CN113440565B - 一种茶叶纳米点的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种茶叶纳米点的制备方法及其抗菌应用，该方法通过粉碎、提取、分离、纯化、浓缩、干燥等步骤，得到由至少六种及以上儿茶素以氢键和ππ共轭组装成的粒径～3nm的茶叶纳米点(tea nanodots,TNDs)。所述TNDs的抗菌活性和稳定性均优于相应单体小分子及单体小分子的混合物，通过小鼠皮肤MRSA伤口感染模型和MRSA感染肺炎模型研究发现，与临床抗生素万古霉素相比，TNDs具有更好的疗效。茶叶纳米点的物理穿膜和靶向细菌氨基酸代谢双重抗菌机制，不易使细菌对其产生耐药性，同时TNDs具备良好的生物相容性及体内安全性，具有一定的临床应用前景。

Description

一种茶叶纳米点的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于天然药物的功效成分提取技术领域，具体涉及一种茶叶纳米点的制备方法，以及由该茶叶纳米点制备方法制备得到的茶叶纳米点的应用。
背景技术
在中国，茶已经有超过4500年的历史，人们认为茶最早是作为一种中药材使用的，中国是世界上最大的茶叶生产国和消费国，拥有丰富的茶树资源和茶叶产品。大量研究已经表明，茶叶中的最重要的组成和主要活性成分为茶多酚，茶多酚属多酚类物质，是从茶叶中提取的多羟基酚类衍生物的混合物，它以儿茶素为主体成分，占总酚含量的60％-80％，主要由儿茶素((+)-Catechin,CA)、表儿茶素((-)-Epicatechin,EC)、儿茶素没食子酸酯((+)-Catechin gallate,CG)、表儿茶素没食子酸酯((-)-Epicatechin gallate,ECG)、没食子儿茶素((+)-Gallocatechin,GC)、表没食子儿茶素((-)-Epigallocatechin,EGC)、没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Gallocatechin gallate,GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin gallate,EGCG)组成。
目前茶多酚粗品的提取方法有热水萃取法、有机溶剂萃取法、萃取沉淀法、金属离子沉淀法、超声波浸提法、微波浸提法、超临界萃取法、化学萃取法(氯化铵沉淀法)等。然而，这些提取方法存在很多不足，主要包括：(1)有机溶剂提取后残留在茶多酚上的毒性问题，以及有机溶剂对环境的污染问题；(2)操作工艺繁琐，费时费力；(3)对设备要求高，一次性投资大；(4)茶多酚提取效率低；(5)所提取的茶多酚小分子单体的稳定性和生物利用率不理想。
综上所述，我们首先需要寻找一种绿色环保、操作容易、工艺简单、成本低廉、科学高效的提取方法从茶叶中提取分离茶多酚。另外，如何提高游离的茶多酚小分子单体的稳定性、生物利用率，从而增加其对应疗效也是急需解决的问题。最后如何通过合理的表征方法手段去揭示这些茶叶提取物对应的抗菌机理，找到成分-靶点相互作用关系同样面临巨大挑战。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种茶叶纳米点的制备方法，该方法绿色环保、操作简单，科学高效。
本发明的另一个目的是，提供一种茶叶纳米点。
本发明的另一个目的是，提供一种茶叶纳米点的抗菌应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤
1)粉碎：取干燥的茶叶，研磨处理成均匀的茶叶粉末，所述茶叶粉末的粒径范围为0.1～2mm；
2)提取：将所述茶叶粉末与水混合，置于高压反应装置中进行水热反应，所述水热反应温度60～100℃，反应时间3～9h，反应压力1.2～2个标准大气压，待反应结束后，自然冷却至室温，得到粗提液；所述茶叶粉末与水的质量比为1:(10～30)；
3)分离：将所述粗提液滤除粒径大于0.1mm的固体，得到第一滤液，所述第一滤液经过离心处理，离心后的上清液再次进行过滤处理去除粒径大于220nm的固体，得到第二滤液；
4)纯化：将所述第二滤液装入截留分子量为500～3000Da的透析袋中，将所述透析袋于室温下浸泡在去离子水中透析，目的是去除游离的单体小分子，透析结束后，对透析袋中的透析液离心处理，得到上清液；
5)浓缩：将所述步骤4所得上清液在50～80℃下进行浓缩，得到浓缩液；
6)干燥：将所述浓缩液经干燥得到茶叶纳米点(TNDs)。
上述技术方案中，在步骤1)中，采用剪刀或粉碎机对茶叶进行粉碎至小于0.5cm的颗粒，将粉碎后的茶叶颗粒进一步采用研钵进行研磨。
上述技术方案中，在步骤2)中，所述高压反应装置为高压反应釜的聚四氟乙烯内胆，采用马弗炉为加热装置，水热反应以0.5～5℃/min的速率升温加热装置至80℃，保持6h，反应压力1.6个标准大气压。
上述技术方案中，在步骤3)中，所述第一滤液离心转速为10000～20000rpm，离心时间为10～50min，优选离心转速为15000rpm，离心时间为30min；所述上清液采用220nm过滤头(Millex-GP)进行过滤处理。
上述技术方案中，在步骤4)中，所述透析袋的截留分子量为1000Da，透析时间为3天，每12h更换一次新鲜的去离子水，所述透析液的离心转速为10000～20000rpm，离心时间为10～50min，优选离心转速为15000rpm，离心时间为30min。
上述技术方案中，在步骤5)中，所述上清液采用旋转蒸发仪在60℃进行旋转蒸发浓缩，得到浓缩液。
上述技术方案中，在步骤6)中，所述浓缩液采用真空干燥箱在40-80℃下干燥6-24h。
上述技术方案中，所述茶叶可以为红茶、黑茶、绿茶、乌龙茶、白茶和黄茶中任意一种或多种。
一种上述技术方案中所述的制备方法所制备的茶叶纳米点，所述茶叶纳米点主要由儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯中六种及以上茶多酚组成，所述茶多酚以氢键和ππ共轭形式形成粒径约3nm(2～4nm)的纳米点。
一种上述技术方案制备的茶叶纳米点在抗菌过程中的应用。
上述技术方案中，所述茶叶纳米点在杀灭金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌过程中的应用。
本发明的优点和有益效果为：
1、本发明以水作为提取溶剂，避免了提取物的有机溶剂残留问题，以及环境污染问题，绿色环保、成本低廉、工艺简单。
2、本发明提取过程在高压装置中进行，且提取温度高，使茶叶纳米点中各儿茶素成分之间通过氢键和π-π相互作用形成特定的空间结构，不同于各单体儿茶素成分的简单混合，该特定结合方式的存在使茶叶纳米点稳定性增强、生物利用率提高，增强茶叶纳米点的抗菌活性，此外该茶叶纳米点具有良好的生物相容性和体内安全性。
