CN115844861A - 原儿茶醛抑制mrsa的用途及降低mrsa耐药性的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了原儿茶醛抑制MRSA的用途及降低MRSA耐药性的药物，属于药物化学技术领域。本发明证明原儿茶醛对MRSA具有较好的抑菌活性，且能够降低MRSA对β‑内酰胺类抗生素的耐药性，从而在MRSA抑菌、药物联用以及降低MRSA耐药性产生方面存在重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及原儿茶醛抑制MRSA的用途及降低MRSA耐药性的药物。
背景技术
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种常见的院内感染致病菌，通常会引起伤口化脓感染，皮肤感染，主要发生人群为外科手术患者以及糖尿病并发症患者等。因其容易产生抗生素耐药性，临床上使用抗生素，例如β-内酰胺类抗生素等，来治疗MRSA的效果较差，且MRSA的耐药性逐步增强。因此开发天然抗MRSA活性物质对于治疗MRSA引起的感染意义重大。
发明内容
本发明证明原儿茶醛对MRSA具有较好的抑菌活性，且能够提高β-内酰胺类抗生素对MRSA的抑制作用，从而在MRSA抑菌、药物联用以及降低MRSA耐药性产生方面存在重要应用价值。
本发明提出如下技术方案：
本发明提供了原儿茶醛在防治MRSA和/或MRSA引起的疾病中的应用。上述应用可具体表现为原儿茶醛在制备防治MRSA和/或MRSA引起的疾病的药物中的应用。
在上述应用中，所述药物除了含有原儿茶醛外，还可包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。所述药物的剂型可选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。当药物的剂型为液体剂型时，所述药物中原儿茶醛的浓度，在药学可接受范围内，可优选自1μg/mL以上，例如可以是1μg/mL、2μg/mL、64μg/mL、256μg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL等等。
本发明提供了原儿茶醛在提高β-内酰胺类抗生素对MRSA的抑制效果中的应用。
本发明提供了原儿茶醛在降低MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药性中的应用。
上述β-内酰胺类抗生素，优选为氨苄青霉素。
本发明提供了一种组合物，由原儿茶醛和β-内酰胺类抗生素组成；优选地，由原儿茶醛和氨苄青霉素组成。所述原儿茶醛和氨苄青霉素的质量比选自64:1。
上述组合物在其比例下对MRSA存在协同作用，基于此，本发明提供了上述组合物在防治MRSA和/或MRSA引起的疾病中的应用。上述应用可具体表现为上述组合物在制备防治MRSA和/或MRSA引起的疾病的药物中的应用。
本发明提供了一种药物，所述药物含有上述组合物。该药物还可包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。所述药物的剂型可选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。
本发明的有益效果为：
本发明证明原儿茶醛对MRSA具有较好的抑菌活性，且能够提高β-内酰胺类抗生素对MRSA的抑制作用，从而在MRSA抑菌、药物联用以及减缓MRSA耐药性产生方面存在重要应用价值。
附图说明
图1为不同浓度原儿茶醛处理下的MRSA生长曲线；
图2为在经原儿茶醛处理后MRSA的微观结构变化；其中，A图为水处理后的扫描电镜图，B图为原儿茶醛(4mg/mL)处理后的扫描电镜图，C图为水处理后的投射电镜图，D图为原儿茶醛(4mg/mL)处理后的投射电镜图；
图3为经原儿茶醛(4mg/mL)处理后MRSA的核酸发生泄漏；
图4为原儿茶醛(4mg/mL)对MRSA细菌K+泄漏的影响；其中，E图为K+标准曲线，F图为MRSA胞外吸光度值(OD766.5)，G图为经原儿茶醛处理30min后MRSA胞外K+浓度；
