CN101914160A - 乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用，该复合物由乙型肝炎病毒核心抗原与糖调蛋白170以非共价键结合而成，能够激活识别乙型肝炎病毒核心抗原的特异性CTL，诱导强有力的抗病毒免疫，且不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制；该复合物的制备方法简单，可以用于制备乙型肝炎治疗性疫苗，在乙型肝炎免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

Description

乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白复合物，特别涉及乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物，还涉及该复合物的制备方法和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。为此，寻求理想的抗HBV药物一直是亟待解决的研究课题。目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒药物进行治疗，应用的抗病毒药物主要有干扰素和核苷类药物如拉米夫定等，其中，干扰素的适应症有限，疗效较差，不良反应发生率较高，且价格昂贵；拉米夫定作为逆转录酶的强抑制剂，在控制慢性HBV感染方面具有确切的近期疗效，且有良好的耐受性，但其不能清除肝细胞内HBV复制的来源，长期用药又存在耐药问题。因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。

CD8+T细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细菌和真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。HBV感染的慢性化主要是由于机体对HBV的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致感染的持续存在。在急性HBV感染时，机体存在大量的针对HBV多个抗原表位的多特异性、多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性HBV感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检测不到。因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对HBV的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有望清除病毒，终止慢性HBV感染。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一种结构蛋白，是机体CTL识别和攻击HBV感染细胞的主要靶抗原。因此，增强HBcAg特异性的CTL应答，有望终止慢性HBV感染。

热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守，广泛存在于原核和真核生物中的蛋白质，具有“分子伴侣”作用，参与胞内蛋白质的折叠、装配和转运等过程。HSP按分子量大小分为以下几个家族：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小HSP家族。每个家族又由多个成员组成，如HSP70家族成员有HSP70、热休克同源蛋白(HSC)70、糖调蛋白(GRP)78和GRP75等，HSP90家族成员有HSP90和GP(糖蛋白)96等。许多研究结果证实，HSP作为理想的分子佐剂可以诱导机体产生免疫应答，在抗病毒等疾病治疗中发挥重要作用。进一步研究表明，HSP可通过以下几方面诱导机体的免疫应答：(1)抗原肽-HSP复合物作为完整抗原，被抗原递呈细胞摄取、加工后，与主要组织相容性复合体(MHC)结合并递呈到细胞表面，从而活化T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞，特别是CTL，产生抗病毒的特异性细胞免疫；HSP在此处起到载体或佐剂的作用，诱导免疫应答的是其结合的抗原肽；(2)HSP本身具有活化巨噬细胞和树突状细胞的作用，从而增加共刺激因子和MHC的表达，加强机体的抗病毒免疫；(3)自然杀伤细胞和γδT细胞是体内重要的抗病毒免疫细胞，对病毒感染细胞的杀伤效应不受MHC的限制，HSP可直接作为抗原递呈分子，将抗原肽递呈至细胞表面，从而活化自然杀伤细胞和γδT细胞，产生非特异性免疫应答。近年来研究发现，GRP170也是HSP70家族的成员，是一种对较大的抗原肽也具有伴侣作用的高分子量HSP，具有强大的免疫佐剂效应。目前，以抗原肽-HSP复合物为基础的疫苗多采用HSP70、HSP90和GP96进行构建，并且多用于肿瘤治疗的研究，尚未见采用GRP170构建乙型肝炎治疗性疫苗的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HBcAg与HSP的复合物，能够激活识别HBcAg的特异性CTL，诱导强有力的抗病毒免疫，且不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制；目的之二在于提供所述HBcAg与HSP的复合物的制备方法；目的之三在于提供所述HBcAg与HSP的复合物在医药方面的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、HBcAg与HSP的复合物，由HBcAg与GRP170以非共价键结合而成，所述HBcAg具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，GRP170具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。

