CN101913992B - 中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗h3n2病毒注射剂的制备方法 - Google Patents
中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗h3n2病毒注射剂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗H3N2病毒注射剂的制备方法，是以聚戊烯醇含量低于40％的植物脂溶性不皂化物为原料，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，两者质量之比为1∶(1～20)，脱色剂与聚戊烯醇粗品质量比为(10～150)∶100，50～120℃下搅拌脱色10～80min。脱色后的聚戊烯醇再经过中压柱层析分离，即获得90％以聚戊烯醇，可用于保护H3N2甲型流感病毒攻击的新药开发。该方法与以往纯化方法相比，具有收率高、方便、经济、适合工业化生产等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗H3N2甲型流感病毒的聚戊烯醇注射剂的制备方法，尤其涉及聚戊烯醇抗病毒新药的开发。
背景技术
流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型(H1～H15)，N有9个亚型(N1～N9)。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株，具有高致病性的H5N1、H7N7、H9N2等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。目前防治流感病毒可采用流感疫苗，急需开发抗流感病毒新药。
聚戊烯醇类化合物广泛存在于被子植物、裸子植物、细菌、真菌及哺乳动物中。聚戊烯醇(polyprenols)是植物中天然的类脂化合物，以C5异戊烯基为结构单元，由一系列异戊烯基单元组成的同系聚合物。研究表明，聚戊烯醇类化合物对人体无毒、无致突变、无致畸和无致癌作用，具有明显的生理、药理作用。生理学研究表明，聚戊烯醇对细胞膜的结构和功能具有调节作用，可改善膜的流动性、稳定性和渗透性，从而可增强膜的融合。外源性聚戊烯醇在体内可代谢为多萜醇，以补充体内多萜醇的不足，对提高免疫功能、肝细胞再生、抑制癌细胞转移和辅助放、化疗等具有明显作用，也可作为癌症病人的诊断剂。拉脱维亚等国已批准用于保健食品生产和药品开发，制备了“ROPREN”系列药物。而国内外对于聚戊烯醇用于保护H3N2甲型流感病毒的攻击新药开发还是空白。
对于聚戊烯醇新药的开发，分离纯化90％以上聚戊烯醇及其制剂的加工是关键。国内外对于植物聚戊烯醇的分离纯化已有文献报道，主要纯化路线是通过几次硅胶柱层析将聚戊烯醇粗提物纯度提高到90％以上。此外，还有一些其他纯化方法，如采用极性介质树脂(氧化铝或聚酰胺等)吸附，溶剂萃取和结晶，得到纯度为70％～75％的聚戊烯醇产品，得率1.0％左右。采用石油醚-乙酸乙酯冷冻脱杂后再进行硅胶柱层析纯化，制备纯度92.7％聚戊烯醇。但产品中仍含有大量的类胡萝卜素等黄色素，Tetsuo Takigawa等曾采用活性炭一种脱色剂对聚戊烯醇粗提物脱色，但活性炭用量大，脱色效果差，聚戊烯醇损失大。因此，传统的聚戊烯醇纯化路线存在明显缺点：繁琐、成本高、收率低，不适合工业化生产。
本专利以聚戊烯醇含量低于40％的植物脂溶性不皂化物为原料，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，脱色后的聚戊烯醇再经过中压柱层析分离，即获得90％以上聚戊烯醇，可用于保护H3N2甲型流感病毒攻击的新药开发。该方法与以往纯化方法相比，具有收率高、方便、经济、适合工业化生产等优点。
发明内容
本发明提出一种快捷简便、经济、适合工业化生产的纯化90％以上聚戊烯醇及其抗病毒作用注射剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明一种中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗H3N2病毒注射剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步、植物脂溶性不皂化物冷冻
将聚戊烯醇含量低于40％的植物脂溶性不皂化物按固液比(g/mL)为1∶(1～10)溶解于特制的溶剂中，在-10℃至-40℃冷冻1～48h，-10℃至-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏；