图5为原儿茶醛(4mg/mL)对MRSA胞内胞外ATP含量的影响；
图6为原儿茶醛(4mg/mL)对MRSA细菌膜渗透性的影响；
图7为经原儿茶醛(4mg/mL)处理后MRSA的氧化应激损伤；
图8为原儿茶醛(4mg/mL)对MRSA生物膜的影响；其中，A图为对MRSA生物膜的形成影响，B图为对MRSA已形成的生物膜的影响；
图9为原儿茶醛与MRSA的特异性结合试验；其中，A图为频率(f)变化；B图为重量(Weight)变化。
具体实施方式
本发明中所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
抑菌圈试验：
采用倾注平板法和抑菌圈法测定原儿茶醛对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌作用。首先配制2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL的原儿茶醛水溶液。再将保藏管中的菌种接种到LB营养肉汤中，在37℃，150rpm的条件下，水浴振荡活化24h，得到活化的MRSA。取一定量菌液到无菌离心管中，在4℃下8000r/min离心10min，使用PBS(0.01M，PH＝7.4)洗涤3次，随后复溶，用PBS稀释得到浓度为1×105CFU/mL的菌悬液。取700μL菌悬液加入至融化后稍放凉的LB琼脂培养基中，轻轻摇晃混合均匀，使最终细菌浓度为1×103CFU/mL，向平板中快速倒入35mL含菌LB培养基，自然凝固得到含菌平板，使用8mm打孔器打出5孔，分别加入水，庆大霉素，2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL原儿茶醛溶液各200μL，正置放入37℃恒温培养箱中培养12h，使用全自动菌落计数器的测量抑菌圈功能来测量含菌平板的抑菌圈直径，实验设置三个平行。
试验结果如表1所示：
表1
| 处理组 | MRSA抑菌圈直径(mm) |
| 水 | 0 |
| 庆大霉素 | 13.4±0.17 |
| 原儿茶醛(2mg/mL) | 23.1±0.741 |
| 原儿茶醛(4mg/mL) | 28.4±0.741 |
| 原儿茶醛(8mg/mL) | 31.9±0.294 |
由表1可知，2mg/mL、4mg/mL和8mg/mL的原儿茶醛处理组均具有明显的抑菌圈，且大于庆大霉素处理组的抑菌圈，而水处理组没有抑菌圈，这说明，原儿茶醛能够有效抑制MRSA的生长，且抑制效果要优于庆大霉素。此外，随着原儿茶醛浓度的增加，抑菌圈直径也显著增加(P<0.05)，这表明，原儿茶醛对MRSA的抗菌活性呈浓度依赖性。
实施例2
生长曲线试验：
按照上述同等操作活化MRSA细菌，随后用PBS稀释得到浓度为1×108CFU/mL的菌悬液。使用全自动生长曲线测定仪测定MRSA生长曲线，在超净台中打开仪器配套的48孔板，整个实验为1mL体系，向其中分别加入水，庆大霉素1mg/mL，原儿茶醛(10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL)各100μL，再加入900μL LB培养基，混合均匀，使得孔中庆大霉素终浓度为100μg/mL，原儿茶醛终浓度为1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL。再向各孔加入10μL菌悬液，使得菌浓度最终为1×106CFU/mL，各浓度实验设置六平行。将48孔板放入仪器中，开启冷却装置，温度设置在25℃，设置温度37℃，转速800rpm，测量时间间隔为2h。待水处理组细菌OD600达到最高点趋平，停止实验，导出数据。
试验结果如图1所示：
由上述试验结果可知，与阴性对照组相比，所有原儿茶醛处理组的OD600值显著下降(P<0.05)。除1mg/mL原儿茶醛处理组在培养12h后观察到MRSA的轻微生长趋势外，其它原儿茶醛处理组可以完全抑制MRSA的生长，在图中显示为一条水平线。在综合考量后，选择4mg/mL原儿茶醛作为以下实验的处理条件。
实施例3
原儿茶醛处理后MRSA的微观结构变化：
