CN101940574A - 儿茶素类物质联合后与抗菌药物的联合的应用 - Google Patents

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郑江
覃容欣
肖康康
蒋为薇
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Abstract

本发明涉及一种儿茶素类物质中的中任意两种或三种联合后再与抗生素的联合在制备抗菌药物中的应用。将儿茶素类物质联合再与抗生素的联合应用到抗MRSA领域，可以提供药物的抗菌增敏作用，不仅拓宽儿茶素类物质的用途，拓宽其应用方案，而且可以减轻现有抗菌药物的滥用而导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产生耐药的现象。

Description

儿茶素类物质联合后与抗菌药物的联合的应用
技术领域
本发明涉及药物应用领域，尤其涉及儿茶素和表没食子儿茶素或者表儿茶素没食子酸酯中任意两者或三种联合后再与抗生素的联合在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
自1961年发现了第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)后，20世纪80年代至今MRSA已成为全球医院感染的重要病原菌。MRSA对包括对青霉素、头孢菌素和头霉素类等β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类、喹诺酮类甚至糖肽类抗菌药物都存在不同程度的耐药。因此，寻找克服耐药机制的办法、发现新的作用靶位及开发新的抗生素迫在眉睫。
MRSA的耐药性主要与其产生一种亲和力低的特殊青霉素结合蛋白2a(PBP2a)有关，在抗菌浓度的抗生素存在情况下能替代其他几种被抗生素抑制的PBP发挥生理功能，以维持细菌的正常生长，从而表现出对多种抗生素的耐药性。因此，目前国外许多制药企业均将PBP2a作为新的抗菌药物开发的靶点。
儿茶素类物质是广泛存在于茶等天然植物中具有广泛生物学活性的一类物质，主要包括儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。研究表明儿茶素类物质具有抗肿瘤、抗基因突变、抗菌、消炎、抗动脉粥样硬化等多种生物学功能。
大量的研究表明，来源于茶中的儿茶素在高浓度情况下具有一定的抑菌效果。儿茶素能抑制葡萄糖基转移酶，减少葡聚糖的生成量，干扰菌体需糖黏连，对伤寒杆菌、副伤寒杆菌、黄色溶血性葡萄球菌、金黄色链球菌和痢疾等多种病原细菌具有明显的抑制作用。
申请人在前期研究中，以PBP2a为靶点，采用生物传感器技术从一百多种具有抗感染与抗炎作用的中药中筛选得到具有抗菌增敏活性的物质；并从山楂组分中纯化出一个具有显著抗菌增敏作用的组分，对其进行成分分析后发现其由三个物质组成，分别为儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯。曾经有文献报道，使用一种儿茶素类物质与抗生素联合应用可用于MRSA治疗，但是其效果均不好，限制了儿茶素类物质在抗菌增敏应用方面的推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种儿茶素、表没食子儿茶素和儿茶素酸酯中任意两者或三种联合后再与抗生素的联合在制备抗菌药物中的应用。将儿茶素类物质联合再与抗生素的联合应用到抗MRSA领域，可以提供药物的抗菌增敏作用，不仅拓宽儿茶素类物质的用途，拓宽其应用方案，而且可以减轻现有抗菌药物的滥用而导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌产生耐药的现象。
本发明的技术方案是：
儿茶素类物质中的中任意两种或三种联合后再与抗生素的联合在制备抗菌药物中的应用。
儿茶素与表没食子儿茶素的质量比为2∶1～1∶2，儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为2∶1～8∶1，儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为4∶1∶1～8∶1∶1。
所述儿茶素类物质为儿茶素、表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸酯。
所述抗生素为青霉素类、头孢菌素类中的任意一种。
所述青霉素抗生素为青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、舒氨西林。
所述头孢菌素类抗生素包括头孢呋辛、头孢匹胺。
基于上述目的，本发明使用的技术方案是将儿茶素类物质中的两种与抗MRSA药物中的一种进行联合应用，该应用不是做为疾病的治疗方法的应用，而是在配备治疗疾病(抗MRSA)的药物中的应用，其中儿茶素和表没食子儿茶素的质量比为2∶1～1∶2，儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的质量比为2∶1～8∶1，儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为4∶1∶1～8∶1∶1。当儿茶素和表没食子儿茶素的质量比为1∶2，儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的质量比为2∶1，当儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为4∶1∶1能够以最小的药物量取得最优的抗菌增敏效果。上三种成分可以制备成组合物，也可以是三种单独的药剂。上述成分能够产生协同抗MRSA效力，能够降低抗MRSA药物的最低抑菌浓度(MIC)。
