CN101952725A - 使用了包覆磁性微粒的生物传感方法以及用于该方法的生物传感装置 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种新型的生物传感方法作为磁性颗粒在生物传感中的新的应用开发，该方法利用了其作为标记的优越性，同时改善了传感的处理量。在生物传感中的亲和反应中，通过将配体固定在磁性微粒上，并将该磁性微粒朝向亲和反应的反应场强制性磁引导，从而使传感中的控速因子即亲和反应迅速化。本发明中，作为上述磁性微粒，采用一种特征在于兼具高分散性和高磁响应性这两者的包覆磁性微粒。根据本发明，亲和反应迅速且以高密度发生，其结果是，与以往相比能够以非常短的时间获得大的信号。

Description

使用了包覆磁性微粒的生物传感方法以及用于该方法的生物传感装置 

技术领域

本发明涉及生物传感方法，更详细而言，涉及使用了包覆磁性微粒的生物传感方法。 

背景技术

以往，在生物传感技术领域中，对于利用了在具有相互互补的序列的多核苷酸间产生的互补结合的DNA芯片、利用了在抗原和抗体之间产生的特异性结合的抗体芯片等进行了各种研究。在这方面而言，日本特表2005-533236号公报(专利文献1)中公开了一种使用了夹心法ELISA的抗原的检测和测定方法。图9为以时间序列示出专利文献1中公开的夹心法ELISA的步骤的图。首先，如图9的(a)所示那样，使与检测对象即抗原特异性结合的第1抗体42吸附到基板44上而固相化。接着，如图9的(b)所示那样，将基板44浸渍到含有作为检测对象的抗原46的试样溶液后，添加识别与第1抗体42不同表位的第2抗体48。此时，第2抗体48预先通过酶或荧光物质等分子标记50而标记。在经过充分的反应时间后，洗涤基板44而除去未反应的物质，则如图9的(c)所示那样，在基板表面形成基板44-第1抗体42-抗原46-第2抗体48这样的复合体。这里，通过使用所对应的测定体系来测定与第2抗体48结合的分子标记50，间接地检测抗原46。 

以上，如例示出夹心法ELISA而说明的那样，很多生物传感通常都利用了抗体抗原反应等生物分子间的亲和(亲和性)反应，这种亲和反应通常大多都需要数小时以上的反应时间， 该反应工序降低了传感操作的处理量。 

此外，日本特开2003-130880号公报(专利文献2)中公开了使用磁性微粒的夹心法ELISA的其他方法。图10为以时间序列示出专利文献2中公开的使用磁性微粒的夹心法ELISA的步骤的图。如图10的(a)所示那样，在专利文献2中，使与检测对象即抗原52特异性结合的第1抗体54吸附到磁性颗粒56上，将所形成的抗体-磁性颗粒复合体58添加到含有作为检测对象的抗原52的试样溶液后，静置充分的时间使第1抗体54与抗原52反应。接着，如图10的(b)所示那样，利用磁铁60的作用将抗体-磁性颗粒复合体58磁性集中，并洗涤而除去未反应的物质。接着，如图10的(c)所示那样，对于仅含有抗体-磁性颗粒复合体58与抗原52结合而成的复合体的试样溶液，加入利用分子标记62而标记的第2抗体64，使其充分反应。其结果，如图10的(d)所示那样，形成磁性颗粒56-第1抗体54-抗原52-第2抗体64这样的复合体。这里，若再次利用磁铁60的作用将磁性颗粒56磁性集中，并洗涤而除去未反应的第2抗体64，则如图10的(e)所示那样，仅残留磁性颗粒56-第1抗体54-抗原52-第2抗体64这样的复合体，这里，通过使用所对应的测定体系来测定与第2抗体64结合的分子标记62，间接地检测抗原52。 

然而，专利文献2只不过是通过使用磁性颗粒而省略了耗费时间的离心分离工序，在图10的(a)和(c)所示的工序中的抗体抗原反应依然需要数小时的反应时间，专利文献1完全没有解决上述问题。如以上所说明的那样，在以往的生物传感技术中，抗体抗原反应等亲和反应的工序成为瓶颈而降低了处理量，正在寻求一种缩短该反应时间的方法。 