1、扫描电镜
扫描电镜(SEM)结果(图2A，图2B)表明，在对照组中，经水处理的MRSA表现为球形或椭圆形，表面均光滑。相比之下，经原儿茶醛处理的MRSA则显示出不规则的形状、表面凹陷和褶皱以及更粗糙的表面，此外，细菌破裂并聚集，细菌的完整性受损。
2、透射电镜
透射电镜(TEM)结果(图2C，图2D)表明，在对照组中，经水处理的MRSA表现为球形且完整。然而，在经原儿茶醛处理后，细菌被裂解，细菌的整个结构被破坏，细胞质已经泄漏。
实施例4
原儿茶醛对MRSA细菌膜通透性的影响：
1、核酸泄漏
采用紫外分光光度计，测量经原儿茶醛处理的MRSA上清液在260nm处的紫外吸收强度，以水处理为对照。在260nm处测量的波长吸收光值与核酸含量是成比例的，因此可用于表示DNA泄漏情况。测量结果如图3所示，经水处理的MRSA细菌，在260nm处的吸光度值非常低，而经原儿茶醛处理后，MRSA细菌在260nm处的吸收值显著增加，这表明，原儿茶醛处理能够导致MRSA的DNA泄漏。
2、K+泄漏
采用原子吸收分光光度法验证原儿茶醛对MRSA细菌K+的影响，并在766.5nm处测量MRSA胞外吸光度，以水处理为对照。测量结果如图4所示，经原儿茶醛处理后，MRSA体内的K+发生泄漏，与对照组相比，MRSA泄漏的K+浓度显著增加。这表明，原儿茶醛可以改变细胞膜的通透性，并促进MRSA细胞释放K+。
3、ATP泄漏
对原儿茶醛处理后MRSA细胞内和细胞外的ATP含量进行测定，以水处理为对照，测定结果如图5所示，与对照组相比，经原儿茶醛处理的MRSA的细胞内ATP含量呈下降趋势，而细胞外ATP的含量呈上升趋势，这表明，原儿茶醛可导致MRSA损伤，发生ATP泄漏，从而影响MRSA内ATP的含量。
4、细菌细胞膜通透性分析
PI和SYTO-9是两种核酸染料。当单独使用PI时，它只能穿透细胞膜破裂的细菌并显示红色荧光，而当单独使用SYTO-9时，细胞膜完整或受损的细菌都被绿色荧光染色。然而，当它们组合使用时，PI的红色荧光可以掩盖SYTO-9的绿色荧光。因此，具有红色荧光的细菌越多，细菌的膜渗透性越高。基于此，对原儿茶醛处理的MRSA进行染色，以水处理为对照，来分析细菌细胞膜通透性。
试验结果如图6所示，对照组中几乎所有细菌都显示绿色荧光，而经原儿茶醛处理后，一些细菌显示红色荧光，这表明，原儿茶醛处理导致MRSA细菌的膜渗透性增加。而且，随着原儿茶醛处理时间的延长，可以观察到更多的细菌被红色荧光染色。
实施例5
MRSA氧化应激反应：
在正常情况下，细胞内ROS是正常生理代谢的产物，ROS的产生和消除处于动态平衡状态，不会对细胞本身造成损害。为了确定MRSA在经原儿茶醛处理后的ROS含量，使用DCFH-DA方法测定所得的细胞内ROS含量，以水处理为对照组。由此产生的细胞内ROS含量，如图7所示，经4mg/mL原儿茶醛处理后，细菌在488nm处的荧光强度显著上升，这表明，细菌受到刺激，其抗氧化防御系统失衡，进入氧化应激状态。当外源ROS的渗透和内部抗氧化防御系统的崩溃时，会导致细胞内ROS含量的急剧增加，从而导致细胞损伤甚至死亡。
实施例6
生物膜敏感性实验：
1、原儿茶醛对MRSA生物膜的形成影响
按照上述实验条件活化细菌，随后在4℃、8000rpm条件下离心10min，PBS清洗三次，用PBS调整菌浓度为2×108CFU/mL。因细菌生物膜可以黏附在聚苯乙烯上，因此使用以聚苯乙烯为底的无菌96孔板进行实验。实验体系为200μL体系，在超净工作台中，用移液枪吸取100μL菌悬液加入96孔板中，再向孔中加入100μL浓度为20mg/mL、16mg/mL、12mg/mL、8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL的原儿茶醛，使原儿茶醛在孔中终浓度为10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL。添加100μL无菌水作为阴性对照组。各浓度实验设置三个平行。37℃培养24h。培养结束后使用200μL无菌水清洗三次96孔板，在超净工作台中自然风干，使用甲醇固定30min，再用无菌水洗三次，结晶紫染色10min后，再用95％乙醇脱色30min，使用酶标仪测OD595处吸光度值。