第二步、脱色
将聚戊烯醇软膏按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土按质量比为1∶(3～8)作为脱色剂，聚戊烯醇软膏与脱色剂用量按质量比为(1～5)∶(1～5)，脱色温度50～120℃，脱色时间20～50min，过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇；
第三步、中压柱纯化
将脱色聚戊烯醇与中压柱填料按质量比1∶(15～50)吸附，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、异丙醇和甲醇中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压为0.3～3MPa，紫外检测波长199～230nm，流速2～200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上聚戊烯醇；
第四步、制备抗H3N2甲型流感病毒制剂
5～10g 90％聚戊烯醇、3～5g卵磷脂、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、10～20g丙二醇、100g去离子水，在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇注射剂。
植物聚戊烯醇广泛存在于银杏叶和绿色针叶树的叶冠中，含量低于2％，大多以乙酸酯和磷酸酯等酯等的形式存在，仅有小量游离醇。聚戊烯醇及其酯类衍生物为非极性的脂类化合物，溶于极性小的溶剂。因此大多通过非极性溶剂提取聚戊烯醇乙酸酯，再通过皂化水解，将聚戊烯醇乙酸酯转化为聚戊烯醇。同时将浸膏中酸性物以及其他酯类转变为水溶性的盐，聚戊烯醇仍溶解在非极性溶剂中，从而达到分离。皂化均化方式、皂化温度、时间和皂化剂对皂化反应有明显影响，优化结果表明均化方式为磁力搅拌，转速50～300r/min，温度55～65℃，时间45～50min，皂化剂为5％～40％NaOH-EtOH，石油醚软膏与皂化剂的比例为1∶(5～10)(g/mL)。在工业化应用中，采用50～70℃热回流搅拌，转速150r/min，时间80～100min，皂化剂为5％NaOH-EtOH，石油醚软膏与皂化剂的比例为1∶(5～8)(g/mL)，制备不皂化物。
通常这种植物脂溶性不皂化物为棕色粘稠膏状物，含有大量的蜡质、胶状体、色素等杂质，流动性不好，聚戊烯醇的含量在5％～25％。在本专利中植物脂溶性不皂化物来源于银杏、马尾松、黑松、湿地松、圆柏、雪松中的一种或两种以上任意配比的叶冠部位，经石油醚、正己烷、溶剂汽油非极性溶剂浸提，皂化，萃取等工艺处理，得到聚戊烯醇含量低于40％的软膏。如表1。
表1不同树叶及其脂溶性不皂化物中聚戊烯醇含量(％)
针对低于40％聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物，本专利根据正己烷、乙酸乙酯和丙酮极性的差异性，采用正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝1∶(5～10)∶(89～94)特制的溶剂溶解植物脂溶性不皂化物，在-10℃至-40℃冷冻1～48h，-10℃至-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏。不仅可以除尽蜡质和胶状体，明显的改善聚戊烯醇软膏的流动性，而且聚戊烯醇的含量可提高20％～50％，聚戊烯醇的回收率大于90％。若采用单一的非极性溶剂溶解和去杂，聚戊烯醇损失在滤渣中，聚戊烯醇的回收率低于70％，而且聚戊烯醇纯度提高的不多，分离效果不好。
采用溶剂提取、皂化和萃取得到的植物脂溶性不皂化物及其冷冻制备的聚戊烯醇软膏，含有大量的棕黄色成分，因此颜色为深棕色，而聚戊烯醇为无色脂溶性类脂。本专利筛选普通颗粒炭、糖用脱色磷酸炭、味精脱色用炭、分子筛、活性白土、凹凸棒土、混合脱色剂等脱色剂，优化脱色工艺。首次公开一种分光光度法，在451nm比色测定聚戊烯醇脱色率。聚戊烯醇脱色率＝[(A0-A1)/A0]×100％，式中：A0-聚戊烯醇脱色前的吸光度；A1-聚戊烯醇脱色后的吸光度。设定原料中色素含量为y0，脱色一次，结果表明活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂达到的脱色效果最好。较未脱色聚戊烯醇相比，脱色色度降低200倍以上。如表2和图1。
表2不同脱色剂对GPP的脱色效果
