CN103966209B - 与猪肌内脂肪含量性状相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一个与猪肉肌内脂肪含量相关的SNP分子标记定位及应用。该SNP分子标记由全基因组关联分析中得到，其核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：1以及图2所示。本发明的标记可用于猪肌内脂肪含量性状的相关检测中。

Description

与猪肌内脂肪含量性状相关的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一个与猪肌内脂肪含量性状相关的SNP分子标记及应用。

背景技术

在猪育种工作中，育种者一直将提高瘦肉率和降低背膘厚作为主要育种目标。虽然这种选育方式已取得了显著的成效，但是它的遗传选择最终导致肌内脂肪含量的下降，进而导致猪肉品质的下降。随着消费者对肉质要求的不断提高，改善猪肉品质的遗传研究已成为畜牧业的研究热点。

肌肉中的脂肪分为肌间脂肪和肌内脂肪(intramuscularfat，IMF)。肌间脂肪位于肌肉组织周边，由脂肪细胞组成。肌内脂肪包括肌细胞内的脂质和肌细胞外的脂质。肌细胞内的脂质即位于肌纤维细胞质中的脂滴。肉眼很难观察到这部分脂肪，因此它不为肌内脂肪的主要部分。肌细胞外的脂质存在于肌外膜、肌束膜和肌内膜上，即肌肉组织中结缔组织间隙和毛细血管周围的脂肪细胞。这部分脂肪就是肉眼可见的“大理石纹”(HarperandPethick2004,"Howmightmarblingbegin？"AnimalProductionScience44(7):653-662.)。肌内脂肪含量是一个重要的肉质性状，也是影响肉的嫩度，风味和多汁性的一个重要因素。与此同时，肌内脂肪含量是一个遗传力相对较高的性状，但由于只能在屠宰后进行测量，因此采取传统的育种方法无法进行有效的选育。随着高通量猪基因组测序的完成和高密度的SNP(Singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性)芯片的开发使得全基因组关联分析(Genome-wideAssociationStudy，GWAS)，即从DNA水平寻找和识别与重要经济性质有关的候选基因或特定地基因组区域并以此作为分子标记用于标记辅助选择成为可能。GWAS为猪的育种开辟了另一条研究途径。它相对候选基因法和QTL定位，可以更准确的定位和识别新基因，并且已在家畜育种中得到了广泛的应用。

目前为止，有关猪肌内脂肪含量的候选基因，目前已有多例报道，其中研究得较清楚的是脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP和A-FABP)、黑皮质素受体-4基因(MC4R)、过氧化物酶增殖子活性受体γ基因(PPARγ)、脂肪细胞定向和分化因子1基因(ADD1)、脂蛋白脂酶(LPL)基因和激素敏感性脂肪酶基因(HSL)。