2、原儿茶醛对MRSA已形成的生物膜影响
按照上述实验条件活化细菌，随后在4℃、8000r条件下离心10min，PBS清洗三次，使用LB培养基稀释菌悬液，调整菌浓度为1×106CFU/mL。同样使用以聚苯乙烯为底的无菌96孔板进行实验，首先用移液枪吸取200μL菌悬液加入96孔板中，在37℃条件下培养24h，使MRSA产生的生物膜充分粘附在平板底部。培养完成后，倒掉孔中剩余菌悬液，200μLPBS清洗三次，去除未粘附的悬浮细胞。然后在孔中加入200μL浓度为10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL的原儿茶醛，同样在其他孔中加入200μL无菌水作为阴性对照，在37℃条件下，轻微振荡处理30min，各浓度实验设置三平行。使用上述同样的方法进行处理，甲醇固定，无菌水清洗，结晶紫染色处理，乙醇脱色，测量OD595处的吸光度值。
试验结果如图8所示：
与对照组相比，原儿茶醛可以显著降低MRSA生物膜的生物量(P<0.05)且呈现药物浓度依赖性，4mg/mL原儿茶醛的抑制率可以达到37.4％(图8B)。此外，原儿茶醛(1mg/mL原儿茶醛除外)还能显著抑制MRSA生物膜的形成(P<0.05)，且也呈现药物浓度依赖性，4mg/mL原儿茶醛的抑制率为28.5％(图8A)。
实施例7
原儿茶醛与MRSA的特异性结合试验：
通过石英晶体微天平研究原儿茶醛与MRSA之间特异性结合。将保藏管中的菌种接种到LB营养肉汤中，在37℃，150rpm的条件下，水浴振荡活化24h得到活化的MRSA。随后在4℃下8000r/min离心10min，使用PBS(0.01M，pH＝7.4)洗涤3次，PBS复溶后稀释，得到1×107CFU/mL的菌悬液。配制4mg/mL原儿茶醛并过0.22μm水系滤膜。将50μL PBS菌液滴到清洗干净的Au(金)芯片上，4℃条件下静置放置24h，保证细菌能够完全黏附在Au芯片上。然后使用超纯水缓水流冲洗芯片，去除未粘附的细菌，用氮气吹干。使用石英晶体微天平进行实验，将芯片放置在石英晶体微天平反应室中，链接仪器开始实验。首先通入空气至基线稳定，再通入超纯水至基线稳定，通过流动泵通入4mg/mL原儿茶醛溶液直至曲线平稳，进样10min，再通入超纯水进样10min后结束实验。为排除原儿茶醛与Au芯片之间的非特异性结合，使用没有粘附细菌的Au芯片作为对照组进行上述实验。
试验结果如图9所示：
当4mg/mL原儿茶醛溶液流经带有MRSA的Au芯片的表面时，频率急剧增加，直到达到稳定的信号强度。加入超纯水冲洗后，频率急剧下降，信号强度达到另一个稳定平台，信号强度低于零基线(f值为1.7962Hz)(图9A)；此外，Au芯片上重量信号的趋势与f值的趋势相同(重量为45.90ng/cm2)(图9B)。与之相反的是，当原儿茶醛溶液流经没有细菌附着到其上的Au芯片的频率也急剧增加，直到达到稳定的信号强度；然后用超纯水冲洗，频率急剧下降，直到达到零基线(图9A)，表明原儿茶醛溶液与Au芯片没有相互作用。不同的是，在整个过程中，阴性对照的重量信号几乎没有变化(图9B)。上述结果表明，f值和重量的变化是原儿茶醛和MRSA相互作用的结果，而不是由于非特异性结合。因此，可以推定原儿茶醛与MRSA之间存在特异性结合。
实施例8
联合用药试验：
将已活化的细菌在4℃、8000rpm条件下离心10min，PBS清洗三次，调整菌浓度为1×104CFU/mL。配制2048μg/mL原儿茶醛水溶液，用LB培养基2倍稀释成1024μg/mL、
512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL共12个浓度的溶液。配制2048μg/mL氨苄青霉素水溶液，随后用LB培养基2倍稀释成1024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL共12个浓度的溶液，各浓度溶液备用。
1、药物单用对MRSA的细菌生长抑制百分数(抑制率)