进一步，由HBcAg与GRP170以摩尔比为1∶1结合而成。

2、所述PSCA与HSP的复合物的制备方法，是在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS中，分别加入HBcAg和GRP170，混合均匀，在43℃孵育30分钟，再在37℃孵育1小时，即得HBcAg与HSP的复合物。

进一步，按摩尔比为1∶1加入HBcAg和GRP170，使HBcAg和GRP170的终浓度为3～6μg/mL。

3、所述HBcAg与HSP的复合物在制备乙型肝炎治疗性疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：研究结果显示，本发明的HBcAg与HSP的复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌干扰素-γ(IFN-γ)；并能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤HBV感染肝细胞，导致HBV转基因小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性明显升高；还能够有效抑制HBV的复制，显著降低HBV转基因小鼠血清HBV DNA载量；因此，本发明的复合物在体内能够激活识别HBcAg的特异性CTL，诱导强有力的抗病毒免疫。此外，由于HSP结构上的高度保守，不具有多态性，本发明复合物在同种内相互使用不受MHC的限制；且HSP自身具有免疫佐剂的作用，省略了常规蛋白免疫需要免疫佐剂的麻烦。本发明复合物的制备方法简单，可以用于制备乙型肝炎治疗性疫苗，在乙型肝炎免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为PCR扩增HBcAg基因的琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为蛋白免疫印迹(Western Blot)鉴定HBcAg；

图3为PCR扩增GRP170基因的琼脂糖凝胶电泳结果；

图4为Western Blot鉴定GRP170；

图5为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测HBcAg-GRP170复合物激发CTL分泌IFN-γ的能力；

图6为HBV转基因小鼠血清ALT活性检测结果；

图7为HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、HBcAg-GRP170复合物的制备

1、HBcAg的制备

(1)HBcAg基因的克隆

根据GenBank登录号为NC 003977.1的HBcAg基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的HBcAg cDNA全长：F1：5’-cggaattcggcatggacatcgacccttat-3’(SEQ ID No.3)，下划线部分为EcoR I酶切位点；R1：5’ccgctcgagagttccccaccttatgagtc-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分为Xho I酶切位点；分离HBV转基因小鼠的肝脏细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2×10⁷个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了HBcAg cDNA全长序列(SEQ ID No.1)的阳性克隆质粒命名为pGEM-HBcAg；

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约550bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。

(2)HBcAg原核表达载体的构建

将质粒pGEM-HBcAg和原核表达载体pET32a(+)分别用EcoR I和Xho I进行双酶切，用凝胶回收试剂盒切胶回收纯化双酶切后的HBcAg cDNA全长和线性载体pET32a(+)，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了HBcAgcDNA全长序列的阳性克隆质粒命名为HBcAg原核表达载体pET32-HBcAg。

(3)HBcAg工程菌的构建

将HBcAg原核表达载体pET32-HBcAg用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD和MM平板，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母单菌落为高拷贝HBcAg工程菌；

(4)HBcAg的诱导表达

将高拷贝HBcAg工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透析脱盐，再用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有HBcAg的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(SephdexG-25)柱脱盐，即得纯化的HBcAg(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)。

Western Blot鉴定：取纯化的HBcAg，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂牛奶封膜，加入鼠抗人HBcAg单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的HBcAg)；结果见图2，其中1泳道为纯化的HBcAg，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

2、GRP170的制备

(1)GRP170基因的克隆

根据GenBank登录号为NM 006389.3的GRP170基因序列和真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点，设计并合成如下PCR引物以扩增两端带有酶切位点的GRP170cDNA全长：F2：5’accggatcctcgcaaataaaatagt-3’(SEQ ID No.7)，下划线部分为BamH I酶切位点；R2：5’-gtacagtctagattaatggtgatggtgatgatgtgaaggccgcttctgtcc-3’(SEQ ID No.8)，下划线部分为Xba I酶切位点；以含有GRP170cDNA全长的质粒为模板、F2和R2为上下游引物进行PCR，PCR条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒，72℃延伸2.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶回收试剂盒切胶回收纯化。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图3，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约3000bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。

