CN101935706B - 一种检测猪肉品质性状的方法及专用引物对 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测猪肉品质性状的方法及专用引物对。该辅助鉴别猪的猪肉品质性状的方法，包括如下步骤：检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C，若为T，则将所述待测猪记作基因型TT；若为C，则将所述待测猪记作基因型CC；基因型TT的待测猪的猪肉品质候选高于基因型CC的待测猪。本发明方法可快速准确的鉴别出猪的基因型，从而判断待测猪的猪肉品质的好坏，将其用于猪的育种中，可加快育种进程。因此，本发明方法在猪的育种中有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测猪肉品质性状的方法及专用引物对。
背景技术
长期以来，世界猪育种工作主要集中在生长速度、饲料利用率、瘦肉率的选育提高上，但在其取得显著进展的同时，也导致猪肉品质有所下降。随着人们物质生活水平的提高，人们对猪肉的需求已经不再仅仅追求数量，而对猪肉品质的要求也越来越高。因此，目前对于猪育种工作的重点已逐步转向猪肉品质性状的改善。
大理石纹、嫩度和多汁性直接影响猪肉外观，这些表观性状直接影响消费者对猪肉的购买欲。猪肉中的脂肪含量特别是肌内脂肪含量直接影响口感。研究表明肌内脂肪(IMF)与猪肉的大理石纹、风味、嫩度和多汁性直接相关，是猪肉品质性状中最具有经济价值的性状，因此育种价值很高。
猪H-FABP基因定位于6号染色体Sw316和S0003之间，心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因位于这一区间，其核苷酸序列如GenBank Accession Number HM591296所示；该基因的第二外显子的核苷酸序列如GenBank Accession Number HM591296的自5′末端起第5493-5665位核苷酸所示。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种辅助鉴别猪的猪肉品质性状的方法。
本发明所提供的辅助鉴别猪的猪肉品质性状的方法，为如下1)或2)所示：
1)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C，若为T，则将所述待测猪记作基因型TT；若为C，则将所述待测猪记作基因型CC；基因型TT的待测猪的猪肉品质候选高于基因型CC的待测猪；
2)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中H-FABP基因的第二外显子的自5′末端起第79位核苷酸是T还是C，若为T，则将所述待测猪记作基因型TT；若为C，则将所述待测猪记作基因型CC；基因型TT的待测猪的猪肉品质候选高于基因型CC的待测猪。
上述方法中，所述检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C的方法包括如下步骤：用如下引物对对所述待测猪进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据所述PCR扩增产物检测待测猪的基因组中SEQ IDNO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C；所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
上述方法中，根据所述PCR扩增产物检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C的方法可采用任何现有方法，如测序分析、PCR-SSCP、PCR-RFLP法等。
上述方法中，所述猪肉品质性状为肌内脂肪含量和/或大理石纹评分。
上述方法中，所述猪可是任何品种的猪，具体可以是由大白猪和民猪杂交得到的猪。
本发明的另一个目的是提供一种用于辅助鉴别猪的猪肉品质性状的引物对。
本发明所提供的用于辅助鉴别猪的猪肉品质性状的引物对，其核苷酸序列如SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
上述猪肉品质性状为肌内脂肪含量和/或大理石纹评分。
上述猪可是任何品种的猪，具体可以是由大白猪和民猪杂交得到的猪。
上述任一所述方法在猪的育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上述引物对在猪的育种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育猪的方法。
本发明所提供的培育猪的方法，为如下1)或2)所示：
1)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C，若为T，则将所述待测猪记作基因型TT；选取基因型TT的待测猪进行育种；
2)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中H-FABP基因的第二外显子的自5′末端起第79位核苷酸是T还是C，若为T，则将所述待测猪记作基因型TT；选取基因型TT的待测猪进行育种。
上述培育猪的方法中，所述检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C的方法包括如下步骤：用如下引物对对所述待测猪进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据所述PCR扩增产物检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C；
所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
上述培育猪的方法中，根据所述PCR扩增产物检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C的方法可采用任何现有方法，如测序分析、PCR-SSCP、PCR-RFLP法等。
本发明方法只需进行PCR反应，测序即可判别个体的基因型，基因型判型非常准确，检测费用不高。本发明方法，在猪的初产阶段，便可快速准确的鉴别出猪的基因型，从而判断待测猪的猪肉品质的好坏，将其用于猪的育种中，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效提高实际生产中的猪肌内脂肪含量和大理石纹，从而获得更高品质猪肉。本发明的检测方法操作简单、费用不高、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明将在猪的育种工作中发挥巨大作用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
下述实施例中使用的猪为大民杂交猪，由大白猪和民猪杂交而成，大民杂交猪购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平实验猪场。
实施例1、猪肉品质性状的鉴别
一、基因多态性位点的确定
1、PCR扩增
引物对如下：
U(上游引物)：5’-TGCCTGCTCCTTAAGCTTCT-3’ (序列表的序列1)；
