，加热回流提取的次数为2次，每次1-3小时。

为实现上述目的，本发明还提出了一种采用上述制备方法所得到的抗肿瘤中药提取物，所述提取物为圆锥铁线莲提取物，其中按重量百分比算，含有不低于20％的黄酮，不低于0.1％的芦丁。

为实现上述目的，本发明还提出了一种上述抗肿瘤中药提取物的用途，该圆锥铁线莲提取物用于制备抗肿瘤药物。

本发明的有益效果：本发明的提取物在体外对白血病Molt-4细胞株、白血病细胞HL60、脑癌U251细胞株、食道癌细胞Eca-109细胞株、肝癌BEL-7402细胞株的增殖均表现出良好的抑制作用；对荷H22肝癌小鼠、荷S180肉瘤小鼠、荷胃癌SGC7901裸鼠具有明显的治疗作用。可用于制备治疗肿瘤尤其是消化系统恶性肿瘤等疾病的药物。

本发明的特征及优点将通过实施例进行详细说明。

【具体实施方式】

抗肿瘤中药提取物的制备方法是圆锥铁线莲药材粉碎或直接用圆锥铁线莲饮片，加6-15倍量水或10％-95％的乙醇，加热回流提取2-5次，每次1-3h，过滤，合并提取液，浓缩至0.25-2.0g生药/mL；过滤或离心(4000-16000转/分钟)后通过大孔树脂，药液按总黄酮含量计与干树脂的比例为1∶5-10，上柱流速1-4BV/h，树脂径高比为1∶3-1∶9；用水洗涤树脂3-8BV，洗脱流速为2-4BV/h，水洗脱液弃去；用体积百分比为30-95％含水乙醇洗脱，流速为2-4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.1-1.3(50℃热测)的稠膏，该稠膏减压或喷雾干燥，得圆锥铁线莲提取物。

实施例一：

圆锥铁线莲药材粗粉5kg，加8倍量水，加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并提取液，浓缩至1.0g生药/ml；离心(4000转/分钟)后通过AB-8型大孔树脂，药液按圆锥铁线莲总黄酮含量计与干树脂的比例为1∶5，上柱流速2BV/h，树脂径高比为1∶5；用水洗涤树脂3BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含70％水乙醇洗脱3BV，流速为2BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.1(50℃热测)，减压干燥，得圆锥铁线莲提取物。测得该提取物总黄酮含量为27％(UV法；重量百分比)，芦丁的含量为0.45％(HPLC法，重量百分比)。

实施例二：

圆锥铁线莲药材饮片5kg，加10倍量30％乙醇，加热回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并提取液，浓缩至0.5g生药/ml；过滤后通过D201型大孔树脂，药液按总黄酮含量计与干树脂的比例为1∶9，上柱流速3BV/h，树脂径高比为1∶7；用水洗涤树脂5BV，洗脱流速为4BV/h，水洗脱液弃去；用含30％水乙醇洗脱10BV，流速为4BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.25(50℃热测)，喷雾干燥，得圆锥铁线莲提取物。测得该提取物总黄酮含量为35％(UV法，重量百分比)，芦丁的含量为1.1％(HPLC法，重量百分比)。

实施例三：

圆锥铁线莲药材饮片5kg，加15倍量70％乙醇，加热回流提取2次，每次1h，过滤，合并提取液，浓缩至0.25g生药/ml；离心(8000转/分钟)后通过HPD101型大孔树脂，药液按总黄酮含量计与干树脂的比例为1∶6，上柱流速4BV/h，树脂径高比为1∶9；用水洗涤树脂2BV，洗脱流速为3BV/h，水洗脱液弃去；用含70％水乙醇洗脱5BV，流速为3BV/h，收集乙醇洗脱液；乙醇液减压浓缩至相对密度为1.2(50℃热测)，喷雾干燥，得圆锥铁线莲提取物。测得圆锥铁线莲总黄酮含量为70％(UV法，以圆锥铁线莲皂苷D计，重量百分比)，芦丁的含量为2.2％(HPLC法，重量百分比)。