(2)GRP170真核表达载体的构建

将纯化的PCR产物和真核表达载体pcDNA3.1分别用BamH I和Xba I进行双酶切，用凝胶回收试剂盒切胶回收纯化双酶切后的GRP170cDNA全长和线性化载体pcDNA3.1，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，用BamH I和Xba I进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定质粒序列，将插入了GRP170cDNA全长序列(SEQ ID No.5)的阳性克隆质粒命名为GRP170真核表达载体pcDNA3.1-GRP170。

(3)GRP170工程菌的制备

将GRP170真核表达载体pcDNA3.1-GRP170用Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD和MM平板，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母单菌落为高拷贝GRP170工程菌。

(4)GRP170的诱导表达

将高拷贝GRP170工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的PBS透析脱盐，再用Q-Sepharose柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有GRP170的洗脱液，适当浓缩后用Sephdex G-25柱脱盐，即得纯化的GRP170(氨基酸序列如SEQ ID No.6所示)。

Western Blot鉴定：取纯化的GRP170，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂牛奶封膜，加入鼠抗人GRP170单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的GRP170)；结果见图4，其中1泳道为纯化的GRP170，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

3、HBcAg-GRP170复合物的制备

在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS(由浓度为137mmol/L的NaCl、浓度为2.7mmol/L的KCl、浓度为4.3mmol/L的Na₂HPO₄和浓度为1.4mmol/L的KH₂PO₄组成)中，按摩尔比为1∶1加入纯化的HBcAg和GRP170，使HBcAg和GRP170在PBS中的浓度均为3～6μg/mL，混合均匀，43℃孵育30分钟，再37℃孵育1小时，即得HBcAg-GRP170复合物，取样进行Western Blot鉴定。

二、HBcAg-GRP170复合物的抗病毒活性研究

效应细胞的制备：将30只6～8周龄雌性HBV转基因Babl/c小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组，每组10只；将HBcAg-GRP170复合物和OVA-GRP170复合物(卵清蛋白与GRP170按前述步骤3方法制得的复合物)分别用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS溶解制成浓度为0.5mg/mL的溶液；实验组以浓度为0.5mg/mL的HBcAg-GRP170复合物溶液为免疫原，对照组以浓度为0.5mg/mL的OVA-GRP170复合物溶液为免疫原，空白组以浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS为免疫原；各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100μL，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。

1、ELISPOT法检测HBcAg-GRP170复合物激发CTL分泌IFN-γ的能力

末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，作为效应细胞；采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作：在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入IFN-γ捕获抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度4℃孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉100μL，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS)洗涤，再加入生物素标记的抗IFN-γ抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1∶5000)100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。

结果见图5，实验组的斑点数明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明的HBcAg-GRP170复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。

2、HBV转基因小鼠血清ALT活性检测

末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清ALT活性。

结果见图6，实验组的血清ALT活性明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明的HBcAg-GRP170复合物能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤HBV感染肝细胞，从而导致血清ALT活性明显升高。

3、HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测

末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清HBV DNA抑制率。

结果见图7，实验组的血清HBV DNA抑制率明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明的HBcAg-GRP170复合物能够有效抑制HBV的复制，显著降低血清HBV DNA载量。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用

<160>8

<210>1

<211>552

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)……(552)

<400>1

atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct   60

tctgacttct ttccttccat tcgtgatctt ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag  120

gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactaaggca agctattctc  180

tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca  240

tccagggaat tagtagtaag ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta  300

ttgtggtttc acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg  360

tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta  420

tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact  480

ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa  540

tctcaatgt tag                                                      552

<210>2

<211>183

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)

<400>2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

                  5                  10                  15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

             20                  25                  30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

    35                  40                  45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

    50                  55                  60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

 65                  70                  75                  80

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

                85                  90                  95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

            100                 105                 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

        115                 120                 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

    130                 135                 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr

145                 150                 155                 160

Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser

                165                 170                 175

Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys

            180

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F1

<400>3

cggaat tcgg catggacatc gaccct tat                                      29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R1