另一方面，近年来，作为用于生物传感的标记物质，磁性颗粒受到瞩目。相对于因猝灭的影响而可能会经时退色的荧光 物质，磁性颗粒除了其物性(磁性)不会经时劣化以外，还确立了能够高速且以高精度测定磁力的优异的测定体系，此外，对于磁性颗粒，可以期待与利用其磁性的操作等相关联的、作为标记物质的潜在的有效性，因而在生物传感的领域中面临着磁性颗粒的更进一步的应用开发。 

在这方面，本申请人在先申请的日本特开2006-88131号公报(专利文献3)中公开了一种新型的聚合物包覆磁性微粒。该聚合物包覆磁性微粒具有数十nm～数百nm的平均粒径，良好地实现了以往在聚合物包覆的磁性颗粒中难以实现的高分散性与磁响应性的兼顾。 

专利文献1：日本特表2005-533236号公报 

专利文献2：日本特开2003-130880号公报 

专利文献3：日本特开2006-88131号公报 

发明内容

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述现有技术中的问题而进行的，本发明的目的在于提供一种新型的生物传感方法作为磁性颗粒在生物传感中的新的应用开发，该方法利用了其作为标记的优越性，同时改善了传感的处理量。 

用于解决问题的方案

本发明人等对磁性颗粒在生物传感中的新的应用开发进行了深入研究，结果想到：在生物传感中的亲和反应中，通过将配体或受体固定在磁性微粒上，并将该磁性微粒朝向亲和反应的反应场强制性磁引导，从而使传感中的控速因子即亲和反应迅速化。此外，本发明人等发现：作为上述磁性微粒，采用一种特征在于兼具高分散性和高磁响应性这两者的包覆磁性微 粒，从而上述亲和反应迅速且以高密度发生，其结果是，与以往相比能够以非常短的时间获得大的信号；由此完成了本发明。 

即，根据本发明，提供一种利用亲和反应的生物传感方法，其特征在于，将所述亲和反应中的配体固定在磁性微粒上，并将该磁性微粒朝向所述亲和反应的反应场强制性磁引导。本发明的方法能够进一步包括一边振荡所述反应场、一边洗涤的工序，能够进一步包括一边将所述磁性微粒向远离所述反应场的方向磁引导、一边洗涤的工序。另外，本发明中，所述磁性微粒的平均粒径优选为3～400nm，优选为聚合物包覆磁性微粒或被含有官能团的分子包覆的磁性微粒。另外，本发明中，能够使所述磁性微粒为具备荧光功能的微粒，能够使所述聚合物包覆磁性微粒为在聚合物层导入了荧光物质的磁性微粒。本发明中，能够使用磁传感器进行传感，还能够使用光学检测器、尤其是荧光检测器进行传感。此外，还能够利用使用了表面等离子共振法的SPR传感器或使用了石英晶体微天平法的质量检测传感器进行传感。另外，根据本发明的其他方案，提供一种生物传感装置，其特征在于，该生物传感装置利用了亲和反应，且具备磁引导单元，所述磁引导单元用于将固定有所述亲和反应的配体的磁性微粒朝向所述亲和反应的反应场强制性磁引导。 

此外，根据本发明，可提供如下方法，其特征在于，在检测与2个抗体特异性结合的抗原的夹心ELISA法中，朝向固定有第1抗体的基板，对固定有第2抗体的磁性微粒强制性磁引导。此外，根据本发明，提供一种检测癌细胞的方法，其特征在于，将患者的组织切片放置于基板上，朝向该基板，对固定有与癌组织特异性表达的蛋白质分子特异性结合的抗体的磁性微粒强制性磁引导。 

发明的效果

如上所述，根据本发明，提供一种新型的生物传感方法作为磁性颗粒在生物传感中的新的应用开发，该方法利用了其作为标记的优越性，同时改善了生物传感的处理量。根据本发明的生物传感方法，可良好地促进亲和反应，因此能够以短时间获得较高的信号，而且通过标记磁性颗粒可实现高速且高精度的分析。 

具体实施方式

以下，通过附图所示的实施方式对本发明进行说明，但本发明不限于附图所示的实施方式。 

首先，关于本发明的使用包覆磁性微粒的生物传感方法的机制，以作为生物传感的方法之一而较多使用的夹心法ELISA的反应体系为例进行说明。图1为以时间序列示出夹心法ELISA的反应体系10的图。如图1的(a)所示那样，试样溶液12含有检测对象即抗原14和除此以外的蛋白质16以及蛋白质18，表面吸附并固相化有与抗原14特异性结合的第1抗体20的基板22浸渍于试样溶液12中。在以往的夹心法ELISA中，在这种反应体系中加入与抗原14特异性结合的第2抗体，该第2抗体通过酶或荧光物质等分子标记而被标记，但本发明中，特征在于使用在磁性微粒26上固定有该第2抗体24的抗体-磁性微粒复合体28。 