3、本发明通过对Black TNDs处理的MRSA进行分子动力学模拟分析、蛋白质组学分析、氨基酸靶向代谢组学和联合信号分析，揭示了茶叶纳米点的物理穿膜作用和靶向细菌氨基酸代谢的双重抗菌机制，从而不易使细菌对其产生耐药性，为解决细菌耐药性问题提供全新思路。
4、该体系为茶叶的生物医用提供了新思路，阐明了化学信息学与生物信息学的构效关系，为其他中药生物医用提供新策略，为研发新型抗生素提供新的抗菌靶点，为彻底解决细菌耐药性问题提供新方法。
附图说明
图1是本发明实施技术方案中，从六种中国茶中提取的六种TNDs的形态和组成。
a，红茶纳米点(Black tea nanodots,Black TNDs)的透射电子显微镜(TEM)图像和相应粒径统计分析。
b，黑茶纳米点(Dark tea nanodots,Dark TNDs)的TEM图像和相应粒径统计分析。
c，绿茶纳米点(Green tea nanodots,Green TNDs)的TEM图像和相应粒径统计分析。
d，乌龙茶纳米点(Oolong tea nanodots,Oolong TNDs)的TEM图像和相应粒径统计分析。
e，白茶纳米点(White tea nanodots,White TNDs)的TEM图像和相应粒径统计分析。
f，黄茶纳米点(Yellow tea nanodots,Yellow TNDs)的TEM图像和相应粒径统计分析；
图2是本发明实施技术方案中，Black TNDs的构建和Black TNDs跨膜过程的分子动力学(MD)模拟。
a，通过分子对接得到排名前三的Black TNDs模型，再通过MD模拟(100ns)以评估其稳定性。
b，分子对接得到排名前三的Black TNDs模型计算的均方根偏差(RMSD)曲线。
c，分子对接得到排名前三的Black TNDs模型计算的回旋半径(Rg)曲线。
d，最稳定的Black TNDs模型中氢键(O-H···O，红色虚线)和π-π相互作用(黄色虚线)。
e，在50、100、200、300、400和500ns时刻的MD模拟的典型构象。
f，MD模拟300ns时，Black TNDs和磷脂双分子层之间通过氢键(红色虚线)和疏水相互作用(黄色虚线)形成的特定分子相互作用。
g，MD模拟过程中，Black TNDs和细菌细胞膜复合体在不同的膜渗透阶段(100、200、300、400和500ns)不同距离对应结合能曲线。
h，在500ns时刻，不同距离(0、0.5、1.0、2.0和3.0nm)处Black TNDs和磷脂双分子层之间的拉伸MD模拟。
图3是本发明实施技术方案中，Black TNDs处理的MRSA蛋白质组学。
a，通过Black TNDs处理后，在MRSA中1089种差异(P<0.05)表达的蛋白质的火山图，包括60种下调的蛋白质(表达差异的临界值为0.5倍)和98种上调的蛋白质(表达差异的临界值为2倍)。与Ctrl相比，用Black TNDs处理的MRSA的158个差异蛋白(60个下调蛋白和98个上调蛋白，n＝3个生物学独立重复的样品)。
b，使用Black TNDs处理的MRSA的所有差异蛋白的基因本体论(GO)分类(生物学过程，分子功能和细胞成分)，并列出排名前20的富集GO分类。
c，对差异蛋白进行KEGG分类，并列出排名前3的富集KEGG分类。
d，这些按信号通路分类过的差异蛋白质，再进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析。
图4是是本发明实施技术方案中，Black TNDs处理的MRSA氨基酸靶向代谢组学和联合信号通路。
a，与Ctrl相比，用Black TNDs处理的MRSA的29种差异氨基酸的热图分析(n＝6个生物学重复的样品)。
b，29种差异表达(P<0.05)氨基酸的火山图，包括10种下调的氨基酸(表达差异的截断值为0.5倍)，而没有MRSA上调的氨基酸(表达差异的截断值为2倍)。
c，综合蛋白组学与靶向代谢组学的联合信号通路，在“精氨酸生物合成信号通路”中进行亚细胞定位(红色：上调；蓝色：下调；线框：信号传导途径)。
d，在连续100代传代过程中，暴露于亚MIC浓度的Black TNDs和临床使用的万古霉素后，监测MRSA的耐药性发展。
图5是本发明实施技术方案中，Black TNDs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)时间动力学的抗菌结果和MRSA形态随时间变化。
a，通过平板涂布法测定在不同时间点(2h、4h、6h和8h)，以不同浓度(2x MIC，4xMIC，8x MIC，16x MIC和32x MIC)Black TNDs或Dark TNDs处理的MRSA的生存力。
b，用Black TNDs处理的MRSA后，在不同时间点(2h、4h、6h和8h)对应的扫描电子显微镜(SEM)图像(比例尺，100nm)。
c，Black TNDs处理2h的MRSA对应的超薄切片的TEM图像(比例尺，1μm和100nm)。
d，Black TNDs处理8h的MRSA对应的超薄切片的TEM图像(比例尺，1μm和100nm)。
e，用Black TNDs处理的MRSA后，在不同时间点(2h、4h、6h和8h)对应SYTOX Green的荧光强度。
每个数据点表示一个生物学重复(n＝3个生物学独立重复样品)，误差棒表示均值±标准差。对照组(Ctrl)和Black TND或Dark TNDs组之间的统计差异通过单向方差分析和事后Dunnett检验进行分析(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
图6是通过平板涂布法测定在8h时，以不同浓度的(2x MIC，8x MIC和32x MIC)Black TNDs或GC处理的MRSA的生存力对比。
图7是本发明实施技术方案中，Black TNDs治疗皮肤MRSA伤口感染模型。
a，在不同时间(1、3和7天)中，以不同浓度(2x MIC，4x MIC，8x MIC，16x MIC和32xMIC)Black TNDs处理的成纤维细胞的活性。
b，皮肤MRSA伤口感染模型的示意图。
c，随时间推移伤口愈合过程中代表性伤口照片(比例尺，5mm)。
d，在第1，3和7天，Ctrl，Van和Black TNDs组伤口处H&E染色(比例尺，100μm)切片。
e，通过分析相应的H&E染色切片，中性粒细胞(相对于所有细胞)的百分比。
每个数据点表示一个生物学重复(n＝3个生物学独立重复样品)，误差棒表示均值±标准差。统计差异通过单向方差分析和事后Tukey检验进行分析(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
