一种马钱子总生物碱的制备方法及其制药用途
技术领域
本发明属于中药成分提取技术领域,具体涉及一种中药材马钱子总生物碱的制备方法及其制药用途,该制药用途主要应用于治疗风湿痹症。
背景技术
马钱子,又名苦实、番木鳖,为马钱科植物马钱子(Strychnos nux-vomica L.)或云南长籽马钱(Strychnos Pierriana A.W.Hill)的干燥成熟种子,始载于《本草纲目》,在《中国药典》的历版中都有记载。马钱子具有通络止痛、散结消肿功能,中医主治风湿顽痹、麻木瘫痪、跌扑损伤、痈疽肿痛等;常在“风湿马钱片”、“舒筋丸”、“疏络养肝丸”、“伤科七味片”、“九转回生丹”等中成药中使用。传统中医学认为,由于马钱子味苦、有大毒,因此一般需要炮制后入药,以降低其毒性。
众所周知,总生物碱是马钱子中最主要的有效部位,约占马钱子总量的2~5%。近十年的中医学研究表明,马钱子总生物碱中至少含有16种生物碱成分,其中主要成分为番木鳖碱(士的宁,strychnine)和马钱子碱(布鲁生,brucine),约占总生物碱总量的70~80%。马钱子碱作为药效成分,具有很强的镇痛抗炎等药理活性,而现有研究认为士的宁的这些药理活性相对较低,但却有强烈的中枢神经毒性。其毒性机制通常表现为:士的宁能对整个中枢神经系统引起兴奋作用,通常作用于脊髓,兴奋其反射功能,引起感觉器官敏感,调节大脑皮层兴奋性和抑制性过程,提高横纹肌、平滑肌和心肌的张力,终致强直性惊厥、呼吸麻痹而至致死(过振华、马红梅、张伯礼,《马钱子药理毒理研究回顾及安全性研究展望》,中西医结合学报,2008,6(6):645-649)。此外,黄韶清等学者经动物实验模型发现,小鼠分别灌胃士的宁和马钱子碱,其半数致死量LD50为3.27mg/kg和233mg/kg,小鼠分别腹腔注射士的宁和马钱子碱,其半数致死量LD50为1.53mg/kg和69mg/kg(黄韶清、周玉淑、刘仁树,《现代急性中毒诊治疗学》,北京:人民军医出版社,2002:354),更是进一步佐证了过振华等学者提出的“士的宁毒性巨大,不适合临床应用”观点。综上,目前学术界的观点通常认为,鉴于士的宁毒性巨大,必须想方设法去除士的宁来降低马钱子总生物碱的毒性,以确保临床用药的安全性。
南京中医药大学的蔡宝昌等人在目前学术界的通识上作了微调,认为全部去除士的宁虽然能够实现,但是成本高、其它生物碱成分损失也大,难以实现规模工业化生产;并且他们通过进一步实验研究发现,若能去除总生物碱中的部分士的宁,则既能降低其毒性,又能基本保留其原有的药理活性,更具有可行性和应用前景。如在其授权的中国发明专利(专利号为ZL201010107295.4,申请日为2010.02.08,发明名称为一种提取纯化马钱子总生物碱的方法及其在制药中的应用)中,公开了一种除去马钱子总生物碱中部分士的宁而得到纯化马钱子总生物碱的方法,该技术方案采用不同浓度的乙醇进行提取、纯化,以制得士的宁含量较低的马钱子总生物碱纯化品,然而,该技术方案的缺陷之处在于:①采用醇提方式,提取效率低,产物得率较低。②现有的治疗风湿痹症模式,依旧未脱离目前学术界的理论通识,即士的宁仍作为毒性成分对待,在制备马钱子总生物碱纯化品中仍然简单地以全部去除或部分去除士的宁的思路去提取、纯化。
发明内容
为解决现有技术存在的上述技术问题,本发明提供了一种马钱子总生物碱的制备方法,以及将该方法制得的马钱子总生物碱应用于治疗风湿痹症的药物中,尤其是治疗类风湿性关节炎的药物中。
本发明采取如下技术方案:
一种马钱子总生物碱的制备方法,其按如下步骤进行:
(1)将中药材马钱子粉碎、过10~40目筛,制得粗粉;
(2)称取粗粉100g~200g,用醇酸溶液1000mL~2000mL加热回流提取、离心、除去沉淀,减压回收醇酸溶液,得到浓缩液;
(3)加pH调节剂,将步骤(2)浓缩液的pH值调至9~14后,用苯或二氯甲烷或乙酸乙酯3000mL~4000mL萃取,减压回收溶剂,减压干燥(温度优选65℃~80℃),得到马钱子总生物碱粉末;
(4)将步骤(3)所得的马钱子总生物碱粉末溶于混酸溶液,离心,取上清液;
(5)继续加pH调节剂,将步骤(4)上清液的pH值调至10~13后,用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取,减压回收溶剂,减压干燥(温度优选65℃~80℃),得到纯化马钱子总生物碱。
本发明的发明人经长期实验研究,发现了一个迥异于与目前学术界通识的现象:马钱子总生物碱被应用于治疗风湿痹症时,总生物碱中的士的宁和马钱子碱都属于有效成分。士的宁作为药效成分能够协同马钱子碱治疗风湿痹症,尤其是在治疗类风湿性关节炎上表现出明显的协同增效作用;此外,当马钱子碱与士的宁为特定质量比时,士的宁还表现出了一定的促渗作用,能够促进马钱子碱的经皮渗透,提高药物的生物利用度。