本专利采用L9(34)正交试验确定最佳脱色条件，将聚戊烯醇软膏按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，优选1∶(6～10)；采用活性炭与凹凸棒土按质量比为1∶(3～8)作为脱色剂，优选1∶(5～6)；聚戊烯醇软膏与脱色剂用量按质量比为(1～5)∶(1～5)，优选(1～5)∶(1～2)；脱色温度50～120℃，优选50～80℃；脱色时间20～50min。过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇，脱色率大于96％，较未脱色聚戊烯醇相比，脱色后色度降低200倍以上。本发明不仅脱色效果好，而且采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，如，10g纯度38％的聚戊烯醇粗品溶于100mL石油醚，脱色剂用量10～15g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶5，脱色温度70～80℃，脱色时间20～30min。经过脱色，纯度提高到50％，聚戊烯醇基本无损失。以往任何聚戊烯醇的纯化工艺都会伴随聚戊烯醇的损失，而本发明的纯化路线，只要在合适的条件下脱色，就会保证聚戊烯醇无损失。
为了制备90％以上无色的聚戊烯醇，本专利采用中压柱纯化，中压柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，填料选择200～500目的硅胶和氧化铝中的一种或二种任意比，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～30)混合溶剂，优选石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～10)；也可选择5～25μODSC18和C8材料，优选10～20μ，流动相为异丙醇∶甲醇∶水＝(2～5)∶1∶(0.1～1)；中压柱填料采用干法装柱，N2加压，柱压为0.3～3MPa，紫外检测波长199～230nm，优选210nm，流速2～200mL/min，优选5～20mL/min。根据UV吸收峰值富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上无色的聚戊烯醇。
采用传统的硅胶柱层析的纯化方法，聚戊烯醇粗提物须经过连续三次硅胶柱层析，将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，最终收率7.4％。采用本发明的中压柱纯化，聚戊烯醇粗提物先在最佳条件下脱色，再经过一次中压柱层析即可将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，收率30％。与以往纯化方法相比，此种方法具有简便、快捷、经济的优点，而且收率明显提高4倍以上，同时适合工业化生产。
本专利公开HPLC外标法测定聚戊烯醇的纯度。通过HPLC分析，绘制标准曲线，测定聚戊烯醇的纯度。色谱柱为Kromasil C18 ODS-1(5μm，150×4.6mm)，柱温为室温，紫外检测波长210nm，流动相为异丙醇∶甲醇＝38∶37，流速为1.0mL/min。
本发明以无色的聚戊烯醇为原料，辅以卵磷脂、吐温-80、脱水山梨醇和丙二醇等乳化剂，加入去离子水，在室温下超声波乳化10～30min，形成的乳化剂4℃以下保存90天，结果表明，乳液均质稳定。在抗H3N2病毒药效应用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇注射剂。
本发明获得以下技术效果：
(1)本发明采用40％以下聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物冷冻，不仅可以除尽蜡质和胶状体，明显的改善聚戊烯醇软膏的流动性，而且聚戊烯醇的含量可提高20％～50％，聚戊烯醇的回收率大于90％。若采用单一的非极性溶剂溶解和去杂，聚戊烯醇损失在滤渣中，聚戊烯醇的回收率低于70％，而且聚戊烯醇纯度提高的不多，分离效果不好。
(2)本发明采用活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂脱色一次，较未脱色聚戊烯醇相比，脱色后色度降低200倍以上，脱色率大于96％，制备的无色聚戊烯醇可用于医药注射剂，并且凹凸棒土价格低廉，脱色装置设备易于实现，脱色条件容易控制，适合工业化生产。
(3)本发明采用活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂，经过脱色，聚戊烯醇纯度提高到50％，聚戊烯醇基本无损失。而以往任何聚戊烯醇的纯化工艺都会伴随聚戊烯醇的损失。