实验为200μL体系，用移液枪吸取100μL菌液加入96孔板各孔中，再向孔中加入100μL浓度分别为2048～1μg/mL的原儿茶醛，使原儿茶醛终浓度分别为1024～0.5μg/mL(加入后会被2倍稀释)。同样的，用移液枪吸取100μL菌液加入另一96孔板各孔中，再向孔中加入100μL浓度分别为2048～1μg/mL的氨苄青霉素，使氨苄青霉素终浓度分别为1024～0.5μg/mL。随后用移液枪吸取100μL菌液与100μL LB培养基混合加入96孔板中作为生长对照组，移液枪吸取200μL LB培养基加入96孔板中作为空白对照组，各孔中细菌的最终浓度为5×103CFU/mL，各个浓度均设置三孔做平行实验。37℃培养24h，然后使用酶标仪测定OD600吸光度值。
公式计算：
细菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/(生长对照孔OD值-空白对照孔OD值)×100％。
细菌生长抑制百分数＝1-细菌生长百分数。
测试结果显示，当原儿茶醛浓度≥256μg/mL，MRSA的抑制率可达90％以上；当氨苄青霉素浓度≥4μg/mL时，MRSA的抑制率可达90％以上。即，原儿茶醛单用时的MIC值为256μg/mL，记为MIC原儿茶醛(单独)；氨苄青霉素单用时的MIC值为4μg/mL，记为MIC氨苄青霉素(单独)。
2、药物联用对MRSA的细菌生长抑制百分数(抑制率)
通过棋盘式稀释法计算原儿茶醛和氨苄青霉素联合作用于MRSA时的细菌生长抑制百分数。将浓度为1024μg/mL的原儿茶醛水溶液，采用LB培养基2倍稀释至浓度为512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL。将浓度为16μg/mL的氨苄青霉素水溶液，LB培养基2倍稀释至浓度为8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL。
实验为200μL体系，用移液枪吸取100μL菌悬液加入96孔板中，再向孔中加入50μL浓度分别为1024～16μg/mL的原儿茶醛，使原儿茶醛终浓度分别为256～4μg/mL，再向孔中加入50μL浓度分别为16～0.0625μg/mL的氨苄青霉素，使氨苄青霉素终浓度分别为4～0.015625μg/mL。
两种不同的抗菌化合物在孔中的搭配方式，例如，原儿茶醛+氨苄青霉素：256μg/mL+4μg/mL、256μg/mL+2μg/mL、128μg/mL+4μg/mL、128μg/mL+2μg/mL……4μg/mL+0.015625μg/mL，以此类推，并穷尽上述各浓度下的搭配可能。
采用移液枪吸取100μL菌悬液与100μL LB培养基混合加入96孔板中作为生长对照组，采用移液枪吸取200μL LB培养基加入96孔板中作为空白对照组，各个浓度均设置三孔做平行实验。
将上述各组置于37℃中培养24h，培养完成后使用酶标仪测定OD600吸光度值，使用上述公式，计算原儿茶醛和氨苄青霉素联合作用于MRSA的细菌生长抑制百分数。
测试结果显示，当原儿茶醛浓度≥64μg/mL，且氨苄青霉素浓度≥1μg/mL时，联用药物对MRSA的抑制率大于90％。即，该联用药物的MIC值为64μg/mL+1μg/mL，取64μg/mL作为药物联用环境中原儿茶醛的MIC值，记为MIC原儿茶醛(联合)；取1μg/mL作为药物联用环境中氨苄青霉素的MIC值，记为MIC氨苄青霉素(联合)。
3、两种药物联合作用效果评价
运用Loewead－ditivity(LA)理论，比较原儿茶醛、氨苄青霉素单用和两种药物联用时产生相同药效的浓度差别。FICI法是以LA理论为基础的联合作用的评价方法。
计算公式如下：
式中，MIC被定义为与阴性对照组相比，抑制90％以上细菌的最低浓度；MIC原儿茶醛(单独)和MIC氨苄青霉素(单独)分别表示原儿茶醛和氨苄青霉素单用时的MIC值；MIC原儿茶醛(联合)和MIC氨苄青霉素(联合)分别表示两种药物联用时各自的MIC值。
计算得出的数值FIC定义为FIC指数(FICI)。联合作用结果的判断依据是：FICI≤0.5为协同作用，FICI＞4为拮抗作用，0.5＜FICI≤4为无关作用。