前人研究表明，乙酰辅酶A合成酶(acetoacetyl-CoAsynthetase，AACS)是一种利用酮体合成脂肪酸和胆固醇的关键酶。在细胞质中，它可以将乙酰乙酸转化成乙酰辅酶A，最终为脂质生成提供乙酰基。在3T3-L1细胞中敲低AACS的表达可以抑制3T3-L1细胞分化以及脂肪细胞标记基因PPARγ(peroxisome-proliferator-activatedreceptorgamma)和C/EBPα(CCAAT/enhancerbindingproteinα)的表达(Theroleofacetoacetyl-CoAsynthetase,aketonebody-utilizingenzyme,in3T3-L1adipocytedifferentiation.BiolPharmBull.2012；35(11):1980-5.)。与此同时，在成脂过程中，AACS启动子活性主要受C/EBPα调控(Transcriptionalregulationofketonebody-utilizingenzyme,acetoacetyl-CoAsynthetase,byC/EBPalphaduringadipocytedifferentiation.BiochimBiophysActa.2008Jun-Jul；1779(6-7):414-9.)。这说明AACS在前脂肪细胞分化中起了重要作用。除此之外，有研究报道AACS启动子受PPARγ和SREBP-2调控(Transcriptionalregulationofthehumanacetoacetyl-CoAsynthetasegenebyPPARgamma.BiochemJ.2010Mar29；427(2):255-64；Acetoacetyl-CoAsynthetase,aketonebody-utilizingenzyme,iscontrolledbySREBP-2andaffectsserumcholesterollevels)。其中，Sp1(stimulatingprotein-1)直接诱导促进脂肪生成的PPARγ与AACS的结合(Transcriptionalregulationofthehumanacetoacetyl-CoAsynthetasegenebyPPARgamma.BiochemJ.2010Mar29；427(2):255-64)。而SREBP-2是亮氨酸拉链转录因子。当它结合到固醇调控元件上时，它可以调控胆固醇合成中的限速酶HMGCR(Adirectroleforsterolregulatoryelementbindingproteininactivationof3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductasegene,J.Biol.Chem.271(1996)12247–12253；SREBP-2,asecondbasic–helix–loop–helix–leucinezipperproteinthatstimulatestranscriptionbybindingtoasterolregulatoryelement,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(1993)11603–11607.)。

至今，尚未见全面研究猪AACS基因功能的报道，而研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。因此，申请人运用全基因组关联分析的方法对这个基因的部分内含子进行了关联分析和多态研究，并首次在猪AACS基因的内含子找到的肉质性状SNP分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个与猪肌内脂肪含量性状相关的SNP分子标记及其应用。本发明运用全基因组关联分析的方法寻找与猪肌内脂肪含量性状相关的SNP分子标记，以此作为猪肉质性状，特别是猪肌内脂肪含量相关的SNP分子标记在标记辅助选择中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人克隆得到一个与猪肌内脂肪含量性状相关的SNP分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示：

GCTTCAGGAGCTCTCGTCTAAGAGCTTGCTCACGCTTTATATATAGTTTGTCTGTGTTGCCTGGCAACCACATCCTTTTTTTCTCTTCCCCCATCTCTCTCTTTTTTTTAACCCTTCCTAAATTGCATGTAAAGCAACTTCTGCTAAATACTCGTCCTCGGRGGGTACGCAAGCCCAGCCCTGCATGTCCAATTGGCTTTTCCCCAGTGTGGTTTTAGCATATTCTCAAATTATTAATGAGATAATTAATTTTTAACTTTTTAAAGAGCCACTGGGGTGCTCTTGCTCTTGCCTTTTAAG

上述序列162位的碱基R是A或G，导致多态性。

申请人提供了一种与猪肌内脂肪含量相关的SNP分子标记的制备方法，其在于下列步骤：

1)提取猪基因组DNA；

2)采集猪的背最长肌，用石油醚提取法测定两次试验猪背最长肌肉样的肌内脂肪含量；取两次所测结果的平均值作为该肉样的肌内脂肪含量；

3)将猪基因组DNA样品在全基因组芯片上作基因分型；

4)采用PLINK软件进行全基因组关联分析，从中选取与猪肌内脂肪含量显著关联的SNP，运用Ensembl网站的VariantEffectPredictor工具，注释该SNP，然后利用生物信息学方法，对目标区域内的基因进行功能注释，通过QTLdb网站检索该位点是否落在报道的与猪肌内脂肪含量有关的QTL中，进一步确定与猪肌内脂肪含量相关联的SNP。

本发明通过全基因组关联分析(GWAS)的方法得到与猪肌内脂肪含量相关联的SNP分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQIDNO：1是从NCBI网站下载的与猪肌内脂肪含量相关基因AACS第16个内含子部分核苷酸序列，经过检测分析得到本发明的第一个分子标记，序列长度为300bp，在该序列的162bp处存在一个等位基因的突变，即由A突变为G。