基于上述颠覆了传统医学理论的研究发现,本发明独辟蹊径,提供了一种马钱子总生物碱的制备方法,通过该方法制得的马钱子总生物碱中含有具有特定质量比的马钱子碱和士的宁,且能够专用于治疗风湿痹症,解决了采用现有技术方案产物得率低、治疗风湿痹症药效差的技术缺陷。
优选的技术方案中,醇酸溶液为pH值3.0~6.0的C1-6的烷烃醇溶液(如乙醇、丙醇、丁醇等烷烃醇溶液);萃取溶剂为苯、二氯甲烷或乙酸乙酯;pH调节剂为碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠中的一种或几种;酸性溶液为硫酸、盐酸、磷酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸中的任意两种或两种以上的混合。
优选的技术方案中,步骤(1)所得的粗粉中,马钱子碱与士的宁的质量比为1:2~1:2.5。
优选的技术方案中,步骤(5)所得的纯化马钱子总生物碱中,马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.1~1:1.5。
优选的技术方案中,醇酸溶液为pH值3.0~6.0的乙醇溶液。
更优选的技术方案中,乙醇溶液的浓度为30~90%,加热回流的次数为2~4次,每次加热回流时间为1.0~3.0h。
优选的技术方案中,萃取溶剂为二氯甲烷。
优选的技术方案中,混酸溶液为硫酸、盐酸、磷酸、硝酸中任意两种的混合。
优选的技术方案中,pH调节剂为氢氧化钠。
由于马钱子总生物碱在醇酸溶液中时,部分转换为盐的形式,可以溶解在水中;而部分生物碱则未改变形态,可以最初的形态溶解在醇中,因此,在本发明中采用醇酸溶液,能够增大提取效率,使得马钱子总生物碱的产率得以提高。
此外,由于马钱子碱和士的宁质量比不同,所形成的盐的溶解度也各不相同,且差别较大,因此,在本发明中采用混酸溶液,通过调整混酸溶液的pH值以及控制物料的投料量,可以得到马钱子碱和士的宁的质量比为1:0.1~1:1.5的纯化马钱子总生物碱;透皮实验表明,在该特定质量比下,马钱子总生物碱的药物透过性能好,生物利用度显著提高。
本发明还提供了一种采用如前所述方法制得的纯化马钱子总生物碱在治疗风湿痹症中的应用,尤其是在治疗类风湿性关节炎中的应用。细胞药效实验表明,采用本发明制得的马钱子总生物碱中具有关节炎滑膜细胞的增殖抑制作用。中国专利号为ZL201010107295.4的发明专利采用乙醇溶液对马钱子药材进行提取,本发明基于马钱子生物碱理化性质和溶解性能考虑提取溶剂改用醇酸溶液,明显增大药材提取率。为减低毒性,中国专利号为ZL201010107295.4的发明专利采用醇沉法除去部分士的宁。但是,药效实验证明:有毒成分士的宁在治疗类风湿性关节炎时也为有效成分。因此,依据马钱子碱、士的宁在混酸中的溶解差异,本发明制得含有马钱子碱士的宁不同比例的马钱子总生物碱,且研究表明其在抑制滑膜细胞增殖方面具有更加优异的效果。因此,在保障安全的前提下,本发明制得的马钱子总生物碱在治疗风湿性关节炎方面可以表现出更好的疗效。
本发明具有如下优点:本发明提供了一种马钱子总生物碱的制备方法,具备规模工业化生产的应用前景;通过醇酸溶液提取、混酸溶液纯化的方式,大大增加了提取效率,提高了产物得率,且纯化后的马钱子总生物碱经测定,纯度在90~95%;利用本发明方法制得的马钱子总生物碱纯化品,能快速增加主药成分的透皮速率,提高生物利用度,且毒性降低,细胞增殖的抑制作用增强,治疗风湿痹症的效果显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进行详细说明,但本发明的保护范围不囿于如下实施例公开的范围。
实施例1:马钱子总生物碱的制备方法,其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.1:
(1)称取马钱子,粉碎,过筛(10目),制得粗粉,称取150g粗粉,粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2;
(2)用pH为3.0的浓度40%的乙醇加热回流提取,时间3h,共2次,每次均加液1500mL,离心,除去沉淀,合并2次滤液,减压回收乙醇,得到浓缩液1000mL;
(3)加入氢氧化钠,调节pH至14.0,用4000mL二氯甲烷分7次萃取,减压回收溶剂,真空干燥,精密称重,得到马钱子总生物碱粉末,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2;