图8是本发明实施技术方案中，Black TNDs治疗MRSA诱发的肺炎模型。
a，在不同的时间(1、3和7天)中，以不同浓度(2x MIC，4x MIC，8x MIC，16x MIC和32x MIC)Black TNDs处理的肺泡细胞活性。
b，MRSA诱导的肺炎模型的示意图。
c，PBS，Van和Black TNDs组随时间的小鼠存活曲线(每组n＝10只小鼠)。
d，在第1，3和7天，Ctrl，Van和Black TNDs组肺部的H&E染色(比例尺，100μm)切片。
e，通过分析相应的H&E染色切片，中性粒细胞(相对于所有细胞)的百分比。
每个数据点表示一个生物学重复(n＝3个生物学独立重复样品)，误差棒表示均值±标准差。统计差异通过单向方差分析和事后Tukey检验进行分析(**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
图9是本发明实施技术方案中，Black TNDs对巴马小猪的生物安全性。
a，Black TNDs对小猪的三种处理方法：静脉注射(i.v.)，雾化处理(NT)和口服(OA)的示意图。
b，第14天时，Ctrl，i.v.，NT和OA四个组血常规评估，包括HCT，HGB，MCH，MCHC，MCV，MPV，PLT，RBC，RDW和WBC。虚线之间表示相应的正常范围。
c，第14天时，Ctrl，i.v.，NT和OA四个组尿常规分析，包括BIL，BLD，GLU，KET，NIT，PRO，URO，Vc和WBC。
d，第14天时，Ctrl，i.v.，NT和OA四个组肾功能(BUN，CRE和UA)的生化分析。
e，第14天时，Ctrl，i.v.，NT和OA四个组肝功能(ALB，ALP，ALT，AST，CHE，DBIL，GGT，TBA，TBIL和TP)的生化分析。
f，第14天时，Ctrl，i.v.，NT和OA四个组过敏反应(CRP，IgE，IgG和组胺)的生化分析。
g，第14天时，Ctrl，i.v.，NT和OA四个组主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和大脑)H&E染色(比例尺，100μm)切片。
每个数据点表示一个生物学重复(n＝3个生物学独立重复样品)，误差棒表示均值±标准差。统计差异通过单向方差分析和事后Tukey检验进行分析(NS，无显著性差异，P>0.05)。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
一种茶叶纳米点的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)粉碎：取红茶的干燥茶叶，用剪刀剪碎至小于0.5cm的颗粒，剪碎后的茶叶颗粒经研钵研磨处理成均匀的茶叶粉末，所述茶叶粉末的粒径为0.8mm；
2)提取：将所述茶叶粉末5g与75g水混合，置于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中进行水热反应，将所述高压反应釜的聚四氟乙烯内胆密封后置于马弗炉内，以2℃/min的速率将马弗炉升温至80℃，保持6h，高压反应釜聚四氟乙烯内胆内反应压力为1.6个标准大气压，待反应结束后，自然冷却至室温，得到粗提液；
3)分离：将所述粗提液用滤布(150目)滤除粒径大于0.1mm的固体，得到第一滤液；所述第一滤液经过离心处理，离心时间30min，离心转速15000rpm，离心后的上清液经220nm过滤头(Millex-GP)过滤处理，去除粒径大于220nm的固体，得到第二滤液；
4)纯化：将所述第二滤液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，将所述透析袋于室温下浸泡在去离子水中透析3天，每12h更换一次新鲜的去离子水，透析结束后，将透析袋中的透析液进行离心处理，离心时间30min，离心转速15000rpm，得到上清液；
5)浓缩：将所述步骤4)中上清液置于旋转蒸发仪中，60℃下进行旋蒸浓缩，得到浓缩液；
6)干燥：将所述浓缩液放置在60℃真空干燥箱内干燥12h得到茶叶纳米点(TNDs)；
另取，黑茶、绿茶、乌龙茶、白茶和黄茶，参照上述步骤制备得到相应的茶叶纳米点。分别取上述六种茶叶纳米点5g于烧杯中，加入75g蒸馏水，制得茶叶纳米点水溶液，将上述六种茶叶纳米点水溶液分别滴在透射电子显微镜(TEM)的铜网表面，晾干后放入TEM样品室进行观察拍摄，得到各茶叶纳米点的TEM图片，采用Nano Measurer软件对各TEM图片中的纳米点进行逐个测量分析，将最终统计分析结果导入Origin软件进行绘图计算，得到对应的平均粒径数据图，结果见图1a～f，从图1a～f中可以看出，上述方法制备的六种茶叶纳米点的粒径范围均集中在3nm左右。具体而言，红茶纳米点(Black TNDs)平均粒径为3.19±0.39nm，黑茶纳米点(Dark TNDs)平均粒径为2.58±0.42nm，绿茶纳米点(Green TNDs)平均粒径为2.95±0.44nm，乌龙茶纳米点(Oolong TNDs)平均粒径为3.51±0.54nm，白茶纳米点(White TNDs)平均粒径为3.40±0.49nm，黄茶纳米点(Yellow TNDs)平均粒径为3.66±0.70nm
对比例1
一种茶多酚提取方法，所述方法包括以下步骤：
1)粉碎：取红茶的干燥茶叶，用剪刀剪碎至小于0.5cm的颗粒，剪碎后的茶叶颗粒经研钵研磨处理成均匀的茶叶粉末，所述茶叶粉末的粒径为0.8mm；
2)提取：将所述茶叶粉末5g与75g水混合，置于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中进行水热反应，将所述高压反应釜的聚四氟乙烯内胆密封后置于马弗炉内，以2℃/min的速率将马弗炉升温至50℃，保持6h，高压反应釜聚四氟乙烯内胆内反应压力为1.6个标准大气压，待反应结束后，自然冷却至室温，得到粗提液；
3)分离：将所述粗提液用滤布(150目)滤除粒径大于0.1mm的固体，得到第一滤液；所述第一滤液经过离心处理，离心时间30min，离心转速15000rpm，离心后的上清液经220nm过滤头(Millex-GP)过滤处理，去除粒径大于220nm的固体，得到第二滤液；
4)纯化：将所述第二滤液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，将所述透析袋于室温下浸泡在去离子水中透析3天，每12h更换一次新鲜的去离子水，透析结束后，将透析袋中的透析液进行离心处理，离心时间30min，离心转速15000rpm，得到上清液；
5)浓缩：将所述步骤4)中上清液置于旋转蒸发仪中，60℃下进行旋蒸浓缩，得到浓缩液；