<400>4

ccgctcgaga gttccccacc ttatgagtc                                         29

<210>5

<211>3000

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)……(3000)

<400>5

atggcagaca aagttaggag gcagaggccg aggaggcgag tctgttgggc cttggtggct    60

gtgctcttgg cagacctgtt ggcactgagt gatacactgg cagtgatgtc tgtggacctg   120

ggcagtgagt ccatgaaggt ggccattgtc aaacctggag tgcccatgga aattgtcttg   180

aataaggaat ctcggaggaa aacaccggtg atcgtgaccc tgaaagaaaa tgaaagattc   240

tttggagaca gtgcagcaag catggcgatt aagaatccaa aggctacgct acgttacttc   300

cagcacctcc tggggaagca ggcagataac ccccatgtag ctctttacca ggcccgcttc   360

ccggagcacg agctgacttt cgacccacag aggcagactg tgcactttca gatcagctcg   420

cagctgcagt tctcacctga ggaagtgttg ggcatggttc tcaattattc tcgttctcta   480

gctgaagatt ttgcagagca gcccatcaag gatgcagtga tcaccgtgcc agtcttcttc   540

aaccaggccg agcgccgagc tgtgctgcag gctgctcgta tggctggcct caaagtgctg   600

cagctcatca atgacaacac cgccactgcc ctcagctatg gtgtcttccg ccggaaagat   660

attaacacca ctgcccagaa tatcatgttc tatgacatgg gctcaggcag caccgtatgc   720

accattgtga cctaccagat ggtgaagact aaggaagctg ggatgcagcc acagctgcag   780

atccggggag taggatttga ccgtaccctg gggggcctgg agatggagct ccggcttcga   840

gaacgcctgg ctgggctttt caatgagcag cgcaagggtc agagagcaaa ggatgtgcgg   900

gagaacccgc gtgccatggc caagctgctg cgtgaggcta atcggctcaa aaccgtcctc   960

agtgccaacg ctgaccacat ggcacagatt gaaggcctga tggatgatgt ggacttcaag  1020

gcaaaagtga ctcgtgtgga atttgaggag ttgtgtgcag acttgtttga gcgggtgcct  1080

gggcctgtac agcaggccct ccagagtgcc gaaatgagtc tggatgagat tgagcaggtg  1140

atcctggtgg gtggggccac tcgggtcccc agagttcagg aggtgctgct gaaggccgtg  1200

ggcaaggagg agctggggaa gaacatcaat gcagatgaag cagccgccat gggggcagtg  1260

taccaggcag ctgcgctcag caaagccttt aaagtgaagc catttgtcgt ccgagatgca  1320

gtggtctacc ccatcctggt ggagttcacg agggaggtgg aggaggagcc tgggattcac  1380

agcctgaagc acaataaacg ggtactcttc tctcggatgg ggccctaccc tcaacgcaaa  1440

gtcatcacct ttaaccgcta cagccatgat ttcaacttcc acatcaacta cggcgacctg  1500

ggcttcctgg ggcctgaaga tcttcgggta tttggctccc agaatctgac cacagtgaag  1560

ctaaaagggg tgggtgacag cttcaagaag tatcctgact acgagtccaa gggcatcaag  1620

gctcacttca acctggatga gagtggcgtg ctcagtctag acagggtgga gtctgtattt  1680

gagacactgg tagaggacag cgcagaagag gaatctactc tcaccaaact tggcaacacc  1740

atttccagcc tgtttggagg cggtaccaca ccagatgcca aggagaatgg tactgatact  1800

gtccaggagg aagaggagag ccctgcagag gggagcaagg acgagcctgg ggagcaggtg  1860

gagctcaagg aggaagctga ggccccagtg gaggatggct ctcagccccc accccctgaa  1920

cctaagggag atgcaacccc tgagggagaa aaggccacag aaaaagaaaa tggggacaag  1980

tctgaggccc agaaaccaag tgagaaggca gaggcagggc ctgagggcgt cgctccagcc  2040

ccagagggag agaagaagca gaagcccgcc aggaagcggc gaatggtaga ggagatcggg  2100