图1：是本发明的技术流程图。

图2：本发明克隆的猪AACS基因第16个内含子的部分序列，其中位于猪14号染色体AACS基因第16个内含子第218位碱基处(在本克隆的片段中为162bp处)的即括号内为等位基因的突变位点。

具体实施方式

实施例1

一、实验样品采集

实验猪群来自湖北金林原种畜牧有限公司种猪场的233头纯种大白猪公猪(已阉割，体重为90kg左右)。猪群自由采食、饮水，整个饲喂方式、饲养条件等始终保持一致，为常规方法。

在屠宰前，采集所有试验猪的耳组织样品，放入75％乙醇中保存，为提取猪基因组DNA(具体方法参照北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒说明书)备用。屠宰完后，从胸、腰椎间砍断脊柱与眼肌。然后切取左半胴体背最长肌为肉样，用于猪肌内脂肪含量测定。

二、背最长肌肌内脂肪含量测定

试验猪屠宰后2h内，取左半胴体胸、腰椎结合处背最长肌肉样使用石油醚提取法测定肌内脂肪含量；取两次所测结果的平均值，作为该肉样的肌内脂肪含量。具体操作如下：

1)采集最末胸椎与第一腰椎结合处背最长肌肉样，用绞肉机将肉样绞成肉糜状；

2)称取匀化肉样10g(W1)置于研钵内，分次加入甲醇研磨至甲醇总量达60ml；

3)研磨液倾入250ml具塞三角瓶内，然后分次加入氯仿至氯仿总量达90ml，研磨液倒入同一三角瓶内；

4)最后用少量甲醇和氯仿洗涤研钵，洗液一并倒入三角瓶内(残渣也倒入三角瓶内)；

5)静置过夜，静止时间不少于24h；

6)用中性定量滤纸将广口瓶中的液体过滤于筒型分液漏斗内，用少量甲醇和氯仿洗涤瓶内残渣至无残迹；

7)加入30ml蒸馏水至分液漏斗内，旋摇约1min后静置分层；上层为甲醇—水层，下层为氯仿—脂肪层；

8)用洁净知重50ml烧杯(W3)，取下层液50ml，记为V2；

9)用100ml量筒量取剩余的下层液体，并记下体积V1；

10)将烧杯置于加热板上加热，待氯仿挥发后将烧杯置烘箱中，在105±2℃烘1h；

11)取出烧杯置于干燥器中冷却至室温称重(W2)。

12)测定结果计算：

肌内脂肪(％)＝(W2-W3)/[W1×V2/(V1+V2)]×100

三、猪基因组DNA的提取与检测

试验采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANampGenomicDNAKit，按该试剂盒提供的所明书操作)从猪耳组织中提取猪基因组DNA，具体操作如下：

1)用眼科手术剪(用前酒精棉擦拭干净)将取自大白猪耳样剪成糊状，加200μl缓冲

液GA(该试剂盒自带)，振荡至彻底悬浮。

2)加入20μl蛋白酶K溶液(该试剂盒自带)，混匀，置于56℃水浴锅消化过夜。

3)加入200μl缓冲液GB(该试剂盒自带)，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(该试剂盒自带)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)重复操作步骤7。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

11)取2μL上一步所得溶液DNA溶液和1μL加样缓冲液混匀，上样于1.2％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳20分钟左右，紫外灯下观测电泳结果并拍照，以判断DNA的完整性。用NanoDrop2000核酸蛋白分析仪(ThermoFisherScientific，USA)对提取后的DNA进行质量检测，A260/A280的比值在1.7-2.1之间，A260/A230在1.8-2.2之间被判定为合格。对合格的DNA进行浓度测定，然后将浓度统一稀释至200ng/μL，放入-20℃的冰箱存放。不合格的DNA样品则需要重新提取。

四、SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控

将233头猪耳样中提取的基因组DNA样品在Illumina公司研制的PorcineSNP60BeadChip全基因组芯片上杂交。该芯片中包含61177个SNP位点。