(4)用由0.05mol/L硫酸和1.0mol/L盐酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末,调pH至2.0,离心,取上清;
(5)加入氢氧化钠,调节pH至10.0,将该溶液用二氯甲烷萃取,减压回收溶剂,减压干燥(65℃),得到纯化马钱子总生物碱,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.1;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为90%。
实施例2:马钱子总生物碱的制备,其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.4:
(1)称取马钱子,粉碎,过筛(20目),制得粗粉,称取150g粗粉,粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2.1;
(2)用pH为6.0的浓度为50%的乙醇加热回流提取,时间1h,共3次,每次均加液2000mL,离心,除去沉淀,合并3次滤液,减压回收乙醇,得到浓缩液1000mL;
(3)加入氢氧化钠,调节pH至12.0,用4000mL二氯甲烷分6次萃取,减压回收溶剂,真空干燥,精密称重,得到马钱子总生物碱粉末,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2.1;
(4)用由0.1mol/L磷酸和0.5mol/L盐酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末,调pH至2.0,离心,取上清;
(5)加入氢氧化钠,调节pH至13.0,将该溶液用二氯甲烷萃取,减压回收溶剂,减压干燥(65℃),得到纯化马钱子总生物碱,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:0.4;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为93%。
实施例3:马钱子总生物碱的制备,其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:1.0:
(1)称取马钱子,粉碎,过筛(40目),制得粗粉,称取100g粗粉,粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2.2;
(2)用pH为5.0的浓度为30%的乙醇加热回流提取,时间1h,共3次,每次均加液1200mL,离心,除去沉淀,合并3次滤液,减压回收乙醇,得到浓缩液1000mL;
(3)加入氢氧化钠,调节pH至12.0,用4000mL二氯甲烷分5次萃取,减压回收溶剂,真空干燥,精密称重,得到马钱子总生物碱粉末,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2.2;
(4)用由0.25mol/L硫酸和0.5mol/L磷酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末,调pH至2.0,离心,取上清;
(5)加入氢氧化钠,调节pH至12.0,将该溶液用乙酸乙酯萃取,减压回收溶剂,减压干燥(65℃),得到纯化马钱子总生物碱,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:1.0;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为95%。
实施例4:马钱子总生物碱的制备,其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:1.5:
(1)称取马钱子,粉碎,过筛(10目),制得粗粉,称取100g粗粉,粗粉中马钱子碱和士的宁的质量比为1:2.5;
(2)用pH为4.0的浓度为90%的乙醇加热回流提取,时间2h,共4次,每次均加液1200mL,离心,除去沉淀,合并4次滤液,减压回收乙醇,得到浓缩液1000mL;
(3)加入碳酸氢钠,调节pH至9.0,用4000mL苯分5次萃取,减压回收溶剂,真空干燥,精密称重,得到马钱子总生物碱粉末,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:2.5;
