CN101921324A - 一种人的类Alba蛋白C9orf23蛋白质及其在自身免疫性肝炎诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自身免疫性肝炎特异的蛋白质类Alba蛋白C9orf23及其应用。该蛋白质具有序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列。本发明还公开了用其基因克隆表达该蛋白质，并进行蛋白质芯片和酶联免疫吸附试验检测的方法，由本方法制备的类Alba蛋白C9orf23可用于自身免疫性肝炎的诊断。

Description

一种人的类Alba蛋白C9orf23蛋白质及其在自身免疫性肝炎诊断中的应用

技术领域

本发明涉及一种人的类Alba蛋白C9orf23自身抗原，更具体地说是一种自身免疫性疾病特异抗原类Alba蛋白C9orf23，在制备检测自身免疫性疾病试剂盒中的应用及含有该自身抗原的检测试剂盒，属于生物工程和疾病诊断领域。

背景技术

自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis，AIH)又称自免肝，是一种非病毒性的慢性肝炎，其致病原因不明，临床表现为慢性肝细胞发炎及坏死。如治疗不及时，AIH重症患者仅有50％的5年存活率。中国人群中AIH的患病率较低，但随着临床经验的积累以及实验室诊断技术的进步，我国人群中这类疾病逐渐增多。只有通过早期发现，才有可能对病期进行更准确的评估，尽早地进行针对性治疗，从而提高生存率，改善预后。

AIH患者血清内能检测到多种自身抗体，如抗核抗体(anti-nuclearautoantibody，ANA)、抗平滑肌抗体(smooth muscle autoantibody，SMA)、抗肝肾微粒体抗体(anti-liver and kidney microsomal antigens，anti-LKM)等。目前临床检验科常用间接免疫荧光法(indirectimmunofluoresence，IIF)检测，即用啮齿类动物组织或Hep-2细胞制备成组织/细胞芯片，与患者血清反应，继之以荧光标记的抗人IgG抗体检测血清抗体和芯片上抗原的结合，通过荧光图像判断，主观性强。近年来，对AIH自身抗体靶标进行了探索，已知的有CYP2D6、ASGP-R、F-actin等，为使用客观的诊断方法提供了分子基础。

蛋白质芯片技术可以全面地分析血清的抗体谱，提供具有疾病特异性的自身抗体标志物。

类Alba蛋白C9orf23(Alba-like protein C9orf23，Alba-like)又称为9号染色体开放阅读框23(Chromosome 9open reading frame 23)，最早见于2004年关于9号染色体DNA序列分析报道中。序列比对结果该蛋白属于类组蛋白的Alba家族，GO功能分类为一个核酸结合蛋白，具体功能不祥。该基因编码163个氨基酸。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：

本发明的第一个目的是提供一种特异性自身免疫性肝炎Alba-like抗原。

本发明的第二个目的是提供Alba-like抗原在制备人自身免疫性肝炎的蛋白质芯片检测试剂及其相应试剂盒的用途。

本发明的第三个目的是提供Alba-like抗原在制备人自身免疫性肝炎的ELISA检测试剂及其对应ELISA检测试剂盒的用途。

解决技术问题所采用的技术手段：

本发明利用蛋白质芯片技术，首先利用5000人类蛋白质芯片比较AIH和健康对照的血清抗体谱，筛选出14个与AIH相关的候选自身抗原。然后制备该14个候选抗原的蛋白质芯片，对AIH、健康对照、以及其它需要和不需要进行鉴别诊断的血清样本进行检测，鉴定出在AIH样本中特异的Alba-like自身抗原。

发明人制备了Alba-like蛋白质，通过特异性蛋白质芯片以及酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法，验证了其自身抗体可在部分AIH病人血清中检测到。单独检测时，检出率为26.7％-45.5％。Alba-like与其他5个自身抗原一起，可联合检测AIH，特异性和敏感性分别为96.2％和68.2％(逻辑回归)及93.2％和84.1％(判别分析)，准确率达到91.7％(表1)。另外，Alba-like可特异性地鉴别诊断PBC和HC等其他肝脏疾病(图1)。因此，Alba-like可作为AIH诊断的分子标志。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

1、一种人的Alba-like蛋白质，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列；

2)将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或多于一个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可识别针对序列表中SEQIDNo：2的自身抗体的蛋白质序列或可识别用序列表中SEQ ID No：2的序列表达的蛋白质所制备的抗体的蛋白质序列。

2、项目1所述人的Alba-like蛋白质的编码基因，是具有下述核苷酸序列之一的基因：

1)序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID No：1的DNA序列具有85％以上同源性。

3、含有项目1所述蛋白质的检测试剂，其用于检测人的自身免疫性肝炎。

4、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的蛋白质芯片检测试剂。

5、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的ELISA检测试剂。

6、项目1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的检测试剂。

7、使用项目1所述的蛋白质进行检测的方法，其包括使项目1所述的蛋白质与生物样品接触。

8、含有项目1所述蛋白质的抗体在自身免疫性肝炎中的应用。

9、含有项目1所述蛋白质为药物靶标的应用。

10、项目2所述的核酸分子的应用，其特征在于作为引物用于核酸扩增反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，或者用于作为自身免疫性肝炎诊断的标志。