本发明中，磁性微粒26优选为磁响应性优异的微粒，同时，优选使用具有接近单分散的高分散性的微粒。具体而言，优选使用平均粒径为3～400nm的微粒，更优选使用10～200nm的微粒。关于兼具高磁响应性和高分散性的极小尺寸的磁性微粒，以往，其制作较为困难，但本申请人在先申请的日本特开2006-88131号公报、日本特愿2006-313493号、和日本特愿 2007-194233号中公开的发明已经实现了其制作。另外，本发明中的磁性微粒26的详细内容如后所述。 

这里，磁性微粒26是与以往的微粒相比相当小的微粒，例如，可以是粒径200nm左右的微粒，其扩散系数为10^-8左右，与以往的分子标记的扩散系数即约10^-6左右相比，该扩散系数小2个数量级，由此也导致其反应速度与使用以往的分子标记的反应体系的反应速度相比更小。 

在这方面，本发明人等采用了通过对磁性微粒26磁引导从而使抗体-磁性微粒复合体28接近反应场的方案。关于其机制，参照图1的(b)进行说明。 

对于图1的(b)所示的反应体系10，本发明的方法中，通过使用磁产生部30对抗体-磁性微粒复合体28磁引导，从而弥补由于磁性微粒26的扩散系数小而导致的反应性的降低。图1的(b)所示的反应体系10中，由于第1抗体20固定在基板22的表面，因而基板22的表面附近成为抗体抗原反应的反应场R。因此，本发明中，通过将磁产生部30例如配置于基板22的背侧，从而使磁力作用于反应体系10，由此，将抗体-磁性微粒复合体28强制性磁引导至基板22的表面附近、即反应场R。通过采用这种方案，抗体20-抗原14-抗体24的夹心法反应迅速化，其结果，如图1的(c)所示那样，抗体-磁性微粒复合体28以高密度吸附在基板22上。另外，作为本发明中的磁力产生部30，可以适当使用永久磁铁、电磁铁等。 

另外，本发明中，由于磁性微粒26的平均粒径为3～400nm左右，非常小，因而良好地避免了因反应体系10的流动所致的冲量(impulse)的影响，其结果是，抗体-磁性微粒复合体28的吸附后的稳定性被保持。这意味着，由于洗涤工序等而丧失亲和反应的特异性结合的可能性低，由此，确保了较高的传感 精度。 

此外，本发明的生物传感方法以上述吸附后的稳定性为基础，从进一步提高传感精度的观点出发，公开了以下所示的方法。图2为在本发明的生物传感方法中使用图1所示的夹心法ELISA的反应体系10对选择性除去不基于亲和反应的非特异性结合的洗涤工序进行说明的图。如图2的(a)中箭头所示那样，抗体-磁性微粒复合体28F有时通过不基于抗原抗体反应的非特异性结合而吸附在基板22上。这种抗体-磁性微粒复合体28F的存在会降低传感的精度，因而需要选择性除去。因此，本发明中，如图2的(b)所示那样，可以使用未图示的板振荡器等一边振荡反应体系10、一边进行洗涤。另外，此时，优选不从配置于基板22背侧的磁产生部30作用磁力。于是，通过上述振荡使得通过非特异性结合而吸附在基板22上的抗体-磁性微粒复合体28F从基板22脱离，另一方面，通过基于抗原抗体反应的特异性结合而吸附在基板22上的其他抗体-磁性微粒复合体28不太会受到反应体系10的流动所致的冲量的影响，因而不脱离，通过将其洗涤并回收，能够选择性除去非特异性结合。 

此外，本发明中，如图2的(c)所示那样，可以在基板22的另外一侧配置磁产生部30，一边将抗体-磁性微粒复合体28F向远离反应场R的方向磁引导、一边洗涤。于是，通过非特异性结合而吸附在基板22上的抗体-磁性微粒复合体28F由于磁力的作用而从基板22脱离，磁性集中到磁产生部30侧，另一方面，由于基于抗原抗体反应的特异性结合力比磁力的作用力更大，因而不脱离，通过将其洗涤并回收，能够选择性除去非特异性结合。本发明中，为了实现更高的传感精度，在洗涤工序中，优选一并进行上述振荡和磁引导。 