上述儿茶素类物质的联合包括包括儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的联合、儿茶素与表没食子儿茶素的联合，儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的联合；上述抗生素为β-内酰胺类抗生素抗生素，如青霉素类、头孢菌素类。在一较佳实施例中，上述抗菌药物为青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、头孢呋辛、头孢匹胺、舒氨西林，优选为苯唑西林和氨苄西林。
儿茶素单独使用可抑制部分革兰阴性菌和革兰阳性菌的生长，与抗菌药物联合应用后可明显增强抗菌药物的抗菌效力，但这种抗菌增敏在MRSA上却没有很好的效果。通过实验。申请人发现当联用儿茶素和表儿茶素没食子酸酯，联用儿茶素和表没食子儿茶素，联用儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯后再与抗生素联用，可明显减少抗MRSA药物的使用剂量；同时实验还表明儿茶素和表儿茶素没食子酸酯，联用儿茶素联合表没食子儿茶素，联用儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯后再与抗生素联用可明显降低MRSA菌攻击导致的小鼠死亡率，显著抑制小鼠血中细菌的含量。
因此，本发明拓宽了儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素的新用途，提高了抗菌药物的抗菌效力，减轻了抗菌药物滥用和导致的耐药现象。
申请人在实验中发现当这三个组分组合在一起时对β-内酰胺类抗生素对MRSA的抗菌效果具有明显的增敏效应，但将这三个组分分开后抗菌增敏效应则基本消失。通过实验我们进一步发现，单纯一种儿茶素类物质与抗生素联合并不能取得良好的抗菌增敏作用，但是当两种或三种儿茶素类物质与抗生素联合后则具有很强的抗菌增敏作用，上述研究成果则未见如何研究报告。
鉴于MRSA对许多抗菌药物都存在不同程度的耐药、两种或三种儿茶素类物质与抗生素联合具有很强的抗菌增敏作用，因此采用天然的具有抗菌增敏活性的药物来增强抗菌药物对MRSA的抗菌活性具有非常重要的临床应用价值。
附图说明
图1表示C联合ECG协同氨苄西林(AMP)、苯唑西林(OXA)对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌WHO-2的联合抑菌曲线。
图2表示C联合EGC协同氨苄西林(AMP)、苯唑西林(OXA)对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌WHO-2的联合抑菌曲线。
图3表示C、EGC、ECG三者联合协同氨苄西林(AMP)、苯唑西林(OXA)对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌WHO-2的联合抑菌曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
当儿茶素和表没食子儿茶素的质量比为2∶1～1∶2，儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的质量比为2∶1～8∶1，儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为4∶1∶1～8∶1∶1。尤其当儿茶素和表没食子儿茶素的质量比为1∶2，儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的质量比为2∶1，当儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为4∶1∶1时能够以最小的药物量取得最优的抗菌增敏效果。
实施例1
本实验例在于研究儿茶素类物质与多种β-内酰胺类抗生素对不同细菌的MIC(最低抑菌浓度)和MBC(最低杀菌浓度)。
采用微孔稀释法，调整细菌浓度为105CFU/ml，接种于96孔无菌培养板内。C、ECG、EGC、青霉素钠、氨苄西林等15种药物分别以生理盐水稀释为5.12mg/ml。加入各种药物至含细菌培养孔内，依次倍比稀释，第1～11孔药物的最终浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5ug/ml。置37℃培养箱孵育24h和48h，读取阳性和阴性对照孔，阴性对照孔清亮，阳性对照孔混浊。药物对细菌的MIC为24h后抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度，药物对细菌的MBC为48h后抑制细菌肉眼可见生长的最低药物浓度。此次实验结果表明C、ECG、EGC单独使用不能完全抑制细菌生长，并观察了不同药物对该细菌的抑菌效力。(见表1)。
表1 15种抗生素和儿茶素类物质的单独使用时对MRSA WHO-2的MIC及MBC
Figure BSA00000202616300051
实施例2
本实验例在于研究C、ECG、EGC分别与OXA联合应用后对MRSA WHO-2MIC和MBC的影响。
采用棋盘式微孔稀释法，调整细菌浓度为105CFU/ml，接种于96孔无菌培养板内，观察配伍后的药物对WHO-2的MIC和MBC。此次实验结果表明C、ECG、EGC分别与OXA联合应用后也不能降低抗菌药物的MIC和MBC，或仅有较低的增敏效应(如OXA+C 64μg/ml，OXA+ECG 16μg/ml，FICI均为0.5)。(见表2)。
表2 C、ECG、EGC分别与OXA协同后的OXA MIC/MBC
Figure BSA00000202616300052
实施例3
本实验例在于研究C与ECG、C与EGC两药联合或C、ECG与EGC三药联合后与OXA联合应用后对MRSA WHO-2MIC的影响。