gtggagctgg ttgttctgga cctgcctgac ttgccagagg ataagctggc tcagtcggtg  2160

cagaaacttc aggacttgac actccgagac ctggagaagc aggaacggga aaaagctgcc 2220

aacagcttgg aagcattcat atttgagacc caggacaagc tgtaccagcc cgagtaccag 2280

gaagtgtcca cagaggagca gcgtgaggag atctctggga agctcagcgc cgcatccacc 2340

tggctggagg atgagggtgt tggagccacc acagtgatgt tgaaggagaa gctggctgag 2400

ctgaggaagc tgtgccaagg gctgtttttt cgggtagagg agcgcaagaa gtggcccgaa 2460

cggctgtctg ccctcgataa tctcctcaac cattccagca tgttcctcaa gggggcccgg 2520

ctcatcccag agatggacca gatcttcact gaggtggaga tgacaacgtt agagaaagtc 2580

atcaatgaga cctgggcctg gaagaatgca actctggccg agcaggctaa gctgcccgcc 2640

acagagaagc ctgtgttgct ctcaaaagac attgaagcta agatgatggc cctggaccga 2700

gaggtgcagt atctgctcaa taaggccaag tttaccaagc cccggccccg gcctaaggac 2760

aagaatggga cccgggcaga gccacccctc aatgccagtg ccagtgacca gggggagaag 2820

gtcatccctc cagcaggcca gactgaagat gcagagccca tttcagaacc tgagaaagta 2880

gagactggat ccgagccagg agacactgag cctttggagt taggaggtcc tggagcagaa 2940

cctgaacaga aagaacaatc gacaggacag aagcggcctt tgaagaacga cgaactataa 3000

<210>6

<211>999

<212>PRT

<213>智人(homo sapiens)

<400>6

Met Ala Asp Lys Val Arg Arg Gln Arg Pro Arg Arg Arg Val Cys Trp

  1               5                  10                  15

Ala Leu Val Ala Val Leu Leu Ala Asp Leu Leu Ala Leu Ser Asp Thr

             20                  25                  30

Leu Ala Val Met Ser Val Asp Leu Gly Ser Glu Ser Met Lys Val Ala

         35                  40                  45

Ile Val Lys Pro Gly Val Pro Met Glu Ile Val Leu Asn Lys Glu Ser

     50                  55                  60

Arg Arg Lys Thr Pro Val Ile Val Thr Leu Lys Glu Asn Glu Arg Phe

65                  70                  75                  80

Phe Gly Asp Ser Ala Ala Ser Met Ala Ile Lys Asn Pro Lys Ala Thr

                 85                  90                  95

Leu Arg Tyr Phe Gln His Leu Leu Gly Lys Gln Ala Asp Asn Pro His

            100                 105                 110

Val Ala Leu Tyr Gln Ala Arg Phe Pro Glu His Glu Leu Thr Phe Asp

        115                 120                 125

Pro Gln Arg Gln Thr Val His Phe Gln Ile Ser Ser Gln Leu Gln Phe

    130                 135                 140

Ser Pro Glu Glu Val Leu Gly Met Val Leu Asn Tyr Ser Arg Ser Leu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Asp Phe Ala Glu Gln Pro Ile Lys Asp Ala Val Ile Thr Val

                165                 170                 175

Pro Val Phe Phe Asn Gln Ala Glu Arg Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala

            180                 185                 190

Arg Met Ala Gly Leu Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn Asp Asn Thr Ala