采用PLINK软件对所有个体的原始基因型数据进行质控检验，以SNP基因型检出率(SNPcallrate)>90％、最小等位基因频率(minorallelefrequency,MAF)>0.01、哈代-温伯格平衡(Hardy-WeinbergEquilibrium,HWE)检验的P值<10-6以及样本检出率(samplecallrate)>90％等指标为标准。

五、数据整理与分析

1)表型数据分析

利用SAS9.2统计分析软件，对猪肌内脂肪含量测定值，进行描述性统计分析，包括计算该性状的平均值、标准差、最大值和最小值。

2)全基因组关联分析

采用PLINK软件，进行GWAS分析。申请人运用下述混合模型分析数据。模型为：

Yij＝μ+Genotypei+εij

其中，Yij为处理后的性状值；μ为每个性状的均值；genotypei为基因型效应；εij为随机效应。

3)检验SNP与性状关联的显著性。

当某个SNP符合P<10-4条件时，我们就认为这个SNP达到了全基因组的基因组水平显著。

4)SNP注释

根据芯片SNP信息，在Ensembl网站(www.ensembl.org)的SusscrofaBuid10.2数据库中，运用VariantEffectPredictor工具，注释该SNP，即确定SNP位点所在染色体及其在染色体上的物理位置，并由此确定这些显著SNPs在Ensembl数据库中已知基因的内部还是侧翼区域内。然后利用生物信息学方法，根据Ensembl、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov)等网站提供的基因结构、基因类型、基因功能和通路等信息，对目标区域内的基因进行功能注释。最后通过QTLdb(cn.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index)网站检索该位点是否落在已报到的与猪肌内脂肪含量有关的QTLs中，进一步确定与猪肌内脂肪含量相关联的SNPs。

六、结果分析

对猪AACS基因第16个内含子多态性位点rs80998394(ASGA0062434)基因型检测结果表明在233个个体中AA(AA)基因型有11个，AB(AG)基因型有95个，BB(GG)基因型有126个。此外，还有一个个体的基因型没检测到。所分析的肉质性状是猪肌内脂肪含量。所得到的相关性状是肌内脂肪含量。结果见表2。

表1AACS基因第16个内含子多态性位点rs80998394基因型与猪肌内脂肪含量的关联分析

注：*表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著P<0.01；表中性状值为平均数±标准误。(以下表格中同)

由表1可知：AACS基因第16个内含子的SNP位点rs80998394与猪肌内脂肪含量呈极显著相关(p<0.01)。对猪肌内脂肪含量值有显著影响的AACS基因第16个内含子中SNP位点rs80998394基因型与猪肌内脂肪含量关联分析的详细结果见表2。

表2SNPs位点rs80998394(AACS)基因型肌内脂肪含量的最小二乘均数

由表2可知，BB基因型的猪肌内脂肪含量值显著低于AA基因型(p<0.05)和AB基因型(p<0.05)。因此A等位基因(A等位基因)是猪肌内脂肪含量值的有利标记。这一SNP分子标记可以运用到猪的分子育种中，提高猪肉的肌内脂肪含量，从而改善猪肉品质。

Claims (1)

1.一个SNP分子标记在大白猪肌内脂肪含量检测中的应用，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列如下所示：

GCTTCAGGAGCTCTCGTCTAAGAGCTTGCTCACGCTTTATATATAGTTTGTCTGTGTTGCCTGGCAACCACATCCTTTTTTTCTCTTCCCCCATCTCTCTCTTTTTTTTAACCCTTCCTAAATTGCATGTAAAGCAACTTCTGCTAAATACTCGTCCTCGGRGGGTACGCAAGCCCAGCCCTGCATGTCCAATTGGCTTTTCCCCAGTGTGGTTTTAGCATATTCTCAAATTATTAATGAGATAATTAATTTTTAACTTTTTAAAGAGCCACTGGGGTGCTCTTGCTCTTGCCTTTTAAG

上述序列162位的碱基R是A或G，导致多态性。