试验结果如表2所示：
表2
由表2可知，两种药物联用的FICI为0.5，证明原儿茶醛与氨苄青霉素之间存在协同增效作用，且存在协同作用的组合物中，原儿茶醛与氨苄青霉素的最小抑菌浓度分别为64μg/mL和1μg/mL。基于上述内容可知，原儿茶醛与氨苄青霉素在质量比为64:1时对MASA存在协同抑制作用。
上述结果表明，原儿茶醛不仅自身具有MRSA抗菌活性，而且还能提高β-内酰胺类抗生素对MRSA的抑制作用，从而在降低MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药性方面具有重要价值，应用前景广阔。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (9)
1.原儿茶醛在制备防治MRSA和/或MRSA引起的疾病的药物中的应用。
2.原儿茶醛在提高β-内酰胺类抗生素对MRSA的抑制效果中的应用。
3.原儿茶醛在降低MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药性中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述β-内酰胺类抗生素为氨苄青霉素。
5.一种组合物，其特征在于，由原儿茶醛和氨苄青霉素组成，其中，原儿茶醛和氨苄青霉素的质量比选自64:1。
6.权利要求5所述组合物在制备防治MRSA和/或MRSA引起的疾病的药物中的应用。
7.一种药物，其特征在于，含有权利要求5所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂或其他介质。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型选自粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、口服液或片剂。
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Citations (3)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101940574A (zh) * | 2010-07-23 | 2011-01-12 | 中国人民解放军第三军医大学 | 儿茶素类物质联合后与抗菌药物的联合的应用 |
| CN102205126A (zh) * | 2010-07-23 | 2011-10-05 | 中国人民解放军第三军医大学 | 儿茶素类物质联合后与抗菌药物的联合的应用 |
| CN110151741A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-08-23 | 广东工业大学 | 原儿茶醛的新应用 |
| CN115381865A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-11-25 | 成都中医药大学 | 赶黄草鞣质在制备抗细菌及耐药菌药物中的用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LIANG, YUQING等: "Dual-Dynamic-Bond Cross-Linked Antibacterial Adhesive Hydrogel Sealants with On-Demand Removability for Post-Wound-Closure and Infected Wound Healing", ACS NANO, vol. 15, no. 4, pages 7078 - 7093 * |
| 肖康康等: "儿茶素类化合物增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA的作用", 中国抗生素杂志, vol. 37, no. 05, pages 397 - 400 * |
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