采用棋盘式微孔稀释法，调整细菌浓度为105CFU/ml，接种于96孔无菌培养板内，观察配伍后的药物对WHO-2的MIC。此次实验结果表明尽管不论是单独使用C、ECG、EGC，或者他们分别与OXA联合应用后均不能降低抗菌药物的MIC，但C与ECG、C与EGC两药联合或C、ECG与EGC三药联合后再与OXA联合应用后对MRSA WHO-2的MIC有显著的降低效果。(见表3、4、5)
表3不同浓度C联合ECG与OXA协同使用时抗菌药物对MRSA WHO-2的MIC(μg/ml)
Figure BSA00000202616300061
表4不同浓度C联合EGC与OXA协同使用时抗菌药物对MRSA WHO-2的MIC(μg/ml)
Figure BSA00000202616300062
表5不同浓度C、EGC、ECG联合后与OXA协同使用时抗菌药物对MRSA WHO-2的MIC(μg/ml)
Figure BSA00000202616300063
实施例4
本实验例在于研究C与ECG、C与EGC联合后与青霉素G、氨苄西林、头孢呋辛、头孢匹胺、舒氨西林联合应用后对MRSA WHO-2MIC的影响。
采用棋盘式微孔稀释法，调整细菌浓度为105CFU/ml，接种于96孔无菌培养板内，观察配伍后的药物对WHO-2的MIC和MBC。
表6 7种抗生素和两种儿茶素类物质联合使用时对MRSA WHO-2的MIC
Figure BSA00000202616300071
实施例5
本实验例在于研究C与ECG联合应用β-内酰胺类抗生素对WHO-2攻击小鼠的保护作用。
清洁级昆明种小白鼠90只(第三军医大学实验动物中心提供)，体重19.9±0.5g/只，雌雄各半，随机分为对照组、WHO-2组、WHO-2+OXA组，WHO-2+C组，WHO-2+ECG组，WHO-2+C+ECG组、WHO-2+OXA+C组、WHO-2+OXA+ECG组、WHO-2+OXA+C+ECG组。每组10只动物。对照组不给予任何细菌或药物；WHO-2组，给予6×109/kg活的WHO-2菌；WHO-2+OXA组，给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+C组，给菌后4h开始给予C80mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+ECG组，给菌后4h开始给予ECG40mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+C+ECG组，给菌后4h开始给予C80mg/kg/day，ECG 40mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+C组，给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day，C80mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+ECG组，给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day，ECG40mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+C+ECG组：给菌后4h开始200mg/kg/day，C 80mg/kg/day，ECG40mg/kg/day肌肉注射。所有药物每天给药2次，每12小时一次，直至小鼠死亡或到第7天止。给予正常饮食和饮水，观察7天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示论是单独使用C、ECG，或者他们分别与OXA联合应用后均不能降低小鼠的死亡数，但C与ECG联合后再与OXA联合应用后(见表7)则明显降低小鼠的死亡率。
表7C联合ECG与OXA协同使用时对MRSA WHO-2攻击小鼠的保护作用
Figure BSA00000202616300081
实施例6
本实验例在于研究C与EGC联合应用β-内酰胺类抗生素对WHO-2攻击小鼠的保护作用。
清洁级昆明种小白鼠90只，体重19.9±0.5g/只，雌雄各半，随机分为对照组、WHO-2组、WHO-2+OXA组，WHO-2+C组，WHO-2+EGC组，WHO-2+C+EGC组、WHO-2+OXA+C组、WHO-2+OXA+EGC组、WHO-2+OXA+C+EGC组。每组10只动物。对照组不给予任何细菌或药物；WHO-2组，给予6×109/kg活的WHO-2菌；WHO-2+OXA组，给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+C组，给菌后4h开始给予C 40mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+EGC组，给菌后4h开始给予EGC80mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+C+EGC组，给菌后4h开始给予C40mg/kg/day，EGC 80mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+C组，给菌后4h开始给予OXA 200mg/kg/day，C 40mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+EGC组，给菌后4h开始给予OXA 200mg/kg/day，EGC80mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+C+EGC组：给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day，C 40mg/kg/day，EGC 80mg/kg/day肌肉注射。所有药物每天给药2次，每12小时一次，直至小鼠死亡或到第7天止。给予正常饮食和饮水，观察7天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示论是单独使用C、EGC，或者他们分别与OXA联合应用后均不能降低小鼠的死亡数，但C与EGC联合后再与CXA联合应用后(见表8)则明显降低小鼠的死亡率。