(4)用由0.3mol/L硝酸和0.2mol/L盐酸组成的混合酸溶液溶解马钱子总生物碱粉末,调pH至2.0,离心,取上清;
(5)加入氢氧化钠,调节pH至12.0,将该溶液用乙酸乙酯萃取,减压回收溶剂,减压干燥(65℃),得到纯化马钱子总生物碱,用HPLC法测定其中马钱子碱与士的宁的质量比为1:1.5;用酸性染料比色法测定纯化马钱子总生物碱的纯度为90%。
实施例5:马钱子碱的透皮性能研究——透皮渗透实验
以大鼠皮肤为试验研究对象,对马钱子碱与士的宁不同质量比时对马钱子碱的经皮渗透进行评价:
1.实验材料
1.1样品:称取用实施例1、2、3、4制得的马钱子总生物碱、马钱子碱对照品适量,用含20%乙醇的PBS(pH=7.5)溶解,得到经皮给药用试药,如表1。
表1含不同马钱子碱与士的宁质量比的经皮给药试液
组别 |
马钱子碱:士的宁 |
马钱子碱对照品 |
1:0 |
实施例1 |
1:0.1 |
实施例2 |
1:0.4 |
实施例3 |
1:1.0 |
实施例4 |
1:1.5 |
1.2试剂:乙醇,马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110706-200505,纯度95.9%);
1.3仪器:RYJ-12B药物透皮扩散试验仪,上海黄海药检仪器有限公司
1.4动物:SD大鼠,体重180~220g,♂,由浙江省实验动物中心提供(动物质量合格证号:SCXK(浙)2008-0033)。
2.方法与结果
皮肤处理:大鼠脱颈处死,机械除毛,剪取背部皮肤。去除结缔组织、脂肪组织,生理盐水漂洗2遍,浸于生理盐水中,待用。
皮肤按扩散池大小剪取适当面积。RYJ-12B药物透皮扩散试验仪加入适量的自来水,使底部布满水,设置温度为37℃,转速为600rpm。接收池内加入适量的20%PBS液,将皮肤固定在的扩散池上,其外表层面向供药室,使皮肤里层与接受液刚好接触;供给室分别加入经皮渗透用试药1、2、3、4、5各0.5mL。接受液为含20%乙醇的PBS液。分别于给药后0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、12、24h定时取样5mL,补加5mL37℃保温的20%乙醇的PBS液。HPLC测定马钱子碱的透过量。平行试验6份。结果见表2。
表2不同马钱子碱与士的宁质量比的药物对马钱子碱的透皮速率和累计透过百分率
组别 |
Q-t方程 |
R2 |
J/mg·cm-2·h-1 |
Q%(10h) |
马钱子碱对照品 |
Q=0.0052x-0.0047 |
0.9928 |
0.0052±0.0013 |
47.13±2.11 |
实施例1 |
Q=0.0069x-0.0056 |
0.9834 |
0.0069±0.0018 |
70.38±3.25 |
实施例2 |
Q=0.0091x-0.0080 |
0.9945 |
0.0091±0.0021* |
79.87±4.22* |
实施例3 |
Q=0.0071x-0.0054 |
0.9952 |
0.0071±0.0022 |
72.30±1.58 |
实施例4 |
Q=0.0063x-0.0046 |
0.9927 |
0.0063±0.0011 |
65.29±3.46 |
注:J为马钱子碱的透皮速率;Q%为马钱子碱的累计透过百分率。与组1比较*P<0.05
上述实验结果显示:马钱子碱与士的宁在质量比为1:0.4~1:1.0时,对马钱子碱的透皮促渗作用较好;尤其是在马钱子碱与士的宁在质量比为1:0.4时,药物透皮速率最高,透过量最大。此外,从表2中也可明显看出,当马钱子碱与士的宁在一定质量比的范围内混合时,其主药的透皮渗透效果,要显著优于去除士的宁仅含单一马钱子碱的(即传统医学理论观点支持下的马钱子总生物碱)。
实施例6:马钱子生物碱的对关节炎滑膜细胞的增殖抑制作用
择选实施例3,以人类风湿关节炎成纤维样细胞(HFLS-RA)为试验研究对象,对所得的纯化马钱子总生物碱进行药效评价:
1.实验材料
1.1样品:称取马钱子总生物碱1、马钱子总生物碱2(按专利ZL201010107295.4制得)、纯士的宁、纯马钱子碱适量,用细胞培养液溶解,得到含药培养液如表3。
表3各组别的含药培养液
注:马钱子总生物碱1为本发明实施例3制得;马钱子总生物碱2为按专利ZL201010107295.4制得。
1.2试剂:胎牛血清(Gibco公司,批号:623311);Brdu ELISA试剂盒(Roche公司,批号:13719900),DMEM低糖培养液(吉诺生物医药技术有限公司,批号:12102204)。