D(下游引物)：5’-GGGAGGGAGGAAAACAAGAG-3’ (序列表的序列2)。
分别以3头大民杂交猪的基因组DNA为模板，使用引物U和D进行PCR扩增。
扩增体系为：基因组DNA 200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs 10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg2+ 2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至50μl。
PCR反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存。以3头大民猪的基因组DNA为模板进行扩增的产物分别命名为产物1、产物2、产物3。
2、克隆测序及序列分析
分别将3种PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收纯化，回收的DNA片段连接载体pGEM-T(Promega公司)后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(明日百傲(北京)科技有限公司)，根据载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明：产物的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，序列长度为566bp。三种产物序列存在单个核苷酸序列差异，产物1：在SEQ ID NO：1中第289位核苷酸是T；产物2：在SEQ ID NO：1中第289位核苷酸有的是T，有的是C；产物3：在SEQ ID NO：1中第289位核苷酸是C。将SEQ ID NO：1所示DNA片段的第289位核苷酸是T的猪记作基因型TT的猪；将SEQ ID NO：1所示DNA片段的第289位核苷酸是T和C的猪记作基因型TC的猪；将SEQ ID NO：1所示DNA片段的第289位核苷酸是C的猪记作基因型CC的猪。
SEQ ID NO：1所示DNA片段包含GenBank Accession Number HM591296所示的基因的第二外显子。
核苷酸序列差异位于H-FABP基因(GenBank Accession Number HM591296)第二外显子的5′末端起第79位(将外显子的5′末端记作第1位)。
二、核苷酸多态位点与猪肉品质性状的相关性分析
为确定核苷酸多态性与猪肉品质性状是否相关，以81头大民杂交猪为实验材料，进行如下试验：按照实验一中所述方法，测得每头猪中SEQ ID NO：1片段的核苷酸多态性；同时测定并记录肌内脂肪含量(IMF)、24小时pH值(pH24)、6-7肋背膘厚、大理石纹评分、水份、嫩度肉品质性状，对核苷酸多态性与肉品质性状开展关联分析。
对于单头猪而言，肌内脂肪含量(IMF)的检测方法：
将猪屠宰后，取第11～12肋骨处背最长肌切碎，65℃恒温处理72小时制成风干样。称风干肉样3-5g，用滤纸包扎后于103-105℃烘箱中烘2小时，移入索氏脂肪抽提器的浸提管中，浸提管套在脂肪收集瓶中，称量浸提前脂肪收集瓶空瓶重量，之后向浸提中加入无水乙醚，按仪器说明书进行肌内脂肪抽提，回收乙醚后，将浸提后脂肪收集瓶放入103-105℃烘箱中烘10分钟，干燥器内冷却30分钟后，称重。按如下公式计算肌内脂肪含量：
肌内脂肪(％)＝((浸提后脂肪收集瓶重-浸提前脂肪收集瓶重)/风干样重)×100％。
对于单头猪而言，大理石纹评分的方法：以猪肉大理石纹评分标准卡(NPPC，1999)为标准，取屠宰24小时后的猪左半胴体10-11肋背最长肌，目测其横切面大理石纹给出评分。
关联分析的方法：运用SAS8.2软件中的单因素方差分析软件包进行基因型-性状关联分析。
实验设3次重复，结果一致。结果见表1。
表1H-FABP基因第二外显子突变位点基因型与肉品质性状的关联
注：同列上标含有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
结果表明：在肉品质性状中，TT基因型个体分别比CC基因型个体在肌内脂肪含量和大理石纹评分方面分别多1.63％和0.83(P＜0.05)。
所以，在实际的猪育种中，为获得更好肉品质的猪，最好选择TT基因型的猪进行育种。
Claims (5)
1.一种辅助鉴别猪的猪肉品质性状的方法，为如下1)或2)所示：
1)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C，若均为T，则将所述待测猪记作基因型TT；若均为C，则将所述待测猪记作基因型CC；基因型TT的待测猪的猪肉品质候选高于基因型CC的待测猪；
2)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中H-FABP基因的第二外显子的自5′末端起第79位核苷酸是T还是C，若均为T，则将所述待测猪记作基因型TT；若均为C，则将所述待测猪记作基因型CC；基因型TT的待测猪的猪肉品质候选高于基因型CC的待测猪；
所述检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C的方法包括如下步骤：用如下引物对对所述待测猪进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据所述PCR扩增产物检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C；
所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
所述猪肉品质性状为肌内脂肪含量和/或大理石纹评分；
所述猪是由大白猪和民猪杂交得到的。
2.一种用于辅助鉴别猪的猪肉品质性状的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
所述猪肉品质性状为肌内脂肪含量和/或大理石纹评分；
所述猪是由大白猪和民猪杂交得到的。
3.权利要求1所述方法在猪的育种中的应用。
4.权利要求2所述引物对在猪的育种中的应用。
5.一种培育猪的方法，为如下1)或2)所示：
1)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C，若均为T，则将所述待测猪记作基因型TT；选取基因型TT的待测猪进行育种；
2)包括如下步骤：检测待测猪的基因组中H-FABP基因的第二外显子的自5′末端起第79位核苷酸是T还是C，若为均T，则将所述待测猪记作基因型TT；选取基因型TT的待测猪进行育种；
所述检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C的方法包括如下步骤：用如下引物对对所述待测猪进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；根据所述PCR扩增产物检测待测猪的基因组中SEQ ID NO：1所示DNA片段的自5′末端起第289位核苷酸是T还是C；
所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；
所述猪肉品质性状为肌内脂肪含量和/或大理石纹评分；
所述猪是由大白猪和民猪杂交得到的。
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