圆锥铁线莲提取物的药理作用如下：

一：圆锥铁线莲提取物在体外对多种肿瘤细胞株生长的影响

1方法：采用计活细胞数法检测定圆锥铁线莲提取物对白血病Molt-4、白血病细胞HL60、脑癌U251、食道癌细胞Eca-109、肝癌BEL-7402等肿瘤细胞株的体外生长抑制率。

2试验步骤

2.1将对数生长期的肿瘤细胞以每毫升4×10⁴个接种于96孔板，重复3孔。

2.2根据实验组分的溶解性，用乙醇(99.9％)、DMSO溶解配成母液，再用1640培养液配成相应浓度，溶剂对照也配成相应浓度，使细胞培养孔中的终浓度为剂量的设置值。

2.3细胞培养两小时后，加入实验药物组、溶剂对照组、培养液对照组，等体积。

2.4不同时间点下，显微镜观察细胞生长情况，抑制率＝1-(实验活细胞数/对照组活细胞数)×100％。

3试验结果见表1。

表1：

4结论

圆锥铁线莲提取物在体外对白血病Molt-4、白血病细胞HL60、脑癌U251、食道癌细胞Eca-109、肝癌BEL-7402等肿瘤细胞株的生长具有明显的抑制作用。

二：圆锥铁线莲提取物对荷人SGC7901胃癌裸鼠的实验治疗作用

1.方法：取荷人胃癌SGC7901裸鼠1只(购于中科院上海药物研究所动物中心)，待肿瘤长到约500mm³时，无菌条件下剖杀小说，取出瘤块切割成约1.5mm³，用套管针接种到4～5周龄雄性裸小鼠右前肢腋皮下，共21只。待瘤块长到100～150mm³时将裸小鼠随机分成4组，分别为：(1)阴性对照组6只，灌胃给予灭菌蒸馏水0.4mL/只；(2)阳性对照组3只，羟基喜树碱(HCPT)20mg/kg，im；(3)圆锥铁线莲提取物实验组6只，灌胃给予圆锥铁线莲提取物3.0g/kg；(4)圆锥铁线莲提取物实验组6只，灌胃给予圆锥铁线莲提取物4.0g/kg。各组连续给药15天，每2天称量裸鼠重量，并测定瘤块的长和宽，按一下公式计算瘤块的体积：

V＝1/2*a*b²(a为瘤块的长；b为瘤块的宽)

实验结束后，剖杀裸小鼠，取瘤块称重。按照以下公式计算相对瘤体积(Relative tumor volume，RTV)和相对肿瘤增殖率T/C(％)。

RTV＝V_t/V₀(V₀为分笼时肿瘤体积；V_t为每次测量时肿瘤体积)

$T/C(\%)=\frac{T_{\mathrm{RTV}}}{C_{\mathrm{RTV}}}*100\%$

T_RTV：治疗组RTV；：C_RTV阴性对照组RTV

2实验结果见表2。

表2：

3实验结论圆锥铁线莲提取物对荷人SGC7901胃癌裸鼠有明显的治疗作用。

三：圆锥铁线莲提取物对荷H22肝癌小鼠和荷S180肉瘤小鼠的实验治疗作用。

1.方法：ICR小鼠分别腋下接种2×10⁵个H22肝癌及S180肉瘤细胞，连续灌胃铁线莲6天，剖杀后取瘤块称重，计算肿瘤抑制百分率。

2.实验材料

2.1试验试剂：圆锥铁线莲提取物

2.2实验动物

小鼠：ICR品系，雄性，58只，实验一体重20±2g，实验二体重21±1g。由浙江省医学科学院提供。合格证：SCXK(浙)2003-0001。发证单位：浙江省实验动物管理委员会。