表8C联合EGC与OXA协同使用时对MRSA WHO-2攻击小鼠的保护作用
实施例7
本实验例在于研究C、ECG、EGC联合应用β-内酰胺类抗生素对WHO-2攻击小鼠的保护作用。
清洁级昆明种小白鼠110只(第三军医大学实验动物中心提供)，体重19.9±0.5g/只，雌雄各半，随机分为对照组、WHO-2组、WHO-2+OXA组，WHO-2+C组，WHO-2+ECG组，WHO-2+EGC组，WHO-2+C+ECG+EGC组、WHO-2+OXA+C组、WHO-2+OXA+ECG组、WHO-2+OXA+EGC组、WHO-2+OXA+C+EGC+ECG组。每组10只动物。对照组不给予任何细菌或药物；WHO-2组，给予6×109/kg活的WHO-2菌；WHO-2+OXA组，给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+C组，给菌后4h开始给予C30mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+ECG组，给菌后4h开始给予ECG 20mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+EGC组：给菌后4h开始给予EGC 20mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+C+ECG+EGC组，给菌后4h开始给予C 80mg/kg/day，ECG 20mg/kg/day，EGC 20mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+C组，给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day，C80mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+ECG组，给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day，ECG20mg/kg/day肌肉注射；WHO-2+OXA+EGC组：给菌后4h开始给予OXA200mg/kg/day，EGC20mg/kg/day；WHO-2+OXA+C+EGC+ECG组：OXA200mg/kg/day，ECG20mg/kg/day，C80mg/kg/day，EGC20mg/kg/day肌肉注射。所有药物每天给药2次，每12小时一次，直至小鼠死亡或到第7天止。给予正常饮食和饮水，观察7天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示论是单独使用C、ECG、EGC，或者他们分别与OXA联合应用后均不能降低小鼠的死亡数，但C、ECG、EGC联合后再与OXA联合应用后(见表9)则明显降低小鼠的死亡率。
表9C、ECG、EGC联合后与OXA协同使用对MRSA WHO-2攻击小鼠的保护作用
Figure BSA00000202616300101
实施例8
本实验例在于研究C与ECG联合应用抗菌药物对WHO-2攻击小鼠的血中细菌数量的影响。
清洁级昆明种小白鼠54只，体重20.3±0.9g/只，雌雄各半，随机分为对照组、WHO-2组、WHO-2+OXA组，WHO-2+C组，WHO-2+ECG组，WHO-2+C+ECG组、WHO-2+OXA+C组、WHO-2+OXA+ECG组、WHO-2+OXA+C+ECG组。每组6只动物。药物处理同实验例4，给药后12小时小鼠眼眶无菌取血并涂抹于含有OXA100μg/ml的琼脂平板上，并于第24小时计数菌落数。结果显示论是单独使用C、ECG，或者他们分别与OXA联合应用后可略微减少小鼠血液中的细菌数量，但C与ECG联合后再与OXA联合应用后(见表10)则可明显减少小鼠血液中的细菌数量。
表10C联合EGC与OXA协同使用对MRSA WHO-2攻击小鼠血中细菌数量的影响
Figure BSA00000202616300111

Claims (6)

1.一种儿茶素类物质中的中任意两种或三种联合后再与抗生素的联合在制备抗菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述儿茶素类物质为儿茶素、表没食子儿茶素和儿茶素酸酯。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：儿茶素与表没食子儿茶素的质量比为2∶1～1∶2，儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为2∶1～8∶1，儿茶素、表没食子儿茶素与表儿茶素没食子酸酯的质量比为4∶1∶1～8∶1∶1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗生素为青霉素类、头孢菌素类中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述青霉素类抗生素包括青霉素G、氨苄西林、苯唑西林、舒氨西林。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述头孢菌素类抗生素包括头孢呋辛、头孢匹胺。
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