本发明的优点及有益效果：

(1)本发明Alba-like具有极强的特异性，为特异的AIH标志物。

(2)本发明克隆了其全长，具免疫反应的高特异性和高敏感性；其可以制备检测AIH的蛋白质芯片检测试剂及试剂盒，该试剂盒检测效率高，使用方便，具有较高的应用价值。

(3)本发明还提供了一种制备检测AIH的ELISA检测试剂及试剂盒，该试剂盒检测效率高，使用方便，且具有较高的应用价值。

(4)本发明Alba-like还可以作为治疗AIH药物研发的靶标。

(5)本发明Alba-like蛋白质及其核酸序列均可以作为AIH检测的靶标。

附图说明

图1是Alba-like蛋白质与各组血清反应信号值的盒须图分析。将含有Alba-like的蛋白质芯片检测包含自免肝、健康对照、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、丙肝(HC)、及其他疾病对照共278份样品。长方形定义四分位距(IQR)；长方形内的横线表示中位值；长方形上下方的误差棒定义了1.5IQR的离群值。所有1.5*IQR+中位值之外的末端离群值点用黑色小方块表示。结果显示Alba-like可特异性地鉴别AIH与非AIH，包括需要与AIH鉴别诊断的PBC及HC。

具体实施方式

材料来源：

本发明具体实施方式所用血清标本来源于北京协和医院。留取的血液经沉淀离心后，血清移入低温保存。疾病标本均经临床检验确诊，并有患者知情同意书。

本具体实施方式所用试剂均为市售产品。

实施例1Alba-like蛋白质的制备

以人基因组DNA为模板，根据Alba-like基因序列设计特异引物，引物两端含有酵母重组位点：

上游引物：5’gcatcaccatcaccatcacggtggtggtatggagcactaccggaaagc 3’(SEQ ID No：3)；

下游引物：5’aggcagatcgtcagtcagtcacgatgaacgatcgggtgtctcgagcc3’(SEQID No：4)。

PCR(参数：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，共35循环；72℃10min，4℃保存)扩增出全长Alba-like基因，与线性载体pEGH(XbaI+HindIII双酶切)共同化学转化酵母感受态细胞Y258(参考文献1)，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。筛选得到的阳性克隆，用2％半乳糖诱导表达14小时。诱导后的酵母细胞裂解后，用GST亲和树脂纯化蛋白(洗脱条件为30mM还原性谷胱甘肽)。

实施例2Alba-like蛋白质制备蛋白质芯片检测AIH

取10微升纯化的蛋白质溶液至384孔板中，用PerkinElmer Spotarray72型芯片点样仪将经5000个人类蛋白质芯片筛选出的包含Alba-like的14个与AIH相关的候选自身抗原在表面经过化学处理适用于蛋白质芯片点制的显微玻片上连续点制成12个完全一致的方阵，每个方阵都包括了这12个候选自身抗原以及人IgG作为正对照，一个随机选取的重组人蛋白质和点样缓冲液作为负对照(参考文献1)。每个蛋白质样品被点制成横排相邻的两个重复的点。芯片点制完成后，室温下放置1小时，存放于4℃。

将上述芯片，对包含44份AIH及其他各种疾病和健康对照在内的共278份样品进行芯片杂交分析实验。所有样品均以1∶1000的比例稀释，血清中与芯片上蛋白结合的抗体用Cy5标记的羊抗人IgG抗体(1∶1000稀释)来测定。

Alba-like自身抗原在AIH的检出率为45.5％(20/44)。对Alba-like自身抗原与各组血清反应信号值的盒须图分析结果(图1)表明，Alba-like可特异性地鉴别AIH与非AIH，包括需要与AIH鉴别诊断的原发性胆汁性肝硬化及丙肝。

本发明还通过训练数学判别模型，得到了包括Alba-like在内的6个抗原及其判别公式。针对278份样品，AIH的判别准确率达到91.7％(表1)。

表1：两种判别模式对训练样品的判别

本发明用蛋白质芯片的方法对另外15份AIH和26份健康对照样品进行双盲判别，准确率达到85.4％-87.8％(表2)。

表2：两种判别模式对双盲样品的判别

实施例3Alba-like蛋白质制备ELISA试剂盒检测AIH

选择聚苯乙烯ELISA板，保证单孔的吸光值和96孔吸光值的平均值之间的差值在10％以内。在每孔中包被100μl的Alba-like抗原(2.5μg/ml)，并用1％的牛血清白蛋白进行封闭。对板材和包被的抗原进行干燥处理和真空包装。

将包被的ELISA板与15份AIH和15份健康对照血清(1∶40稀释)反应，进行ELISA分析实验。与AIH和健康人血清反应的结果(吸光度)做T检验，p值小于0.01，显示其与两种血清反应时有显著差异。