3.实验步骤

3.1接种癌细胞

将预先接种H22和S180腹水瘤的小鼠处死，从腹腔中抽取1mL腹水瘤，用生理盐水稀释成1×10⁶个细胞/mL，按0.2mL/只注射于小鼠腋下，24小时后，随机分组，并开始给药。

3.2分组及给药

58只接种H22肝癌小鼠随机分成5组，(1)阴性对照组18只，(2)阳性对照顺铂组10只，(3)圆锥铁线莲提取物3.0g/kg组10只，(4)圆锥铁线莲提取物6.0g/kg组10只，(5)圆锥铁线莲提取物12.0g/kg组10只。阴性对照组每天灌胃生理盐水0.3mL/10g，阳性对照(顺铂)组每天腹腔注射1.0mg/kg，每天一次，圆锥铁线莲提取物3.0、6.0、12.0g/kg组每天灌胃0.05、0.10、0.20g/mL浓度圆锥铁线莲提取物，给药容量0.3mL/10g，一天两次，连续给药6天后，停药，称小鼠体重，并解剖取瘤块称重量，计算肿瘤抑制百分率，做统计学分析。另58只接种S180肉瘤小鼠随机分成5组，同上分组、给药。

4.实验结果：

4.1H22肝癌连续给药6天后，阳性对照，圆锥铁线莲提取物3.0g/kg，6.0g/kg和12.0g/kg组的H22肝癌平均瘤重分别为0.18g、0.14g、0.04g、0.01g，与阴性对照组0.77g比较，均有不同程度的下降，抑瘤率分别为76％、81％、95％和98％。见表3。

表3：

与对照组相比：**：P＜0.01。

4.2S180肉瘤连续给药6天后，阳性对照，圆锥铁线莲提取物3.0g/kg，6.0g/kg和12.0g/kg组的S180肉瘤平均瘤重分别为0.11g、0.46g、0.37g、0.02g，与阴性对照组0.71g比较，均有不同程度的下降，抑瘤率分别为85％、36％、48％和98％。见表4。

表4：

对照组相比：***：P＜0.001。

5.实验结论：

圆锥铁线莲提取物对小鼠H22肝癌和S180肉瘤均有显著的实验治疗作用。

该中药提取物可与临床常用肿瘤化疗药物环磷酰胺、5-Fu、紫杉醇、顺铂等合用，以增强疗效。

上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何在本发明基础上简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：将圆锥铁线莲粉碎或直接用圆锥铁线莲饮片，加水或乙醇后加热回流提取2-5次，再过滤并合并提取液，过滤或离心后通过大孔树脂，然后先用水洗涤树脂，水洗脱液弃去，再用体积百分比为30-95％的含水乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压浓缩至稠膏，稠膏再减压或喷雾干燥即得到圆锥铁线莲提取物。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂的径高比为1∶3-1∶9。

3.如权利要求2所述的抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：所述干的大孔树脂的用量为提取液中黄酮含量的5-10倍。

4.如权利要求3所述的抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：所述提取液的上柱流速为1-4BV/h。

5.如权利要求1所述的抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：所述水洗涤树脂的流量为脂3-8BV，流速为2-4BV/h。

6.如权利要求5所述的抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：所述乙醇洗脱的流速为2-4BV/h。

7.如权利要求1所述的抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：所述加水或乙醇后加热回流提取步骤中加水量为圆锥铁线莲的6-15倍。

8.如权利要求7所述的抗肿瘤中药提取物的制备方法，其特征在于：所述加水量为圆锥铁线莲的8倍，加热回流提取的次数为2次，每次1-3小时。

9.根据权利要求1至8中任何一项的制备方法所得到的抗肿瘤中药提取物，其特征在于：所述提取物为圆锥铁线莲提取物，其中按重量百分比算，含有不低于20％的黄酮，不低于0.1％的芦丁。

10.权利要求9中所述的抗肿瘤中药提取物的用途，其特征在于：该圆锥铁线莲提取物用于制备抗肿瘤药物。