以上，以夹心法ELISA的反应体系为例对本发明的生物传 感方法进行说明，但本发明不限于利用抗原抗体反应的生物传感，能够适用于所有利用亲和反应的生物传感方法。另外，本发明中的亲和反应的概念包含：核酸DNA的互补性结合、核酸与蛋白质的特异性结合、与信号传递体系相关的蛋白质与其受体蛋白质的结合或者Protein A或Protein G与抗体的Fc部位的结合这类蛋白质之间的特异性结合、酶与其底物的特异性结合、激素分子与其受体的特异性结合、糖链与凝集素的特异性结合等生物分子间(还包括与经人工改变的生物分子的反应)的特异性反应；以及，使用了适体等的人工抗体样分子与生物分子的特异性结合、药剂或药剂候选物质与生物分子的特异性结合、抗生物素蛋白与生物素的特异性结合等低分子化合物与生物分子(还包括与经人工改变的生物分子的反应)之间的特异性反应。另外，本发明中，配体意味着构成上述亲和反应(特异性结合)的要素中的任一者，并且意味着能够通过亲和力而吸附到构成该反应的其他要素上的相互匹配的物质。 

作为本发明的应用例，例如，可列举出如下方案：在将具有与作为分离对象的核酸互补的碱基序列的核酸固定在芯片上而成的所谓的DNA芯片中，将作为分离对象的核酸固定在上述磁性微粒上而形成核酸-磁性微粒复合体，将该核酸-磁性微粒复合体添加到上述芯片上时，从该芯片的背侧作用磁力而对核酸-磁性微粒复合体磁引导，从而使核酸间的互补性结合迅速化。 

另外，本发明的生物传感法如以上所示的夹心法ELISA或DNA芯片的例子那样，不限于使用预先固定有抗体或核酸等分子的基板的情况，还能够对样品直接应用。以下，对于这样的应用例，参照图3和图4进行说明。 

通常，在医疗诊断中判断癌的转移时，如图3所示那样，从 患者42摘取疑为癌的转移处的前哨淋巴结，研究在该组织中是否存在癌组织特异性表达的蛋白质分子。本实施方式中，将从患者42摘取的组织切片44放置于载玻片46上，利用抗原抗体反应实施生物传感。如果癌转移了的话，则从癌细胞48的切断面应该表露出癌组织特异性表达的蛋白质分子50。 

图4所示为对于从患者42摘取的组织切片44使用本发明的生物传感法研究有无癌细胞的步骤。如图4的(a)所示那样，首先，将放置有组织切片44的载玻片46设置在反应容器56中，该反应容器56充满了含有固定了针对蛋白质分子50的抗体52的磁性微粒54的反应液。接着，在载玻片46的背侧配置磁产生部58，通过对磁性微粒54磁引导，从而如图4的(b)所示那样，介由蛋白质分子50与抗体52的抗原抗体反应，磁性微粒54迅速吸附到癌细胞48的表面。然后，以在图1和图2中说明的同样的步骤实施洗涤，从而如图4的(c)所示那样，多余的磁性微粒54被排除。最后，通过检测残留的磁性微粒54，能够确定癌细胞的存在。 

另外，在本发明的使用包覆磁性微粒的生物传感方法中，可以使用高灵敏度磁传感器作为其测定体系，通过高速且高精度地测定包覆磁性微粒的磁力，可以实现可靠性高的传感。作为在本发明中使用的磁传感器，可列举出霍尔元件、SQUID元件、MR元件、GMR元件、TMR元件、和MI元件等。此外，本发明中，还可以采用使用了表面等离子共振法的SPR传感器、使用了石英晶体微天平法的质量检测传感器作为其测定体系。 

