CN101914030B

CN101914030B - 一种13c，15n双标记甘氨酸的合成方法

Info

Publication number: CN101914030B
Application number: CN 201010234977
Authority: CN
Inventors: 徐建飞; 王刚; 王伟; 宋明鸣; 李良君; 杜晓宁
Original assignee: Shanghai Research Institute of Chemical Industry SRICI
Current assignee: Shanghai Research Institute of Chemical Industry SRICI
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2030-07-23
Also published as: CN101914030A

Abstract

本发明涉及一种¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，采用以¹³C标记乙酸为原料，经过溴代反应，制备得到¹³C标记溴代乙酸。该物质和U-¹⁵N标记六亚甲基四胺在乙醇溶液中反应，反应pH值为7-10。反应得到的粗产物用乙醇重结晶，即可得到¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸。与现有技术相比，本发明甘氨酸得率≥85％，¹³C丰度≥99％，¹⁵N丰度≥99％，纯度≥99％，工艺简单，适合批量生产¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸。

Description

一种13C,15N双标记甘氨酸的合成方法

技术领域

本发明涉及一种¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的有机合成方法，尤其涉及一种甘氨酸-1-¹³C，¹⁵N、甘氨酸-2-¹³C，¹⁵N和甘氨酸-1，2-¹³C₂，¹⁵N的方法。

背景技术

¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸，又名¹³C，¹⁵N双标记氨基乙酸，本发明所述的¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸，包括甘氨酸-1-¹³C，¹⁵N、甘氨酸-2-¹³C，¹⁵N和甘氨酸-1，2-¹³C₂，¹⁵N三种¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸。甘氨酸为带甜味的白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，微溶于醇和醚，熔点263℃(233℃开始分解)。¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸是一种重要的氨基酸标记物，广泛应用于植物营养研究(葛体达，黄丹枫，宋世威等，番茄幼苗对¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸(glycine)的吸收，中国园艺学会第八届青年学术讨论会中国园艺学会第八届青年学术讨论会论文集，2008年)和双标记复合肥料的研究(HodgeA，Robinson D，Griffiths B S，et al.Why plants bother：root proliferation results inincreased nitrogen capture from an organic patch when two grasses compete.Plant Celland Environment，1999，22，811-820；Hodge A，Stewart J，Robinson D，et al.Competition between roots and soil micro-organisms for nutrients from nitrogen-richpatches ofvarying complexity.Journal of Ecology，2000a，88，150-164)，也可以作为原料合成其它¹³C，¹⁵N双标记氨基酸如丝氨酸、苯丙氨酸等。

对于¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的合成，目前有Schmidt法和改进的Gabriel法。Schmidt法是利用¹³C脂肪酸或脂肪酰卤与¹⁵N标记叠氮酸反应生成少于原脂肪酸一个碳原子的胺。此方法收率偏低，并且在合成过程中损失一个标记¹³C原子和反应副产物N₂难以回收利用，¹³C和¹⁵N利用率偏低，生产成本提高。改进的Schmidt法是脂肪酰卤和氨气反应后，形成酰胺后采用LiAlH₄还原成胺。此方法是原料¹³C标记脂肪酰卤难以制备，并且价格昂贵，不适合¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的合成。改进的Gabriel法是利用¹³C标记氰化钠和¹⁵N标记邻苯二甲酰亚氯甲胺为原料，经过4步反应合成。但由于¹³C标记氰化钠是剧毒物，购买或制备都不便利，因此此方法也不是较合适的方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种方法简单、可行并适合批量生产的¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)¹³C标记溴代乙酸的制备

将¹³C标记乙酸和三氟醋酐混合，使¹³C标记乙酸的加入量为0.1mol/(30～50)ml三氟醋酐，然后加入水和吡啶，三氟醋酐、水和吡啶的体积比为(30～50)∶(0.5-1)∶(0.5-1)，在冰水浴冷却下充分混合后，再在油浴上加热，慢慢滴加液溴，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜，液溴与¹³C标记乙酸的摩尔比为(0.5～5)∶1，反应温度为40～80℃，反应时间为2～24小时，反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到¹³C标记溴代乙酸；