6)干燥：将所述浓缩液放置在60℃真空干燥箱内干燥12h获得茶多酚颗粒；
将上述茶多酚颗粒5g于烧杯中，加入75g蒸馏水，制得茶多酚颗粒水溶液，将上述茶多酚颗粒水溶液滴在透射电子显微镜(TEM)的铜网表面，晾干后放入TEM样品室进行观察拍摄，结果发现无茶叶纳米点形成。
对比例2
一种茶多酚提取方法，所述方法包括以下步骤：
1)粉碎：取红茶的干燥茶叶，用剪刀剪碎至小于0.5cm的颗粒，剪碎后的茶叶颗粒经研钵研磨处理成均匀的茶叶粉末，所述茶叶粉末的粒径为0.8mm；
2)提取：将所述茶叶粉末5g与75g水混合，置于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中进行水热反应，将所述高压反应釜的聚四氟乙烯内胆密封后置于马弗炉内，以2℃/min的速率将马弗炉升温至80℃，保持1h，高压反应釜聚四氟乙烯内胆内反应压力为1.6个标准大气压，待反应结束后，自然冷却至室温，得到粗提液，；
3)分离：将所述粗提液用滤布(150目)滤除粒径大于0.1mm的固体，得到第一滤液；所述第一滤液经过离心处理，离心时间30min，离心转速15000rpm，离心后的上清液经220nm过滤头(Millex-GP)过滤处理，去除粒径大于220nm的固体，得到第二滤液；
4)纯化：将所述第二滤液装入截留分子量为1000Da的透析袋中，将所述透析袋于室温下浸泡在去离子水中透析3天，每12h更换一次新鲜的去离子水，透析结束后，将透析袋中的透析液进行离心处理，离心时间30min，离心转速15000rpm，得到上清液；
5)浓缩：将所述步骤4)中上清液置于旋转蒸发仪中，60℃下进行旋蒸浓缩，得到浓缩液；
6)干燥：将所述浓缩液放置在60℃真空干燥箱内干燥12h获得茶多酚颗粒；
将上述茶多酚颗粒5g于烧杯中，加入75g蒸馏水，制得茶多酚颗粒水溶液，将上述茶多酚颗粒水溶液滴在透射电子显微镜(TEM)的铜网表面，晾干后放入TEM样品室进行观察拍摄，结果发现无茶叶纳米点形成。
针对实施例1方法提取的六种茶叶纳米点的化学成分进行分析：
1、六种茶叶纳米点主要化学成分的定性分析：
通过HPLC-MS/MS对主要化合物进行了定性测量，将六种茶叶纳米点等量溶解在混合溶剂(乙醇：水，1：1，v/v)中，通过探针超声处理2小时以上解离(功率密度130W)。处理过的混合液通过0.22μm过滤器过滤，滤液用高效液相色谱-串联质谱法进行分析。通过CD2.1软件(Thermo Fisher)对HPLC-MS/MS收集的数据进行了初步分析，并将结果与数据库(mzCloud，mzVault和ChemSpider)进行了比较和匹配。其中，HPLC参数如下：(1)色谱柱：Thermo Hypersil GOLD 100×2.1mm，1.9μm。(2)流速：0.3mL min-1；(3)流动相由A相(0.1％甲酸的水溶液)和B相(0.1％甲酸的乙腈溶液)组成，使用梯度程序(B：0-1分钟内为2％，1-5分钟内为2-20％，5-10分钟内20-50％，10-15分钟内50-80％，15-20分钟内80-95％，20-25分钟内95％，25-26下95-2％分钟，在26-30分钟为2％)；(4)柱温箱温度：35℃；(5)进样体积：5μL。MS参数如下：(1)离子源：电喷雾电离源(ESI)；(2)扫描方式：正负离子切换扫描；(3)检测方式：Full Mass/dd-MS2；(4)扫描范围：100-1500m/z；(5)电喷雾电压：3.8kV(Positive)；(6)毛细管温度：300℃；(7)碰撞气：Ar(纯度≥99.999％)；(8)鞘气：N2(纯度≥99.999％)；(9)辅助气：氮气(纯度≥99.999％)；(10)气体温度：350℃；(11)数据收集时间：30.0分钟。结果发现儿茶素(CA)、表儿茶素(EC)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是构成茶叶纳米点的主要成分。
2、六种茶叶纳米点化学成分定量分析：
通过HPLC-MS/MS对主要化合物进行了定量测量，类似地，先将六种茶叶纳米点等量溶解在混合溶剂(乙醇：水，1：1，v/v)中，通过探针超声处理超过2小时解离(功率密度，130W)。处理过的溶液通过0.22μm的过滤器过滤，滤液用高效液相色谱-串联质谱法进行分析。将HPLC-MS/MS收集的每种化合物的数据，通过Xcilabur 3.0软件(Thermo Fisher)进行积分，将各化合物的峰面积作为纵坐标，相应的浓度作为横坐标。同时，通过加权系数(1/X2)回归获得标准曲线，从而得到六种茶叶纳米点中八种成分的比例关系。其中，HPLC的具体参数与上述相同，除以下区别：(1)色谱柱：Accucore-C18 100×2.1mm，2.6μm，Thermo；(2)使用梯度程序的流动相(B：0-1分钟为2％，1-5分钟为2-20％，5-10分钟为20-50％，10-15分钟为50-80％，15-17分钟为80％，17-17.2分钟为80-2％，17.2-17.5分钟为2％)；(3)进样体积：15μL。MS的具体参数与上面相同，除了以下区别：(1)检测方法：平行反应监测(PRM)；(2)数据采集时间：17.5分钟。结果见表1，从表1中可以看出除绿茶只含有6种儿茶素外，其他5种TNDs均含有八种儿茶素。
表1.六种TNDs中，八种儿茶素的含量比例组成
Figure BDA0002428968810000101
Figure BDA0002428968810000111
实施例2
以Black TNDs为研究对象，进行Black TNDs的构建和Black TNDs跨膜过程的分子动力学(MD)模拟，具体包括以下部分：
1、通过分子对接得到排名前三的Black TNDs模型，再通过MD模拟(100ns)以评估其稳定性
Black TNDs的构造：通过全原子分子动力学(MD)模拟构建Black TNDs。首先，构建八个分子(CA，GC，CG，GCG，EC，EGC，ECG和EGCG)的三维结构，并使用AutodockTools将它们分别赋予AD原子类型，然后进行氢化、带电，并最终保存为“.pdb”类型的文件。运用HEX8.0程序依次对接构建的八个分子，计算了彼此之间八个分子中相应的最低能量模式，并将其选择为下一个分子对接的输入文件。然后，预测了形成Black TNDs复合物的八个分子可能的相互作用模式和结构模型。在分子-分子复合物构象的对接过程中，选择了“Shape+Electro+DARS”模式，其他输入参数为默认设置。对接完成后，选择基于最低能量原理的前三项模型进行稳定性评估，并构建其三维结构。结果见图2a，从图2a中可以看出三个构象不同的Black TNDs，分别命名成Black TNDs-1，Black TNDs-2和Black TNDs-3，这三种Black TNDs因为结构的区别也具有不同程度的稳定性。