        195                 200                 205

Thr Ala Leu Ser Tyr Gly Val Phe Arg Arg Lys Asp Ile Asn Thr Thr

    210                 215                 220

Ala Gln Asn Ile Met Phe Tyr Asp Met Gly Ser Gly Ser Thr Val Cys

225                 230                 235                 240

Thr Ile Val Thr Tyr Gln Met Val Lys Thr Lys Glu Ala Gly Met Gln

                245                 250                 255

Pro Gln Leu Gln Ile Arg Gly Val Gly Phe Asp Arg Thr Leu Gly Gly

            260                 265                 270

Leu Glu Met Glu Leu Arg Leu Arg Glu Arg Leu Ala Gly Leu Phe Asn

        275                 280                 285

Glu Gln Arg Lys Gly Gln Arg Ala Lys Asp Val Arg Glu Asn Pro Arg

    290                 295                 300

Ala Met Ala Lys Leu Leu Arg Glu Ala Asn Arg Leu Lys Thr Val Leu

305                 310                 315                 320

Ser Ala Asn Ala Asp His Met Ala Gln Ile Glu Gly Leu Met Asp Asp

                325                 330                 335

Val Asp Phe Lys Ala Lys Val Thr Arg Val Glu Phe Glu Glu Leu Cys

            340                 345                 350

Ala Asp Leu Phe Glu Arg Val Pro Gly Pro Val Gln Gln Ala Leu Gln

        355                 360                 365

Ser Ala Glu Met Ser Leu Asp Glu Ile Glu Gln Val Ile Leu Val Gly

    370                 375                 380

Gly Ala Thr Arg Val Pro Arg Val Gln Glu Val Leu Leu Lys Ala Val

385                 390                 395                 400

Gly Lys Glu Glu Leu Gly Lys Asn Ile Asn Ala Asp Glu Ala Ala Ala

                405                 410                 415

Met Gly Ala Val Tyr Gln Ala Ala Ala Leu Ser Lys Ala Phe Lys Val

            420                 425                 430

Lys Pro Phe Val Val Arg Asp Ala Val Val Tyr Pro Ile Leu Val Glu

        435                 440                 445

Phe Thr Arg Glu Val Glu Glu Glu Pro Gly Ile His Ser Leu Lys His

    450                 455                 460

Asn Lys Arg Val Leu Phe Ser Arg Met Gly Pro Tyr Pro Gln Arg Lys

465                 470                 475                 480

Val Ile Thr Phe Asn Arg Tyr Ser His Asp Phe Asn Phe His Ile Asn

                485                 490                 495

Tyr Gly Asp Leu Gly Phe Leu Gly Pro Glu Asp Leu Arg Val Phe Gly

            500                 505                 510

Ser Gln Asn Leu Thr Thr Val Lys Leu Lys Gly Val Gly Asp Ser Phe

        515                 520                 525

Lys Lys Tyr Pro Asp Tyr Glu Ser Lys Gly Ile Lys Ala His Phe Asn

    530                 535                 540

Leu Asp Glu Ser Gly Val Leu Ser Leu Asp Arg Val Glu Ser Val Phe

545                 550                 555                 560

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Ala Glu Glu Glu Ser Thr Leu Thr Lys