(2)¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的制备

将U-¹⁵N-六亚甲基四胺和乙醇混合，U-¹⁵N-六亚甲基四胺的加入量为(0.05～0.5)mol/(120～150)ml乙醇，调节反应体系pH＝7～10之间，加入¹³C标记溴代乙酸，U-¹⁵N-六亚甲基四胺与¹³C标记溴代乙酸反应摩尔比为(0.5～5)∶1，水浴加热，磁力搅拌反应，反应温度为40～80℃，反应时间为1～5小时，反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品，粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸；

反应路线如下：

步骤(1)所述的液溴与¹³C标记乙酸的摩尔比为1.5～2∶1，反应温度为60℃，反应时间为10～12小时。

步骤(1)所述的¹³C标记乙酸为乙酸-1-¹³C，乙酸-2-¹³C或乙酸-1，2-¹³C₂，对应的¹³C标记溴代乙酸为溴代乙酸-1-¹³C，溴代乙酸-2-¹³C和溴代乙酸-1，2-¹³C₂。

步骤(2)所述的U-¹⁵N-六亚甲基四胺与¹³C标记溴代乙酸反应摩尔比为(2～3)∶1，反应温度为60℃，反应时间为2～3小时。

步骤(2)所述的反应体系pH＝8～9。

步骤(2)所述的反应体系pH值用10mol/L NaOH进行调节。

步骤(2)所述的¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸为甘氨酸-1-¹³C，¹⁵N、甘氨酸-2-¹³C，¹⁵N或甘氨酸-1，2-¹³C₂，¹⁵N。

与现有技术相比，本发明采用¹³C标记乙酸和U-¹⁵N标记六亚甲基四胺为原料，经过一条有机合成的路线得到¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸。收率达到85％(以¹³C标记乙酸计)，¹³C和¹⁵N丰度都大于99％(用Thermo的液相色谱-质谱联用仪和MAT271同位素质谱仪测试)，化学纯度大于99％(Waters液相色谱和Nicole公司的Mahna-IR550红外光谱仪测定)。此方法标记¹³C，¹⁵N同位素工艺简单，适合批量生产¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0.1mol乙酸-1-¹³C和40ml三氟醋酐混合，小心地加入水0.5ml和吡啶1ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热至80℃，将0.05mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜。反应12小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-1-¹³C。

将0.5mol U-¹⁵N-六亚甲基四胺和120ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系pH＝8，加入0.1mol ¹³C标记溴代乙酸，水浴加热至40℃，磁力搅拌反应5小时。反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-1-¹³C，¹⁵N 6.63克，收率为86.1％，¹³C丰度99.1％，¹⁵N丰度99.2％，纯度99.5％。

实施例2

在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0.1mol乙酸-2-¹³C和30ml三氟醋酐混合，小心地加入水1ml和吡啶0.75ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热至40℃，将0.5mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜。反应24小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-2-¹³C。

将0.05mol U-¹⁵N-六亚甲基四胺和150ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系pH＝10，加入0.1mol ¹³C标记溴代乙酸，水浴加热至60℃，磁力搅拌反应1小时。反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-2-¹³C，¹⁵N 6.20克，收率为80.5％，¹³C丰度99.0％，¹⁵N丰度99.2％，纯度99.8％。

实施例3

在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0.1mol乙酸-1，2-¹³C₂和50ml三氟醋酐混合，小心地加入水0.7ml和吡啶0.5ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热至60℃，将0.2mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜。反应2小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-1，2-¹³C₂。

将0.25mol U-¹⁵N-六亚甲基四胺和140ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系pH＝7，加入0.1mol ¹³C标记溴代乙酸，水浴加热至80℃，磁力搅拌反应3小时。反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-1，2-¹³C₂，¹⁵N 6.55克，收率为85.1％，¹³C丰度99.1％，¹⁵N丰度99.1％，纯度99.7％。