Black TNDs稳定性评估：为了考察最低能量排名前三的Black TNDs的稳定性，分析了整个动力学过程中排名前三的Black TNDs的均方根偏差和回旋半径曲线，使用GROMACS2018对上述Black TNDs复合物进行MD模拟，以评估其在溶液环境中的稳定性。在动态模拟过程中，将GROMOS 53A623力场应用于Black TNDs复合物，并通过SPC模型构建水分子。在Hex程序中获得起始结构浸入水溶液的周期性矩形模拟立方单元中。选择盒子的尺寸以在溶质周围提供至少
Figure BDA0002428968810000112
的溶剂分子缓冲液。在准备好系统之后，使用5000步最陡的下降最小化运行对系统进行了优化，以消除原子之间的碰撞并达到最佳状态。在恒定压力(1atm)和恒定温度(300K)下，对每个系统执行100ps位置受限MD模拟。然后，将系统提交给服务器进行100ns MD计算。使用Berendsen温控器进行温度耦合，温度耦合常数为0.1ps，采用压力计方法用于压力耦合，参考压力为1atm。在MD模拟过程中，使用了一个粒子网状的Ewald方案来计算真实空间的
Figure BDA0002428968810000113
截止的长距离静电相互作用。范德华相互作用使用了
Figure BDA0002428968810000121
的截止值。涉及氢原子的化学键长用SHAKE算法固定。使用GROMACS 2018分析了仿真结果，并使用Visual Molecular Dynamics(VMD)程序和PyMOL软件进行了可视化。
均方根偏差结果如图2b所示，从图2b中可以看出，相比于Black TNDs-2和BlackTNDs-3，Black TNDs-1具有更小波动和更稳定的RSMD曲线，表明Black TNDs-1的分子结构相对更稳定；另外，回旋半径Rg曲线结果见图2c，从图2c中可以看出，Black TNDs-1相比Black TNDs-2和Black TNDs-3的Rg曲线波动更小，表明Black TNDs-1分子结构相对稳定。因此，综合RSMD曲线和Rg曲线结果，Black TNDs-1分子结构最稳定。
2、从图2d中可以看出，通过全分子动力学(MD)模拟构建的Black TNDs-1纳米结构中含有大量氢键和π-π共轭键，大量键合作用也体现出Black TNDs-1具有较高稳定性，图2d中红色虚线为O-H···O键，黄色虚线为π-π键。而非纳米点结构的八种儿茶素单体小分子中不存在这些氢键和π-π键合作用，因此，Black TNDs-1具有比非纳米点结构的八种儿茶素单体小分子更高的稳定性。
3、Black TNDs-1模型在50、100、200、300、400和500ns时刻的MD模拟的典型构象，结果见图2e，从图2e中可以看出Black TNDs与MRSA的模拟质膜之间的相互作用，即随着时间推移，Black TNDs逐渐嵌入磷脂双分子层中，表明Black TNDs具有较强的穿膜作用。
4、MD模拟300ns时，Black TNDs-1和磷脂双分子层之间通过氢键(红色虚线)和疏水键相互作用(黄色虚线)形成的特定分子结构，结果见图2f，从图2f中可以看出BlackTNDs-1与磷脂双分子的亲水头部形成大量氢键作用，与磷脂双分子层的疏水尾部形成大量疏水作用。而这些作用力保证了Black TNDs-1的顺利穿膜。
5、MD模拟过程中，Black TNDs-1和细菌细胞膜复合体在不同的膜渗透阶段(100、200、300、400和500ns)不同距离对应的结合能曲线见图2g，从图2g中可以看出穿膜时间越长结合能越低，Black TNDs-1和细菌细胞膜复合体越稳定。这说明随着时间延长，BlackTNDs-1更趋向于穿膜作用。
6、在500ns时刻，不同距离(0、0.5、1.0、2.0和3.0nm)处Black TNDs-1和磷脂双分子层之间的拉伸MD模拟见图2h，从图2h中可以看出Black TNDs-1与磷脂双分子层具有较强作用力，能扰乱磷脂双分子层的结构。
实施例3
Black TNDs处理的MRSA蛋白质组学分析，具体包括以下部分，：
1、串联质量标记(TMT)技术用于定量蛋白质组学分析：收集未经过和经过BlackTNDs处理的MRSA细菌作为蛋白质组学分析的细菌样品，将细菌样品洗涤3次，然后加入SDT裂解液，超声处理加速细胞裂解，然后煮沸15分钟，在4℃下以14000g离心40分钟后，用BCA蛋白测定试剂盒(美国Bio-Rad)对相应的上清液进行定量，使用前样品需储存在-80℃条件下。接下来，分离出蛋白质样品，并通过SDS-PAGE分离显示。过滤辅助样品制备(FASP)方法是在蛋白质的酶解过程中进行的。另外，使用TMT 6/10plex等压标记试剂(Thermo)标记每个样品的肽混合物，并使用Pierce高pH反相肽分离试剂盒(Thermo science)按照制造商的说明将TMT标记的样品按组分分级。之后，使用与Easy nLC(Thermo Fisher Scientific)连接的纳米LC-MS/MS(Thermo Scientific)来分析每个组分。通过使用插入ProteomeDiscoverer中的MASCOT引擎研究了相应的MS/MS光谱，结果见图3a，图3a为通过Black TNDs处理后的MRSA中1089种差异(P<0.05)表达的蛋白质的火山图，包括60种下调的蛋白质(表达差异的临界值为0.5倍)和98种上调的蛋白质(表达差异的临界值为2倍)，结果表明，在MRSA的1089个鉴定的蛋白中，经过Black TNDs处理的MRSA出现了60个显著下调蛋白(0.5倍及以下，P<0.05)和98个显著上调蛋白(2倍及以上，P<0.05)。
2、生物信息学分析：对于GO注释，以快速自适应收缩/阈值算法(FASTA)格式从UniProtKB数据库中检索差异蛋白的序列，并使用R语言绘制基因本体论(GO)注释的结果，结果见图3b，从图3b中可以看出CO注释分类(生理过程，分子功能，细胞组成)中，富集排名前20的项目里变化最明显的主要集中在细胞组成，包括“膜(membrane)”，“膜的固有成分(intrinsic component of membrane)”，“膜的组成成分(integral component ofmembrane)”和“膜部分(membrane part)”，充分反映出Black TNDs对MRSA细菌膜具有很大的影响，与上述结果相互应证。对于KEGG途径注释，将差异蛋白序列针对在线KEGG数据库进行blast处理以获得其KEGG Orthologs，然后注释到KEGG信号通路中，结果见图3c，从图3c中可以看出KEGG富集的信号通路前三分别为“群体感应(quorum sensing)”，“精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)”和“金黄色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureusinfection)”。