(4)采用传统的硅胶柱层析的纯化方法，聚戊烯醇粗提物须经过连续三次硅胶柱层析，将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，最终收率7.4％。采用本发明的中压柱纯化，聚戊烯醇粗提物先在最佳条件下脱色，再经过一次中压柱层析即可将聚戊烯醇的纯度提高到90％以上，收率30％。与以往纯化方法相比，此种方法具有简便、快捷、经济的优点，而且收率明显提高4倍以上，同时适合工业化生产。
附图说明
图1冷冻脱色后聚戊烯醇的HPLC图
图2C95 polyprenol标准曲线图
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗H3N2病毒注射剂的制备方法
第一步、植物脂溶性不皂化物冷冻
将聚戊烯醇含量低于40％的植物脂溶性不皂化物按固液比(g/mL)为1∶(1～10)溶解于特制的溶剂中，在-10℃至-40℃冷冻1～48h，-10℃至-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏；
第二步、脱色
将聚戊烯醇软膏按固液比(g/mL)为1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土按质量比为1∶(3～8)作为脱色剂，聚戊烯醇软膏与脱色剂用量按质量比为(1～5)∶(1～5)，脱色温度50～120℃，脱色时间20～50min，过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇；
第三步、中压柱纯化
将脱色聚戊烯醇与中压柱填料按质量比1∶(15～50)吸附，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、异丙醇和甲醇中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压0.3～3MPa，检测波长199～230nm，流速2～200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上聚戊烯醇；
第四步、制备抗H3N2甲型流感病毒制剂
5～10g 90％聚戊烯醇、3～5g卵磷脂、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、10～20g丙二醇、100g去离子水，在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇注射剂。
在本实施例中，植物脂溶性不皂化物来源于银杏、马尾松、黑松、湿地松、圆柏、雪松中的一种或两种以上任意配比的叶冠部位，经石油醚、正己烷、溶剂汽油非极性溶剂浸提，皂化，萃取等工艺处理，提取工艺可采用室温静泡、热回流索氏提取、超声波波提取、微波提取等，优化结果表明采用超声波提取，均化方式为磁力搅拌，转速为50～300r/min，温度55～65℃，时间45～50min，皂化剂为5％～40％NaOH-EtOH，聚戊烯醇软膏与皂化剂的比例为1∶(5～10)(g/mL)。在工业化应用中，采用50～70℃热回流搅拌，转速150r/min，时间80～100min，皂化剂为5％NaOH-EtOH，石油醚软膏与皂化剂的比例为1∶(5～8)(g/mL)，得到聚戊烯醇含量低于40％的软膏。
本实施例中，第一步特制的溶剂为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝1∶(5～10)∶(89～94)，优选正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝(5～10)∶(3～5)∶(85～92)。中压柱填料可选择200～500目的硅胶和氧化铝中的一种或二种任意比，优选一种，如硅胶或氧化铝。洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～30)混合溶剂，优选石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～10)。中压柱填料也可选择5～25μODS C18或C8材料，优选C8材料。流动相为异丙醇∶甲醇∶水＝(2～5)∶1∶(0.1～1)。
实施例2银杏叶脂溶性不皂化物的制备
取干燥银杏叶15kg，破碎成0.5cm。加150kg石油醚(60～90℃)，70℃热回流提取，时间4h，第二次提取加100kg石油醚(60～90℃)，重复以上操作。合并提取液，50℃下减压回收尽溶剂，得石油醚抽提物660g，加6L 5％NaOH-EtOH溶液，采用65℃热回流搅拌，150r/min，时间85min，石油醚软膏与皂化剂的比例为1∶5(g/mL)，反应结束，冷却至室温，用正己烷等体积萃取3～5次，合并有机层，用去离子水等体积反洗有机层，至水层pH7，浓缩有机层至1000mL，加入无水硫酸钠干燥10h，过滤，浓缩，制备脂溶性不皂化物225g，聚戊烯醇的含量25％。