实施例4

在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0.1mol乙酸-1-¹³C和35ml三氟醋酐混合，小心地加入水0.6ml和吡啶0.4ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热至60℃，将0.15mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜，反应10小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-1-¹³C。

将0.2mol U-¹⁵N-六亚甲基四胺和130ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系pH＝7，加入0.1mol溴代乙酸-1-¹³C，水浴加热至80℃，磁力搅拌反应2小时。反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-1-¹³C，¹⁵N 6.55克，收率为85.1％，¹³C丰度99.1％，¹⁵N丰度99.1％，纯度99.7％。

实施例5

在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0.1mol乙酸-2-¹³C和30ml三氟醋酐混合，小心地加入水1ml和吡啶0.75ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热至40℃，将0.5mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜，反应24小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-2-¹³C。

将0.3mol U-¹⁵N-六亚甲基四胺和150ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系pH＝9，加入0.1mol溴代乙酸-2-¹³C，水浴加热至60℃，磁力搅拌反应3小时。反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-2-¹³C，¹⁵N 6.20克，收率为80.5％，¹³C丰度99.0％，¹⁵N丰度99.2％，纯度99.8％。

实施例6

在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0.1mol乙酸-1，2-¹³C₂和30ml三氟醋酐混合，小心地加入水1ml和吡啶0.75ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热至40℃，将0.5mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜。反应24小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-1，2-¹³C₂。

将0.3mol U-¹⁵N-六亚甲基四胺和150ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系pH＝9，加入0.1mol ¹³C标记溴代乙酸，水浴加热至60℃，磁力搅拌反应3小时。反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-1，2-¹³C₂，¹⁵N 6.55克，收率为85.1％，¹³C丰度99.1％，¹⁵N丰度99.1％，纯度99.7％。

Claims

1.一种¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）¹³C标记溴代乙酸的制备

将¹³C标记乙酸和三氟醋酐混合，使¹³C标记乙酸的加入量为0.1mol/（30～50）ml三氟醋酐，然后加入水和吡啶，三氟醋酐、水和吡啶的体积比为（30～50）：（0.5-1）：（0.5-1），在冰水浴冷却下充分混合后，再在油浴上加热，慢慢滴加液溴，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜，液溴与¹³C标记乙酸的摩尔比为（0.5～5）：1，反应温度为40～80℃，反应时间为2～24小时，反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到¹³C标记溴代乙酸；

（2）¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的制备

将U-¹⁵N-六亚甲基四胺和乙醇混合，U-¹⁵N-六亚甲基四胺的加入量为（0.05～0.5）mol/(120～150)ml乙醇，调节反应体系pH=7～10之间，加入¹³C标记溴代乙酸，U-¹⁵N-六亚甲基四胺与¹³C标记溴代乙酸反应摩尔比为（0.5～5）：1，水浴加热，磁力搅拌反应，反应温度为40～80℃，反应时间为1～5小时，反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品，粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤（1）所述的液溴与¹³C标记乙酸的摩尔比为1.5～2：1，反应温度为60℃，反应时间为10～12小时。

3.根据权利要求1所述的一种¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤（1）所述的¹³C标记乙酸为乙酸-1-¹³C，乙酸-2-¹³C或乙酸-1,2-¹³C₂，对应的¹³C标记溴代乙酸为溴代乙酸-1-¹³C，溴代乙酸-2-¹³C和溴代乙酸-1,2-¹³C₂。

4.根据权利要求1所述的一种¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤（2）所述的U-¹⁵N-六亚甲基四胺与¹³C标记溴代乙酸反应摩尔比为（2～3）：1，反应温度为60℃，反应时间为2～3小时。

5.根据权利要求1所述的一种¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤（2）所述的反应体系pH=8～9。

6.根据权利要求1所述的一种¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤（2）所述的反应体系pH值用10mol/L NaOH进行调节。

7.根据权利要求1所述的一种¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤（2）所述的¹³C,¹⁵N双标记甘氨酸为甘氨酸-1-¹³C,¹⁵N、甘氨酸-2-¹³C,¹⁵N或甘氨酸-1,2-¹³C₂,¹⁵N。