其中，“精氨酸生物合成”信号通路具有最高比例的差异蛋白(56％，P<0.05)。通过STRING软件从IntAct分子相互作用数据库中获得PPI结果见图3d，从图3d中可以看出差异蛋白相互作用与氨基酸代谢有密切联系，包括“次生代谢物的生物合成(biosynthesisof secondary metabolites)”，“丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢(alanine,aspartateand glutamate metabolism)”和“精氨酸和脯氨酸代谢(arginine and prolinemetabolism)”。综合上述结果，Black TNDs对细菌的氨基酸代谢有较大影响。
实施例4
Black TNDs处理的MRSA氨基酸靶向代谢组学和联合信号通路，具体包括以下部分：
1、基于多反应监测(MRM)的靶向代谢组学：通过靶向代谢组学的方法收集未经过和经过Black TNDs处理的MRSA作为细菌样品，并将处理过的细菌样品洗涤3次。简单地说，将溶液(甲醇：乙腈：水，体积比为2：2：1)与细菌样品混合，并在冰浴下超声处理20分钟。在4℃下以14000g离心20分钟后，获得相应的上清液，并在使用前保存在-80℃下。使用超高效液相色谱系统(Agilent 1290Infinity LC)分离样品并用5500QTRAP质谱仪(AB SCIEX)以正离子模式进行分析。使用Multiquant软件提取相应分离样品的峰面积和保留时间。利用氨基酸及其衍生物的标准品(Sigma-Aldrich)用于校正保留时间，以鉴定代谢物。结果见图4a和4b，图4a为与对照组相比，用Black TNDs处理的MRSA的29种差异氨基酸的热图分析(n＝6个生物学重复的样品)，从图4a中可以看出组内和组间具有良好的平行性。图4b为29种差异表达(P<0.05)氨基酸的火山图，包括10种下调的氨基酸(表达差异的截断值为0.5倍)，而没有MRSA上调的氨基酸(表达差异的截断值为2倍)，从图4b中可以看出下调最明显的两个氨基酸是瓜氨酸(0.064倍，P<10-9)和鸟氨酸(0.040倍，P<10-5)。
2、综合蛋白组学与靶向代谢组学的联合信号通路，在“arginine biosynthesis(精氨酸生物合成)”信号通路中进行亚细胞定位(红色：上调；蓝色：下调；线框：信号传导途径)。结果见图4c。图4c中的亚细胞定位是对应于“精氨酸生物合成”信号通路中最明显的变化的“尿素循环”生物过程，其中两个最显著下调氨基酸(瓜氨酸和鸟氨酸)，与两种大幅上调的蛋白(鸟氨酸氨基甲酰基转移酶和精氨琥珀酸合酶)密切相关。简而言之，蛋白质组学和靶向代谢组学共同表明，Black TNDs对MRSA的精准靶标是在“精氨酸生物合成”信号通路中的“尿素循环”过程里破坏了鸟氨酸和瓜氨酸的生化反应。
3、Black TNDs的耐药性试验
将MRSA在BlackTNDs和万古霉素(Van)的亚MIC水平上连续传代100代，通过重新测定Black TNDs和万古霉素的MIC去确认每次传代中潜在的抗性突变体，结果见图4d，从图4d中可以发现，随着传代次数的增加，Black TNDs组的MIC基本不变，万古霉素组的MIC呈倍数增加，由此可见，Black TNDs组MRSA经过100代的传代后未产生抗性突变体，MRSA未对BlackTNDs产生耐药性。
实施例5
1、六种茶叶纳米点对四种革兰氏阳性菌的MIC值测定方法，具体如下：
在标准Luria-Bertani(LB)培养基中培养金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC 43300；CCTCC 16465)，表皮葡萄球菌(ATCC 35984)，通过临床和实验室标准协会制定的标准微量稀释法评估六种茶叶纳米点对上述四种菌种的最低抑菌浓度(MIC)。结果见表2。从表2中可以看出，Black TNDs和Dark TNDs对四种革兰氏阳性菌的MIC均为64μg mL-1，明显小于绿茶、乌龙茶、白茶和黄茶，因此说明Black TNDs和DarkTNDs的抗菌活性优于其他四种茶叶纳米点。同时，检测八种儿茶素单体小分子，以及八种儿茶素单体小分子物理混合物(Mix，八种儿茶素成分比例同Black TNDs)的MIC，结果见表3。从表3中可以看出，GC单体分子的MIC为64μg mL-1，小于其他七种单体分子和八种儿茶素单体物理混合物的MIC，表明GC也具有较好抗菌潜能。
表2.六种TNDs对四种革兰氏阳性菌的MIC
Figure BDA0002428968810000151
表3.八种儿茶素单体小分子以及物理混合物对四种革兰氏阳性菌的MIC
Figure BDA0002428968810000152
2、Black TNDs和Dark TNDs在抗菌过程中的应用，具体包括以下部分：
1)、不同时间点、不同浓度Black TNDs和Dark TNDs处理的MRSA的细胞活性
在标准Luria-Bertani(LB)培养基中培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，将LB培养基中的200μL的MRSA细菌悬液(5×106CFU mL-1)分别与PBS(对照)、2x MIC，4x MIC，8x MIC 16x MIC，32x MIC的Black TNDs和Dark TNDs在96孔板中孵育，将96孔板在37℃的恒温摇床中分别孵育2、4、6和8h。处理后，将适当的稀释细菌悬浮液均匀涂布在标准LB琼脂平板上，并将这些平板在37℃下再孵育24小时，计数相应的细菌菌落数(CFU)，结果见图5a，从图5a中可以看出，与对照组相比，同一时间点，随着Black TNDs/Dark TNDs浓度的增加，MRSA菌落数下降越明显。与对照组相比，相同浓度的Black TNDs和Dark TNDs，随着作用时间的延长，MRSA菌落数下降越明显。通过方程式计算抗菌率：
Figure BDA0002428968810000161
其中C和E分别表示对照组和实验组中的细菌菌落(CFU)数量，结果显示在浓度梯度和时间梯度下，Black TNDs的抗菌性都优于Dark TNDs。
另外，GC与Black TNDs进行不同浓度梯度的抗菌对比研究，结果如图6所示，从图6中可以看出Black TNDs抗菌性优于GC。
2)、扫描电子显微镜观察Black TNDs处理的MRSA