                565                 570                 575

Leu Gly Asn Thr Ile Ser Ser Leu Phe Gly Gly Gly Thr Thr Pro Asp

            580                 585                 590

Ala Lys Glu Asn Gly Thr Asp Thr Val Gln Glu Glu Glu Glu Ser Pro

        595                 600                 605

Ala Glu Gly Ser Lys Asp Glu Pro Gly Glu Gln Val Glu Leu Lys Glu

    610                 615                 620

Glu Ala Glu Ala Pro Val Glu Asp Gly Ser Gln Pro Pro Pro Pro Glu

625                 630                 635                 640

Pro Lys Gly Asp Ala Thr Pro Glu Gly Glu Lys Ala Thr Glu Lys Glu

                645                 650                 655

Asn Gly Asp Lys Ser Glu Ala Gln Lys Pro Ser Glu Lys Ala Glu Ala

            660                 665                 670

Gly Pro Glu Gly Val Ala Pro Ala Pro Glu Gly Glu Lys Lys Gln Lys

        675                 680                 685

Pro Ala Arg Lys Arg Arg Met Val Glu Glu Ile Gly Val Glu Leu Val

    690                 695                 700

Val Leu Asp Leu Pro Asp Leu Pro Glu Asp Lys Leu Ala Gln Ser Val

705                 710                 715                 720

Gln Lys Leu Gln Asp Leu Thr Leu Arg Asp Leu Glu Lys Gln Glu Arg

                725                 730                 735

Glu Lys Ala Ala Asn Ser Leu Glu Ala Phe Ile Phe Glu Thr Gln Asp

            740                 745                 750

Lys Leu Tyr Gln Pro Glu Tyr Gln Glu Val Ser Thr Glu Glu Gln Arg

        755                 760                 765

Glu Glu Ile Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Ser Thr Trp Leu Glu Asp

    770                 775                 780

Glu Gly Val Gly Ala Thr Thr Val Met Leu Lys Glu Lys Leu Ala Glu

785                 790                 795                 800

Leu Arg Lys Leu Cys Gln Gly Leu Phe Phe Arg Val Glu Glu Arg Lys

                805                 810                 815

Lys Trp Pro Glu Arg Leu Ser Ala Leu Asp Asn Leu Leu Asn His Ser

            820                 825                 830

Ser Met Phe Leu Lys Gly Ala Arg Leu Ile Pro Glu Met Asp Gln Ile

        835                 840                 845

Phe Thr Glu Val Glu Met Thr Thr Leu Glu Lys Val Ile Asn Glu Thr

    850                 855                 860

Trp Ala Trp Lys Asn Ala Thr Leu Ala Glu Gln Ala Lys Leu Pro Ala

865                 870                 875                 880

Thr Glu Lys Pro Val Leu Leu Ser Lys Asp Ile Glu Ala Lys Met Met

                885                 890                 895

Ala Leu Asp Arg Glu Val Gln Tyr Leu Leu Asn Lys Ala Lys Phe Thr

            900                 905                 910

Lys Pro Arg Pro Arg Pro Lys Asp Lys Asn Gly Thr Arg Ala Glu Pro

        915                 920                 925

Pro Leu Asn Ala Ser Ala Ser Asp Gln Gly Glu Lys Val Ile Pro Pro

    930                 935                 940

Ala Gly Gln Thr Glu Asp Ala Glu Pro Ile Ser Glu Pro Glu Lys Val

945                 950                 955                 960

Glu Thr Gly Ser Glu Pro Gly Asp Thr Glu Pro Leu Glu Leu Gly Gly

                965                 970                 975

Pro Gly Ala Glu Pro Glu Gln Lys Glu Gln Ser Thr Gly Gln Lys Arg

            980                 985                 990

Pro Leu Lys Asn Asp Glu Leu

        995

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F2

<400>7

accggatcct cgcaaataaa atagt                                25

<210>8

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物R2

<400>8

gtacagtcta gattaatggt gatggtgatg atgtgaaggc cgcttctgtc c       51

Claims (5)

1.乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物，其特征在于：由乙型肝炎病毒核心抗原与糖调蛋白170以非共价键结合而成，所述乙型肝炎病毒核心抗原具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，糖调蛋白170具有SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物，其特征在于：由乙型肝炎病毒核心抗原与糖调蛋白170以摩尔比为1∶1结合而成。

3.权利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征在于：在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液即PBS中，分别加入乙型肝炎病毒核心抗原和糖调蛋白170，混合均匀，在43℃孵育30分钟，再在37℃孵育1小时，即得乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物。

4.根据权利要求3所述乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征在于：按摩尔比为1∶1加入乙型肝炎病毒核心抗原和糖调蛋白170，使乙型肝炎病毒核心抗原和糖调蛋白170在PBS中的浓度均为3～6μg/mL。

5.权利要求1所述乙型肝炎病毒核心抗原与热休克蛋白的复合物在制备乙型肝炎治疗性疫苗中的应用。

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