实施例3聚戊烯醇的中压硅胶柱纯化方法
第一步，取25％聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物20g，加入250mL正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝8∶3∶89的混合溶剂中，在-30℃冷冻3h，-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏16g；
第二步，取10g纯度为31.8％的聚戊烯醇软膏，溶于100mL石油醚，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，脱色剂用量12g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶5，脱色温度70℃，搅拌脱色20min。经过脱色，纯度提高到49.6％。
第三步，硅胶中压柱层析，中压柱柱长30cm，柱直径2.5cm，硅胶400目，干法装柱，在-0.05至-0.08MPa抽空气20～30min，从柱的底部加入石油醚，直到石油醚全部充满柱子，空气排尽，在柱压为0.3～3MPa，检测波长210nm，流速10mL/min循环5-10Bv柱平衡后，将脱色后纯度为49.6％的聚戊烯醇6g溶于50mL石油醚中，柱压0.3～3MPa，检测波长199nm，流速6mL/min，依次使用石油醚、1％乙酸乙酯/石油醚、2％乙酸乙酯/石油醚、3％乙酸乙酯/石油醚洗脱，3％乙酸乙酯/石油醚的洗脱液富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备93％聚戊烯醇。
实施例4聚戊烯醇的中压氧化铝柱纯化方法
第一步，取25％聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物25g，加入250mL正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝10∶5∶85的混合溶剂，在-30℃冷冻3h，-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏13g；
第二步，取10g纯度为38.5％的聚戊烯醇软膏，溶于100mL石油醚，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，脱色剂用量12g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶7，脱色温度70℃，搅拌脱色20min。经过脱色，纯度提高到44.6％。
第三步，氧化铝中压柱层析，中压柱柱长50cm，柱直径5cm，氧化铝300目，干法装柱，在-0.05至-0.08MPa抽空气20～30min，从柱的底部加入石油醚，直到石油醚全部充满柱子，空气排尽，在柱压为0.3～3MPa，检测波长205nm，流速8mL/min循环5-10Bv柱平衡后，将纯度44.6％脱色聚戊烯醇6g溶于50mL石油醚中，柱压为0.3～3MPa，检测波长205nm，流速5mL/min，依次使用石油醚、3％乙酸乙酯/石油醚、5％乙酸乙酯/石油醚、10％乙酸乙酯/石油醚洗脱，5％乙酸乙酯/石油醚的洗脱液富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备94％聚戊烯醇。
实施例5聚戊烯醇的中压ODS C18柱纯化方法
第一步，取25％聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物30g，加入300mL正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝10∶5∶85的混合溶剂，-30℃冷冻3h，-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏22g；
第二步，取10g纯度为35.5％的聚戊烯醇软膏，溶于100mL石油醚，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，脱色剂用量10g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶3，脱色温度80℃，搅拌脱色30min。经过脱色，纯度提高到50.6％。