将LB培养基中的MRSA细菌悬液与Black TNDs于37℃的恒温摇床中一起孵育2h、4h、6h和8h，使用2.5％戊二醛溶液固定细菌2小时，然后用无菌PBS反复冲洗细菌3次，使用不同浓度(30％、50％、70％、90％和100％，v/v)的乙醇溶液依次将细菌脱水15分钟，脱水后的细菌风干过夜后用扫描电子显微镜(SEM)进行观察。结果见图5b，从图5b中可以看出，孵育时间越长，MRSA细菌表面吸附的Black TNDs越多，并且细菌膜出现明显皱褶变形，共同孵育8h后，MRSA几乎全部被Black TNDs包围。。
3)、透射电子显微镜观察Black TNDs处理的MRSA
分别将Black TNDs相互作用2和8h的MRSA以4000g离心10分钟，弃去上清液，将收集的细菌用2.5％戊二醛溶液固定2小时，并用无菌PBS冲洗细菌3次，将处理过的细菌在1％的渗透酸中于4℃继续固定2h，并用无菌PBS冲洗细菌3次。用浓度分别为50％，70％，80％，90％和95％的乙醇对细菌依次脱水15分钟，再经100％乙醇脱水两次，每次15分钟。脱水后的样品包埋，并制备超薄切片(60-80nm)，用透射电子显微镜(TEM)进行观察，结果分别见图5c，5d。从图5c，5d中可以看出，与Black TNDs作用2h后，MRSA细菌膜表面吸附有一定量Black TNDs，此时Black TNDs与细菌膜未出现明显相互作用。到8h时，MRSA细菌膜表面完全被Black TNDs包围，同时部分Black TNDs完全嵌入细菌膜，使细菌膜结构出现紊乱和破坏。
4)、Black TNDs处理的MRSA膜渗透性测定
分别取Black TNDs作用2h、4h、6h和8h的MRSA，将MRSA与SYTOX Green溶液混合，用酶标仪(SpectraMax I3MD USA)测量相应的荧光强度(510-700nm)，其中激发波长为485nm，结果见图5e，从图5e中可以看出Black TNDs作用时间越长，MRSA的荧光强度越强。由于SYTOX Green是一种能够穿过受损细胞膜标记核酸的染料，而完整的细胞膜很难被标记，因此荧光强度越强说明细菌膜通透性越大，这个结果与SEM和TEM观察到的细菌膜的破坏相互应证。
实施例6
一种Black TNDs在抗菌过程中的应用，具体包括以下部分：
1、不同时间点、不同浓度Black TNDs处理的成纤维细胞的活性
将小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)培养在添加有1％青霉素-链霉素溶液(HyClone)、10％胎牛血清和1％氨基酸的最小必需培养基/Earle的平衡盐培养基(HyClone)中，并在5％CO2和95％湿度下，37℃细胞培养箱中培养，每两天更新一次培养基。将NIH-3T3接种在96孔板中培养24h，然后，将小鼠胚胎成纤维细胞分别与PBS(对照)、2xMIC，4x MIC，8x MIC，16x MIC，32x MIC浓度的Black TNDs于96孔板中共同孵育1天，3天和7天。孵育后的细胞中分别加入LDH检测工作液，用酶标仪(SpectraMax I3MD)测量不同时间点、不同Black TNDs浓度条件下小鼠胚胎成纤维细胞在490nm处的吸光度值，通过将实验组的吸光度值与对照的吸光度值进行比较来计算细胞活力(％)，结果图7a，从图7a中可以看出，与对照组相比，不同浓度(2×MIC～32×MIC)Black TNDs对NIH-3T3细胞活性没有明显影响，证明了Black TNDs具有良好的细胞相容性。
2、小鼠皮肤MRSA伤口感染模型的治疗试验
将C57BL/6雄性小鼠随机分为三组：对照组，Van组和Black TNDs组。通过腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，对每只小鼠的背侧进行脱毛和消毒，使用皮肤活检打孔器制造两个直径为6mm的对称圆形伤口，每个伤口处施加总计5×107CFU的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌液，对照组和Black TNDs组小鼠感染伤口分别用PBS和Black TND(1mg kg-1)处理后，用无纺布覆盖治疗的伤口，并用手术粘合剂固定，Van组小鼠静脉注射Van(40mg kg-1)作为阳性对照，分别于第0、1、3、7和12天分别对伤口拍照，观察MRSA感染小鼠皮肤伤口愈合情况，该过程的示意图被展示在图7b。相应结果见图7c，从图7c中可以看出，相比于对照组，Van和Black TNDs组伤口创面明显减少，第12天Black TNDs组小鼠的创伤面已基本愈合，其愈合情况优于Van组，总体来说，Black TNDs组对MRSA感染伤口表现出最佳伤口愈合效果。
3、小鼠皮肤MRSA伤口感染组织的H&E染色试验及中性粒细胞百分比统计
分别于1天、3天、7天取对照组、Van组、Black TNDs组小鼠伤口的皮肤组织进行H&E染色，并在显微镜下观察，结果见图7d，从图7d中可以看出相比于对照组和Van组，在1、3和7天，Black TNDs组都具有更少的中性粒细胞，证明Black TNDs能显著减轻MRSA感染伤口的炎症反应，间接证明了Black TNDs的体内抗菌效果。
另外，如图7e，通过定量分析上述H&E染色切片中中性粒细胞相对百分比发现，第1天、3天、7天，与对照组相比，Van和Black TNDs组的中性粒细胞百分比呈明显的递减趋势，且Black TNDs组的下降幅度高于Van组，说明BlackTNDs组小鼠的炎症反应明显减轻，由此可见Black TNDs的抗菌活性优于Van，说明Black TNDs有优于临床抗生素Van的效果，具有一定的应用前景。
实施例7
一种Black TNDs在抗菌过程中的应用，具体包括以下部分：
1、Black TNDs对肺泡细胞的活性的影响
将肺泡细胞(A549)分别与PBS(对照)、2x MIC，4x MIC，8x MIC，16x MIC，32x MIC浓度的Black TNDs于96孔板中共同孵育1天，3天和7天，检测不同时间点肺泡细胞的活性，结果见图8a，从图8a中可以看出，与对照组相比，不同浓度(2×MIC～32×MIC)Black TNDs对A549肺泡细胞活性没有明显影响，进一步证明了Black TNDs具有良好的细胞相容性。
2、小鼠MRSA诱导肺炎模型的治疗试验