接着，对于在本发明的生物传感方法中使用的磁性微粒26进行以下说明。以往，对于包覆磁性微粒在生物传感领域中的应用进行了各种研究，但是在包覆磁性微粒中，其分散性和对磁场的响应性处于二律相悖的关系，难以制作兼具这两者的材 料。在这方面，本申请人在先申请的日本特开2006-88131号公报所公开的发明的发明人等，创造出一种粒径非常小、聚合物覆膜良好、且兼具高分散性和高磁响应性的聚合物包覆磁性微粒。本发明中，作为磁性微粒26，可以使用日本特开2006-88131号公报中公开的平均粒径为25～400nm左右的聚合物包覆磁性微粒。这里，对于上述聚合物包覆磁性微粒的制造方法进行以下概述。首先，使平均粒径为20～300nm的铁氧体颗粒等亲水性的强磁性微粒吸附脂肪酸等疏水化物质而疏水化，对其使用非离子性的具有亲水基的表面活性剂来抑制离子强度，并进行亲水化，获得分散液。另一方面，使用非离子性表面活性剂和离子性表面活性剂将聚合物包覆的单体液乳化。作为单体，可以使用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯。接着，通过混合上述分散液和上述单体的乳化液而进行乳液聚合，良好地分散的强磁性微粒进行了均匀且稳定的聚合物包覆，其结果，获得颗粒尺寸统一、且对磁场的响应性良好的聚合物包覆的强磁性微粒。 

另外，为了在上述聚合物包覆的强磁性微粒上固定配体，可以对上述聚合物覆膜导入能够与配体反应的官能团。例如，可以对聚合物覆膜导入环氧基，此外也可以将上述环氧基用氨处理而导入羟基和氨基。此外，还可以使上述氨基与单乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)或聚乙二醇二缩水甘油醚分子结合而形成隔离物(spacers)。通过介由这种隔离物而将生物分子固定，从而能够避免聚合物包覆的强磁性微粒的立体障碍。 

另外，本发明中，作为磁性微粒26，可以使用本申请人在先申请的日本特愿2007-194233号公开的、用柠檬酸等含有亲水性官能团的分子包覆而成的平均粒径3～40nm左右的包覆磁性微粒。这里，对上述包覆磁性微粒的制造方法进行以下概述。 首先，在分散有用脂肪酸包覆的磁性微粒的非极性溶剂中，添加硫代苹果酸等作为暂时包覆物质，将颗粒的脂肪酸包覆先用该暂时包覆物质包覆置换。接着，将用该暂时包覆物质包覆的磁性微粒分散到极性溶剂中，向该分散液中添加柠檬酸等含有亲水性官能团的分子，将磁性微粒上覆盖的暂时包覆物质覆膜用含有该官能团的分子置换。通过上述步骤，可获得用含有亲水性官能团的分子包覆的、在水系等极性溶剂中也能良好地分散的包覆磁性微粒。通过含有这些官能团的分子包覆而成的磁性颗粒具有均匀的粒径，磁特性也均匀，因而在磁传感中可获得更好的定量性。 

另外，作为上述亲水性的低分子物质，可以使用苹果酸、柠檬酸、酒石酸等具有羟基的多元羧酸，天冬氨酸、谷氨酸等具有氨基的多元羧酸，儿茶酚、水杨酸等具有酚性羟基的化合物及其衍生物，分子量比较小的寡肽，蛋白质等大分子，半胱氨酸等具有巯基的化合物，磺基丙氨酸等具有磺酸基的化合物，具有磷酸基的化合物，具有硅烷三醇的化合物等。此外，还可以使用核酸及其衍生物、葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸、海藻酸、透明质酸、胶原蛋白、明胶及其衍生物。 

此外，本发明中，作为磁性微粒26，可以使用本申请人在先申请的日本特愿2006-313493号公开的聚合物包覆磁性微粒，该聚合物包覆磁性微粒在该包覆聚合物层的内部保持有荧光物质。这里，对上述保持有荧光物质的聚合物包覆磁性微粒的制造方法进行以下概述。首先，将聚合物包覆磁性微粒浸渍到溶解有荧光物质的非水系溶剂中，使荧光物质与溶剂一起吸收到聚合物层的内部后，从该聚合物层除去非水系溶剂，从而获得在聚合物层导入了荧光物质的聚合物包覆磁性微粒。上述荧光 聚合物包覆磁性微粒除了可利用上述磁传感器检测和测定外，还能够应用于以颗粒的荧光功能作为标记并使用荧光检测器等光学检测器的测定。 