第三步，ODS C18中压柱层析，中压柱柱长50cm，柱直径5cm，ODS C18粒度20μ，干法装柱，在-0.05至-0.08MPa抽空气20～30min，从柱的底部加入甲醇，直到甲醇全部充满柱子，空气排尽，在柱压为0.3～3MPa，检测波长210nm，流速8mL/min循环5-10Bv柱平衡后，将纯度50.6％脱色聚戊烯醇5g溶于40mL的流动相(异丙醇∶甲醇∶水＝60∶35∶5)中，用注射枪加入ODS C18中压柱。再用3-6Bv流动相洗脱，HPLC检测，合并收集含量95％以上聚戊烯醇的洗脱部分，室温真空回收溶剂，制备97.2％聚戊烯醇。
实施例6聚戊烯醇的中压ODS C8柱纯化方法
第一步，取25％聚戊烯醇的植物脂溶性不皂化物30g，加入300mL正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝10∶5∶85的混合溶剂中，-30℃冷冻3h，-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏22g；
第二步，取10g纯度为35.5％的聚戊烯醇软膏，溶于100mL石油醚，采用活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂，脱色剂用量10g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶3，脱色温度80℃，搅拌脱色30min。经过脱色，纯度提高到50.6％。
第三步，ODS C8中压柱层析，中压柱柱长50cm，柱直径5cm，ODS C8粒度20μ，干法装柱，在-0.05至-0.08MPa抽空气20～30min，从柱的底部加入甲醇，直到甲醇全部充满柱子，空气排尽，在柱压为0.3～3MPa，检测波长210nm，流速10mL/min循环5-10Bv柱平衡后，将纯度50.6％脱色聚戊烯醇5g溶于40mL的流动相(异丙醇∶甲醇∶水＝60∶35∶5)中，用注射枪加入ODS C8中压柱。再用3-6Bv流动相洗脱，HPLC检测，合并收集含量95％以上聚戊烯醇的洗脱部分，室温真空回收溶剂，制备96.9％聚戊烯醇。
实施例7聚戊烯醇的脱色工艺优化方法
第一步、脱色剂的选择
筛选普通颗粒炭、糖用脱色磷酸炭、味精脱色用炭、分子筛、活性白土、凹凸棒土、混合脱色剂等脱色剂，在451nm比色测定聚戊烯醇脱色率。聚戊烯醇脱色率＝[(A0-A1)/A0]×100％，式中：A0-聚戊烯醇脱色前的吸光度；A1-聚戊烯醇脱色后的吸光度。
10g聚戊烯醇粗品置于250mL三口烧瓶中，加入100mL石油醚溶解，按选择的因素和水平进行脱色。脱色后的产品过滤、浓缩，测定吸光度，计算聚戊烯醇的脱色率。设定原料中色素含量为y0，脱色一次，结果表明活性炭与凹凸棒土的混合脱色剂达到的脱色效果最好，选择活性炭与凹凸棒土作为混合脱色剂。
第二步、聚戊烯醇脱色因素试验
(1)单因素试验
对脱色剂比例、脱色剂用量、脱色温度、脱色时间进行单因素试验。混合脱色剂活性炭与凹凸棒土的比例分别选取1∶5、1∶3、1∶1、2∶1；脱色剂用量(g)分别选取8、12、16；脱色温度(℃)分别选取20、40、60、80；脱色时间(min)分别选取5、10、15、30、40、60。
(2)正交试验
根据单因素试验结果，选取混合脱色剂的比例、脱色剂用量、脱色温度、脱色时间4个因素，以收率和脱色率两个指标考查脱色工艺，设计了4因素3水平[L9(34)]正交试验，得出银杏叶聚戊烯醇的最佳脱色条件。如表3和表4。
表3正交试验因素水平表
表4正交试验结果与分析
第三步、聚戊烯醇脱色最佳条件
通过对各因素的综合评价，由极差大小可见，A、B、C、D 4个因素影响收率的主次顺序为A＞B＞D＞C，即脱色剂用量＞脱色剂比例＞温度＞时间；影响脱色率的主次顺序为A＞D＞C＞B，即脱色剂用量＞温度＞时间＞脱色剂比例。考查总体脱色效果时，要求收率和脱色率尽量都要高，由表4可以看出最佳脱色工艺为A2B1C2D3和A3B1C3D2。两者脱色剂用量分别为12g和14g，而通过HPLC测定，得出这两种脱色条件下得到的聚戊烯醇纯度相差不大，从经济角度考虑，最终选择A2B1C2D3为最佳脱色工艺，即脱色剂用量12g，活性炭与凹凸棒土之比为1∶5，脱色温度70℃，脱色时间20min。
第四步、聚戊烯醇的HPLC方法
本专利通过HPLC分析，色谱柱为Kromasil C18 ODS-1(5μm，150×4.6mm)，柱温为室温，紫外检测波长210nm，流动相为异丙醇∶甲醇＝38∶37，流速为1.0mL/min。以C95 polyprenol为标准对照品，配制不同的浓度，绘制标准曲线，如图2，线性方程Y＝1.5751x+1.1546。根据HPLC标准曲线，同样条件下测定样品中聚戊烯醇的纯度。
实施例8聚戊烯醇的注射剂的配制方法