将BALB/c雄性小鼠随机分为三组：对照组，Van组和Black TNDs组。用4％异氟烷麻醉小鼠，对每只小鼠的脖子进行脱毛和消毒，并做一个小切口以暴露气管，将MRSA细菌悬浮液(109CFU)滴入每只小鼠气管内，使其进入肺中，以引起急性肺部感染。1天后，对照组和Black TNDs组感染的小鼠分别用PBS和Black TNDs(10mg kg-1)进行雾化治疗。Van组小鼠静脉注射Van(40mg kg-1)作为阳性对照。每天记录各组小鼠的存活状况，绘制10天内小鼠的存活曲线，该过程示意图被展示在图8b，结果见图8c，从图8c中可以看出，10天内Black TNDs组小鼠的存活率为100％，Van组小鼠第三天开始出现死亡，10天的存活率为30％，对照组小鼠第二天开始出现死亡，10天时存活率为0，说明Black TNDs对MRSA诱导肺炎小鼠的治疗效果明显优于Van。
3)MRSA诱导肺炎小鼠肺部组织的H&E染色试验及中性粒细胞百分比统计
分别于1天、3天、7天取对照组、Van组、Black TNDs组肺炎小鼠肺部组织进行H&E染色，并在显微镜下观察，结果见图8d，从图8d中可以看出相比于对照组和Van组，在1、3和7天，Black TNDs组都具有更少的中性粒细胞，并且保持了较完整的肺泡结构，证明BlackTNDs在显著减轻MRSA感染肺部炎症反应的同时，未破坏相应肺部结构。
同时，如图8e，通过定量分析上述H&E染色切片发现，与对照组相比，第1天、3天、7天的Van组和Black TNDs组的中性粒细胞百分比均呈明显下降，Black TNDs组的下降幅度大于Van组，说明Black TNDs组小鼠的炎症反应明显减轻，由此可见Black TNDs对MRSA诱导的肺炎小鼠的治疗效果明显优于Van。
实施例8
一种Black TNDs的生物安全性试验，具体步骤如下：
将巴马小猪随机分为两组：对照组和Black TNDs组，其中，Black TNDs组小猪根据给药方式的不同又分为静脉注射(intravenous injection，i.v.)、雾化吸入(nebulizertreatment，NT)和口服给药(oral administration，OA)三个给药组。静脉和雾化给药组小猪通肌肉注射氯胺酮和口服异氟烷进行麻醉，使用Black TNDs(10mg kg-1)分别进行静脉注射和雾化治疗，口服给药组小猪口服Black TNDs(10mg kg-1)，对照组小猪不给任何药物。在第14天，对各组小猪主要器官的血液学，尿液分析，肾功能，肝功能，过敏反应和组织学进行了相应的测量分析，该过程示意图被展示在图9a，结果见图9b～f。从图9b～f中可以看出，与对照组相比，三种给药途径的Black TNDs组小猪的尿常规、肝功能、肾功能、过敏反应生化分析结果均在正常范围之内，说明三种不同给药途径的Black TNDs均具有体内安全性。
另外，分别于14天取对照组、Black TNDs组(i.v.、NT、OA)小猪的心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和大脑组织进行H&E染色，并在显微镜下观察，结果见图9g，从图9g中可以看出三种给药途径的Black TNDs组小猪与对照组无明显差异，说明三种不同给药途径的BlackTNDs对小猪的主要器官无毒副作用，证明了Black TNDs具有体内安全性。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤，
步骤1粉碎：取干燥的茶叶，研磨处理成均匀的茶叶粉末，所述茶叶粉末的粒径范围为0.1~2 mm；
步骤2提取：将所述茶叶粉末与水混合，置于高压反应装置中进行水热反应，所述水热反应温度80°C，反应时间6h，反应压力1.2~2个标准大气压，待反应结束后，自然冷却至室温，得到粗提液；所述茶叶粉末与水的质量比为1: (10~30)；
步骤3分离：将所述粗提液滤除粒径大于0.1mm的固体，得到第一滤液，所述第一滤液经过离心处理，离心后的上清液再次进行过滤处理去除粒径大于220nm的固体，得到第二滤液；
步骤4纯化：将所述第二滤液装入截留分子量为500~3000Da的透析袋中，将所述透析袋于室温下浸泡在去离子水中透析，目的是去除游离的单体小分子，透析结束后，对透析袋中的透析液离心处理，得到上清液；
步骤5浓缩：将所述步骤4所得上清液在50~80℃下进行浓缩，得到浓缩液；
步骤6干燥：将所述浓缩液经干燥得到茶叶纳米点。
2.根据权利要求1所述的一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：在步骤1中，采用剪刀或粉碎机对茶叶进行粉碎至小于0.5cm的颗粒，将粉碎后的茶叶颗粒进一步采用研钵进行研磨。
3.根据权利要求1所述的一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：在步骤2中，所述高压反应装置为高压反应釜的聚四氟乙烯内胆，采用马弗炉为加热装置，水热反应以0.5~5℃/min的速率升温加热装置至80℃，保持6h，反应压力1.6个标准大气压。
4.根据权利要求1所述的一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：在步骤3中，所述第一滤液离心转速为10000~20000rpm，离心时间为10~50min；所述上清液采用220nm过滤头进行过滤处理。
5.根据权利要求1所述的一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：在步骤4中，所述透析袋的截留分子量为1000Da，透析时间为3天，每12h更换一次新鲜的去离子水，所述透析液的离心转速为10000~20000rpm，离心时间为10~50min。
6.根据权利要求1所述的一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：在步骤5中，所述上清液采用旋转蒸发仪在60℃进行旋转蒸发浓缩，得到浓缩液。
7.根据权利要求1所述的一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：在步骤6中，所述浓缩液采用真空干燥箱在40-80℃下干燥6-24h 。
8.根据权利要求1所述的一种茶叶纳米点制备方法，其特征在于：所述茶叶可以为红茶、黑茶、绿茶、乌龙茶、白茶和黄茶中任意一种或多种。
9.一种根据权利要求1~8中任意一项所述的制备方法所制备的茶叶纳米点，其特征在于，所述茶叶纳米点主要由儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯中至少六种茶多酚组成，各所述茶多酚之间以氢键和ππ共轭形式形成的纳米点，所述纳米点为粒径2~4nm的纳米点。
10.一种权利要求9所述的茶叶纳米点在制备抗菌剂中的应用，其特征在于，所述抗菌剂杀灭金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌。
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