如以上所说明的那样，本发明中的磁性微粒26具有优异的磁响应性，因此能够利用磁引导而良好地促进亲和反应。另外，磁性微粒26具有接近单分散的高分散性，在反应场中可避免凝聚，其结果是，不易产生由于亲和反应以外的非特异性结合导致的传感误差。 

本发明的使用包覆磁性微粒的生物传感方法的优点在于，通过将固定有配体的磁性微粒磁引导至反应场附近，可使生物传感中的控速因子即亲和反应迅速化。根据本发明，在亲和反应中，尤其是其反应起始变得更快，因而能够以短时间获得测定体系的进入测定范围内的高信号，其结果是，能够以数分钟的等待时间预测样品内的所期望的生物分子的量。这暗示了本发明的广泛的应用开发。本发明尤其被预测在要求紧急性的医疗现场的应用开发。例如，以往，关于癌的手术中的病灶的最终切除范围，基于医生的经验通过目视进行判断，但根据本发明，能够在手术中实时获取有关疑似癌的转移的部位的分子水平的信息(癌组织特异性表达的蛋白质分子是否存在)，能够当场确认有无转移，因而能够对切除范围进行更准确的判断。 

实施例 

以下，关于本发明的使用包覆磁性微粒的生物传感方法，利用实施例进行更具体的说明，但本发明不限于后述的实施例。 

(实施例1) 

反应模型体系的调制 

本实施例中，将用于检测脑钠肽(BNP，Brain Natriuretic Peptide)的夹心法ELISA作为反应模型体系。反应模型体系如 下形成：首先，将作为脑钠肽(以下，称为BNP)的抗体的BC203(盐野义制药株式会社)吸附到金基板(5mm×5mm)上并固相化，并且在粒径约200nm的聚合物包覆磁性微粒(以下，称为FG珠)、粒径约27nm的柠檬酸包覆的磁性微粒、市售的磁性颗粒DYNA珠(粒径2.8μm，DYNAL，羧基)这3种磁性微粒的表面固定BNP的另一抗体即KY2(盐野义制药株式会社)。另外，关于上述各种抗体-磁性微粒复合体，按照每单位磁性微粒重量所固定化的抗体量相等的方式进行调制。 

抗体在金基板上的固定化如下进行：介由交联剂(cross linker)使自组装单分子膜与末端具有巯基的Z-tag蛋白质反应，从而具有抗体结合能力。将金基板在200ul的1mM PEG3-OH烷基硫醇(Sensopath Technologies)乙醇溶液中在37℃下浸渍24小时。然后将金基板在150ul的50mM PMPI(Pierce)的DMSO溶液中在室温下反应2小时。接着将末端具有巯基的Z-tag蛋白质在200ul的固定化溶液1(10mM Hepes(pH7.0)，50mM KCl，1.0mM EDTA)中在4℃下反应24小时。然后将10ug的BC203在200ul的固定化溶液2(10mM Hepes(pH7.0)，50mMKCl，1.0mM EDTA，0.1％Tween20)中在4℃下反应4小时，从而在金基板上固相化。反应均在微量离心管(Eppendorf)内浸渍金基板来进行。 

抗体在磁性微粒上的固定化通过偶联各表面的羧基与KY2抗体的氨基来进行。分别采集1mg的FG珠、粒径约27nm的柠檬酸包覆的磁性微粒、DYNA珠(粒径2.8μm，DYNAL)，分散到调整为0.5M EDC(nakalai tesque)和0.5M NHS(ペプチド研究所)的1ml DMF中，在室温下反应2小时。然后将10ug的KY2抗体在1ml的固定化溶液(10mM Hepes(pH7.0)，50mMKCl，1.0mM EDTA)中在4℃下反应2小时，形成KY2-FG珠复合 体、KY2-柠檬酸包覆的微粒复合体、和KY2-DYNA珠复合体。 