按100g聚戊烯醇的注射剂的配制，组成如下：
5～10g 90％聚戊烯醇、3～5g卵磷脂、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、10～20g丙二醇、100g去离子水，在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇注射剂。
实施例9聚戊烯醇抗H3N2病毒的药理试验
用H3N2甲型流感病毒感染MDCK细胞作为模型，进行聚戊烯醇抗流感病毒的药效试验。
受试药物：
将配制的聚戊烯醇注射剂加入少量卵磷脂和去离子水，超声波乳化，稀释到不同的浓度，供药效试验。
实验材料和仪器：
1.MDCK细胞：由实验室保存
2.H3N2甲型流感病毒：MDCK细胞传代，实验室保存
3.阳性对照病毒唑(利巴韦林)
4.细胞生长液和细胞维持液：细胞生长液为含10％FBS的DMEM；细胞维持液含2％FBS，其它同生长液。
5.主要试剂
96孔细胞培养板 Corning
DMEM培养基 Gibco-BRL
胎牛血清 Hyclone
6.重要仪器、设备
CO2培养箱 Thermo Forma
Benchmark Plus酶标仪 Bio-RAD
实验方法：
采用四氮唑还原法(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazoliumbromide assay MTT)检测药物对MDCK生长的抑制作用，以及药物对流感病毒的直接杀灭作用和对细胞的保护作用。
主要步骤：
一毒性实验
1.取MDCK细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell/mL，加入96孔培养板中(每孔100μL)。置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养过夜。
2.取出培养板，吸去上清后加入含有不同浓度药物的DMEM培养基(含5％胎牛血清)；放入细胞培养箱，继续37℃、5％CO2培养48小时。药物浓度分别为：100μg/mL，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL。
3.在96孔培养板各孔中加入10μL的MTT，重新放入培养箱继续培养4小时。仔细吸去上清，每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡使甲溶解，用酶标仪检测570nm处的OD值。
二病毒杀灭作用
4.取MDCK细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。调节细胞浓度至2×104cell/mL，加入96孔细胞培养板中(100μL/well)。37℃、5％CO2培养过夜。
5.不同浓度聚戊烯醇药物和100TCID50流感病毒混合，37℃孵育1小时。药物浓度分别为：100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，以及病毒唑10μg/mL(阳性对照)。
6.取出细胞培养板，吸出上清后依次加入孵育后的流感病毒；待病毒吸附1小时之后去除病毒液，PBS洗涤两次，加入细胞维持液继续培养。
7.72小时之后去除培养上清，MTT法测细胞活力。
三细胞保护作用
8.取MDCK细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液。调节细胞浓度至2×104cell/mL，加入96孔细胞培养板中(100μL/well)。37℃、5％CO2培养过夜。
9.取出细胞培养板，吸出上清后加入100TCID50病毒，37℃吸附细胞1小时。
10.吸附完毕后去除病毒液，PBS洗涤两次，加入含有不同浓度药物的细胞维持液继续培养。药物浓度分别为：100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL以及病毒唑10μg/mL(阳性对照)。
11.72小时之后去除培养上清，MTT法测细胞活力。
四数据处理
数据表示为means±SD；采用t-test检验，当P＜0.05时认为具有显著意义。
试验对照：
阳性对照药物为病毒唑；同时以不同浓度聚戊烯醇药物相应的溶媒作为空白对照。
实验结果：
1.药物毒性实验
不同稀释倍数的聚戊烯醇药物加于单层MDCK细胞上，每日观察细胞生长形态，检测有无病变；并以MTT法测定细胞的活力。结果表明，聚戊烯醇药物(0.01～100μM)作用下，用聚戊烯醇药组和未用药组均未见到明显的细胞形态异常及细胞破碎等毒性变化。如表5。
表5.聚戊烯醇药物对MDCK的生长抑制作用
药物作用48小时，MTT法测定细胞活力。x±s，n＝4.