以健康对照血清与Alba-l ike蛋白质反应的光吸收值的平均值加上标准差的三倍作为阈值，判断Alba-like蛋白质与15份AIH反应的阳性率及特异性。阳性率为27％(4/15)，特异性100％，即没有一例对照血清被误诊。

参考文献

1.Hu S.，Li Y.，Liu G.，Song Q，Wang L.，Han Y.，Zhang Y.，SongY.，Yao X.，Tao Y.，Zeng H.，Yang H.，Wang J.，Zhu H.，Chen ZN，andWu L.(2007)A Protein Chip approach for high-throughput ant igenidentification  and  characterization.Proteomics  2007，7，2151-2161.

序列表

<110>北京华大蛋白质研发中心有限公司

<120>一种人的类Alba蛋白C9orf23蛋白质及其在自身免疫性肝炎诊断中的应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>489

<212>DNA

<213>HUMAN

<400>1

atggagcact accggaaagc tggctctgta gagctcccag cgccttcccc aatgccccag     60

ctacctcctg atacccttga gatgcgggtc cgagatggca gcaaaattcg caacctgctg    120

gggttggctc tgggtcggtt ggagggcggc agtgctcggc atgtagtgtt ctcaggttct    180

ggcagggctg caggaaaggc tgtcagctgc gctgagattg tcaagcggcg ggtcccaggc    240

ctgcaccagc tcaccaagct acgtttcctt cagactgagg acagctgggt cccagcctca    300

cctgacacag ggctagaccc cctcacagtg cgccgccatg tgcctgcagt gtgggtgctg    360

ctcagccggg accccctgga ccccaatgag tgtggttacc aacccccagg agcaccccct    420

ggcctgggtt ccatgcccag ctccagctgt ggccctcgtt cccgaagaag ggctcgagac    480

acccgatcg                                                            489

<210>2

<211>163

<212>PRT

<213>HUMAN

<400>2

Met Glu His Tyr Arg Lys Ala Gly Ser Val Glu Leu Pro Ala Pro Ser

1               5                   10                  15

Pro Met Pro Gln Leu Pro Pro Asp Thr Leu Glu Met Arg Val Arg Asp

            20                  25                  30

Gly Ser Lys Ile Arg Asn Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly Arg Leu Glu

        35                  40                  45

Gly Gly Ser Ala Arg His Val Val Phe Ser Gly Ser Gly Arg Ala Ala

    50                  55                  60

Gly Lys Ala Val Ser Cys Ala Glu Ile Val Lys Arg Arg Val Pro Gly

65                  70                  75                  80

Leu His Gln Leu Thr Lys Leu Arg Phe Leu Gln Thr Glu Asp Ser Trp

                85                  90                  95

Val Pro Ala Ser Pro Asp Thr Gly Leu Asp Pro Leu Thr Val Arg Arg

            100                 105                 110

His Val Pro Ala Val Trp Val Leu Leu Ser Arg Asp Pro Leu Asp Pro

        115                 120                 125

Asn Glu Cys Gly Tyr Gln Pro Pro Gly Ala Pro Pro Gly Leu Gly Ser

    130                 135                 140

Met Pro Ser Ser Ser Cys Gly Pro Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Asp

145                 150                 155                 160

Thr Arg Ser

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>Primer

<400>3

gcatcaccat caccatcacg gtggtggtat ggagcactac cggaaagc    48

<210>4

<211>47

<212>DNA

<213>Primer

<400>4

aggcagatcg tcagtcagtc acgatgaacg atcgggtgtc  tcgagcc    47

Claims (10)

1.一种人的类Alba蛋白C9orf23蛋白质，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列；

2)将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或多于一个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且可与针对序列表中SEQ ID No：2的自身抗体识别的蛋白质的序列或可与用序列表中SEQ ID No：2表达的蛋白质制备的抗体识别的蛋白质的序列。

2.权利要求1所述人的类Alba蛋白C9orf23蛋白质的编码基因，是具有下述核苷酸序列之一的基因：

1)序列表中SEQID No：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID No：1的DNA序列具有85％以上同源性。

3.含有权利要求1所述蛋白质的检测试剂，其用于检测人的自身免疫性肝炎。

4.权利要求1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的蛋白质芯片检测试剂。

5.权利要求1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂。

6.权利要求1所述的蛋白质的用途，其用于制备检测人的自身免疫性肝炎的检测试剂。

7.使用权利要求1所述的蛋白质进行检测的方法，其包括使权利要求1所述的蛋白质与生物样品接触。

8.含有权利要求1所述蛋白质的抗体在自身免疫性肝炎中的应用。

9.含有权利要求1所述蛋白质为药物靶标的应用。

10.权利要求2所述的核酸分子的应用，其特征在于作为引物用于核酸扩增反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，或者用于作为自身免疫性肝炎诊断的标志。

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