(2)反应时间的验证 

在48孔板的孔内静置吸附BC203并固相化的金基板，用200μL的反应溶液(10mM Hepes(pH7.9)，50mM KCl，1.0mMEDTA，0.1％Tween20，0.03％脱脂乳)填满。接着，在该孔中添加1ng BNP(ペプチド研究所)，在ELISA用板振荡器(NISSIN)上振荡5分钟后，将KY2-FG珠复合体添加到浸渍在上述反应溶液中的金基板上。然后，在使磁铁从48孔板的下方接近的状态下静置规定时间(1分钟、10分钟、100分钟)。经过规定时间后，用洗涤溶液(10mM Hepes(pH7.9)，50mM KCl，1.0mMEDTA，0.1％Tween20)将金基板洗涤3次。最后，用Milli Q洗涤各金基板后，用扫描型电子显微镜观察。并且，作为背景，对于不添加BNP的反应体系也以与上述同样的步骤进行实验，此外，作为比较例，对于不使用磁铁的反应体系也以与上述同样的步骤进行实验。另外，对于背景和比较例，也用扫描型电子显微镜观察反应后的金基板。从扫描型电子显微镜的观察结果算出表面包覆密度(％)。另外，本实施例中表面包覆密度(％)由下述式(1)所定义，取用扫描型电子显微镜观察的5个视野的平均而算出。 

[数学式1] 

下述表1示出了金基板上的FG珠的表面包覆密度(％)与反应时间(1分钟、10分钟、100分钟)的关系。 

[表1] 

表1中，在纸面左侧示出本实施例的结果(有磁铁)，在纸面右侧示出比较例的结果(无磁铁)，在最末行示出背景值(无BNP)。并且，图5中以柱状图示出表1的结果。如表1和图5所示那样，进行了磁引导的反应体系(有磁铁)的表面包覆密度(％)与经过相同反应时间后的未进行磁引导的反应体系(无磁铁)的表面包覆密度相比，显示出非常高的值。例如，若着眼于经过反应时间1分钟后的结果，则进行了磁引导的反应体系(有磁铁)的表面包覆密度(％)为未进行磁引导的反应体系(无磁铁)的表面包覆密度的30倍以上。另外，在进行了磁引导的反应体系(有磁铁)中，仅仅以1分钟的反应时间就可检测到与背景值之间的显著性差异，显示根据本发明能够以数分钟获得足以可靠的数据。 

(3)测定精度的验证 

对于添加了不同量(1～105pg)的BNP的反应体系，在与上述同样的条件下进行实验，算出各反应体系的表面包覆密度(％)。图6示出了在反应体系中添加的BNP量(pg)与表面包覆密度(％)的关系。如图6所示那样，随着BNP量(pg)的增加，表面包覆密度(％)增加，显示出一定的浓度依赖性。 

(4)吸附稳定性的验证 

对于粒径不同的3种磁性微粒，比较验证对基板的吸附稳定性。对与上述同样条件的孔分别加入KY2-柠檬酸包覆的微粒复 合体(粒径约27nm)、KY2-FG珠复合体(粒径约200nm)、和KY2-DYNA珠复合体(粒径2.8μm)，在使磁力沿着与金基板表面垂直的方向作用的状态下反应10分钟后，对各反应体系算出表面包覆密度(％)。并且，对于另外调制的同样的3个反应体系，一边在ELISA用板振荡器(NISSIN)上振荡、一边反应10分钟，然后算出各反应体系的表面包覆密度(％)。下述表2示出了上述3种复合体的表面包覆密度(％)。并且，图7以柱状图示出了表2的结果。 

[表2] 

如表2和图7所示那样，关于使用了KY2-DYNA珠复合体(粒径2.8μm)的反应体系，尽管进行了磁引导但仅显示出较低的表面包覆密度(％)，与此相对，使用了KY2-柠檬酸包覆的微粒复合体(粒径约27nm)和KY2-FG珠复合体(粒径约200nm)的反应体系，与KY2-DYNA珠复合体(粒径2.8μm)相比均显示出约200倍以上的表面包覆密度(％)。 

另外，将反应时振荡的反应体系与不振荡的反应体系进行比较的话，使用了KY2-DYNA珠复合体(粒径2.8μm)的反应体系在振荡的情况下与不振荡的反应体系相比，表面包覆密度(％)为约五分之一，与此相对，使用了KY2-柠檬酸包覆的微粒复合体(粒径约27nm)、KY2-FG珠复合体(粒径约200nm)的反应体系，表面包覆密度(％)不会因有无振荡而产生显著性差异。由以上结果显示，本发明的生物传感方法中，通过使 用粒径为μm级的磁性微粒，实现了高密度的微粒的吸附，另外一度形成的抗原抗体间的结合不会因伴随洗涤工序等的冲量的影响而解离，因而不易产生传感误差。 

(实施例2) 