2.抗H3N2甲型流感病毒作用
聚戊烯醇各浓度药物与病毒等量混合，37℃孵育1小时后，作用于细胞。结果显示，不同浓度聚戊烯醇药物对H3N2甲型流感病毒的直接杀灭具有很好的量效作用，高浓度的聚戊烯醇与病毒唑阳性药具有相同的直接杀灭H3N2甲型流感病毒的作用。病毒吸附细胞1小时之后给予药物治疗，结果显示，聚戊烯醇药物能提高MDCK细胞的存活数量，聚戊烯醇药物在大于501μg/mL的剂量组与对照组相比有显著差异，对受到H3N2甲型流感病毒攻击的细胞有很好的保护作用。如表6。
表6.聚戊烯醇药物对流感病毒的直接杀灭作用
实验重复两次，x±s，n＝3，**P＜0.01，***P＜0.005，compared with virus control.
实验结论
1.通过以上的药效实验表明，聚戊烯醇注射剂对MDCK细胞毒性较弱，实验中未见到MDCK细胞的形态异常及细胞破碎等毒性变化。在浓度最高到1D0μM时，对细胞生长没有抑制作用。
2.聚戊烯醇注射剂对H3N2甲型流感病毒不仅具有很好的直接杀灭作用，而且对受到H3N2病毒攻击的细胞有很好的保护作用。
3.聚戊烯醇注射剂抗甲型流感病毒的效果与病毒唑阳性药具有相同的效果，但无毒副作用。
Claims (4)
1.一种中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗H3N2病毒注射剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：
第一步、植物脂溶性不皂化物冷冻
将聚戊烯醇含量低于40％的植物脂溶性不皂化物按固液比g/mL为1∶(1～10)溶解于特制的溶剂中，在-10℃至-40℃冷冻1～48h，-10℃至-20℃离心过滤，二次，合并上清液，室温真空回收溶剂，制备聚戊烯醇软膏；特制的溶剂为正己烷∶乙酸乙酯∶丙酮＝1∶(5～10)∶(89～94)；
第二步、脱色
将聚戊烯醇软膏按固液比g/mL为1∶(1～30)溶解于石油醚中，采用活性炭与凹凸棒土按质量比为1∶(3～8)作为脱色剂，聚戊烯醇软膏与脱色剂用量按质量比为(1～5)∶(1～5)，脱色温度50～120℃，脱色时间20～50min，过滤，二次，合并脱色清液，室温真空回收溶剂，制备脱色聚戊烯醇；
第三步、中压柱纯化
将脱色聚戊烯醇与中压柱填料按质量比1∶(15～50)吸附，洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、异丙醇和甲醇中的一种或几种的混合溶液，中压柱柱长20～300cm，柱直径2～30cm，柱压0.3～3MPa，检测波长199～230nm，流速2～200mL/min，富集聚戊烯醇部位，室温真空回收溶剂，制备90％以上聚戊烯醇；
第四步、制备抗H3N2甲型流感病毒制剂
5～10g 90％聚戊烯醇、3～5g卵磷脂、3～5g吐温-80、1～5g脱水山梨醇、10～20g丙二醇、100g去离子水，在室温下超声波乳化10～30min，4℃以下保存，使用前用去离子水稀释到所需浓度，搅拌均匀，制成聚戊烯醇注射剂。
2.根据权利要求1所述的一种中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗H3N2病毒注射剂的制备方法，其特征在于第一步中植物脂溶性不皂化物来源于银杏、马尾松、黑松、湿地松、圆柏、雪松中的一种或两种以上任意配比的叶冠部位。
3.根据权利要求1所述的一种中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗H3N2病毒注射剂的制备方法，其特征在于第三步中压柱填料选择200～500目的硅胶和氧化铝中的一种或二种任意比，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝100∶(1～30)混合溶剂。
4.根据权利要求1所述的一种中压柱快速分离聚戊烯醇及其抗H3N2病毒注射剂的制备方法，其特征在于中压柱填料选自5～25μm ODS C18和C8材料，流动相为异丙醇∶甲醇∶水＝(2～5)∶1∶(0.1～1)。
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