本实施例中，以DNA杂交作为反应模型体系。在具备荧光的粒径200nm的FG珠上固定35碱基的单链DNA(TSUKUBAOLIGO SERVICE CO.，LTD.)，调制DNA-荧光FG珠复合体。在玻璃基板(5mm×5mm)表面上吸附固定于FG珠的单链DNA的互补链DNA(35碱基)，并使其固相化。在48孔板的孔内放置固定有互补链DNA的玻璃基板，用200μL的反应溶液(10mMHepes(pH7.9)，50mM KCl，1.0mM EDTA，0.1％Tween20)填满。以不同的密度(DNA分子数/1μm见方)对浸渍在反应溶液中的玻璃基板添加DNA-荧光FG珠复合体，一边使磁铁从48孔板的下方接近、一边用ELISA用板振荡器(NISSIN)振荡1分钟。用洗涤溶液(10mM Hepes(pH7.9)，50mM KCl，1.0mM EDTA，0.1％Tween20)洗涤3次后，通过荧光显微镜观察吸附在玻璃基板上的DNA-荧光FG珠复合体，测定荧光计数值。图8示出了在反应体系中添加的DNA-荧光FG珠复合体的密度(DNA分子数/1μm见方)与荧光计数值的关系。如图8所示那样，随着DNA-荧光FG珠复合体的密度的增加，荧光计数值增加，显示出一定的浓度依赖性。 

产业上的可利用性

如以上所说明的那样，根据本发明，提供一种新型的生物传感方法作为磁性颗粒在生物传感中的新的应用开发，该方法利用了其作为标记的优越性，同时也良好地改善了生物传感的处理量。本发明的生物传感方法在生物化学研究领域、临床检测领域等中可期待有助于操作的高效化。

附图说明

图1为以时间序列示出应用了本发明的夹心法ELISA的反应体系的图。 

图2为示出本发明的生物传感方法中的洗涤工序的图。 

图3为示意性示出从癌患者采集的组织切片的图。 

图4为示出对于癌患者的组织切片使用本发明的生物传感法研究有无癌细胞的步骤的图。 

图5为示出FG珠的表面包覆密度(％)与反应时间的关系的图。 

图6为示出在反应体系中添加的BNP量(pg)与表面包覆密度(％)的关系的图。 

图7为示出磁性颗粒的粒径与表面包覆密度(％)的关系的图。 

图8为示出在反应体系中添加的DNA-荧光FG珠复合体的密度与荧光计数值的关系的图。 

图9为以时间序列示出以往的夹心法ELISA的步骤的图。 

图10为以时间序列示出以往的使用磁性微粒的夹心法ELISA的步骤的图。 

附图标记说明

10…夹心法ELISA的反应体系，12…试样溶液，14…抗原，16…蛋白质，18…蛋白质，20…第1抗体，22…基板，24…第2抗体，26…磁性微粒，28…抗体-磁性微粒复合体，30…磁产生部，42…患者，44…组织切片，46…载玻片，48…癌细胞，50…蛋白质分子，52…抗体，54…磁性微粒，56…反应容器，58…磁产生部 

Claims (13)

1.一种利用亲和反应的生物传感方法，

其特征在于，该方法将所述亲和反应中的配体固定在磁性微粒上，并将该磁性微粒朝向所述亲和反应的反应场强制性磁引导。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括一边振荡所述反应场、一边洗涤的工序。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括一边将所述磁性微粒向远离所述反应场的方向磁引导、一边洗涤的工序。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，所述磁性微粒的平均粒径为3～400nm。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，所述磁性微粒为聚合物包覆磁性微粒。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，所述磁性微粒为被含有官能团的分子包覆的磁性微粒。

7.根据权利要求5或6所述的方法，所述磁性微粒为具备荧光功能的微粒。

8.根据权利要求5所述的方法，所述聚合物包覆磁性微粒为在聚合物层导入了荧光物质的磁性微粒。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，使用磁传感器进行传感。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，使用光学检测器进行传感。

11.根据权利要求10所述的方法，所述光学检测器为荧光检测器。

12.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，利用使用了表面等离子共振法的SPR传感器或使用了石英晶体微天平法的质量检测传感器进行传感。

13.一种生物传感装置，其特征在于，该生物传感装置利用了亲和反应，且具备磁引导单元，所述磁引导单元用于将固定有所述亲和反应的配体的磁性微粒朝向所述亲和反应的反应场强制性磁引导。

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