1.3仪器:倒置相差显微镜(Leica DMIL),细胞培养箱(Thermo Forma3111),全波长酶标仪(M4型,MD公司)。
1.4细胞:原代HFLS-RA细胞,购于Cell Applications公司,有本实验室传代培养。
2.方法与结果
取第5代HFLS-RA细胞,向96孔细胞培养板每孔中加入100μl细胞悬液,细胞数为1×104/孔。培养24h使细胞贴壁后,分别加入200μl A、B、C、D四组浓度的马钱子总生物碱、纯士的宁、纯马钱子碱(见表3),其中马钱子总生物碱中含有同组别等量的纯士的宁和纯马钱子碱。每个浓度设3复孔。以含细胞不加药物的DMEM培养液作为标准对照,以不含细胞的DMEM培养液作为空白对照。给药培养24h后,每孔加入Brdu标记工作液100μl;培养12h后,除去标记的培养液,再每孔加FixDenat200μl,室温孵育45min;除去FixDenat液体,每孔加100μl抗体-Brdu-过氧化物酶工作液,室温下孵育约90min;除去抗体-Brdu-过氧化物酶工作液,洗涤3次;每孔加100μl底物显色剂,室温、避光孵育25min,在波长370nm下用酶标仪测定吸光度值。
计算细胞抑制率,抑制率计算公式如下:抑制率%=[1-(样品孔吸光度/标准对照孔吸光度)]×100%,其计算结果如表4。
表4马钱子生物碱不同组分对HFLS-RA细胞增殖的抑制
组别 |
马钱子总生物碱1 |
马钱子总生物碱2 |
纯士的宁 |
纯马钱子碱 |
A组 |
87.58±1.49△△ |
80.58±1.49*△△ |
93.01±0.45△ |
70.16±0.61* |
B组 |
77.28±3.51△△ |
63.20±2.51**△ |
48.33±6.27** |
56.37±5.17 |
C组 |
67.20±12.71△△ |
55.34±10.57** |
21.04±6.87**△△ |
54.94±4.19** |
D组 |
41.34±10.57 |
40.08±6.31 |
14.45±2.53**△ |
35.08±6.31* |
注:
同浓度水平组下,与马钱子总生物碱1组比较,*P<0.05,**P<0.01;与纯马钱子碱组比较,△P<0.05,△△P<0.01。
上述实验结果显示:纯士的宁组对关节炎滑膜细胞具有增殖抑制效果,并且在高浓度时相比于纯马钱子碱组,其抑制效果具有显著性差异,说明也具有潜在的治疗作用;在含有相同量的马钱子碱时,马钱子总生物碱1组与马钱子总生物碱2组比较,其抑制效果都具有显著性差异。从表4中也可证明,采用本发明中提取纯化方法所得的产品(即“马钱子总生物碱”组),治疗风湿痹症的效果,优于纯马钱子,也明显优于采用专利号为ZL201010107295.4的发明专利中提取纯化方法所得的产品。
实施例7:马钱子生物碱的对RAW264.7细胞的增殖抑制作用
择选实施例3,以炎症模型细胞-小鼠单核/巨噬细胞(RAW264.7)为试验研究对象,对所得的纯化马钱子总生物碱进行抗炎作用评价:
1.实验材料
1.1样品:称取马钱子总生物碱、纯士的宁、纯马钱子碱和马钱子碱士的宁混合物适量,用细胞培养液溶解,得到含药培养液如表5。
表5各组别的含药培养液
1.2试剂:胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,批号:121112);MTT(sigama分装,批号:M2128),DMEM高糖培养液(吉诺生物医药技术有限公司,批号:13040204)。
1.3仪器:倒置相差显微镜(Leica DMIL),细胞培养箱(Thermo Forma3111),全波长酶标仪(M4型,MD公司)。
1.4细胞:RAW264.7细胞,购于中科院上海细胞库,有本实验室传代培养。
2.方法与结果
取RAW264.7细胞,向96孔细胞培养板每孔中加入100μl细胞悬液,细胞数为1×104/孔。培养24h使细胞贴壁后,分别加入200μl A、B、C、D、E五组浓度的马钱子总生物碱、马钱子碱士的宁混合物、纯士的宁、纯马钱子碱(见表4),其中马钱子总生物碱和马钱子碱士的宁混合物中含有同组别等量的纯士的宁和纯马钱子碱。每个浓度设3复孔。以含细胞不加药物的DMEM培养液作为标准对照,以不含细胞的DMEM培养液作为空白对照。给药培养24h后,每孔加入MTT工作液200μl;培养4h后,除去MTT工作液,再每孔加200μl DMSO,摇床180rpm,避光,室温孵育10min;在波长570nm下用酶标仪测定吸光度值。
计算细胞抑制率,抑制率计算公式如下:抑制率%=[1-(样品孔吸光度/标准对照孔吸光度)]×100%,其计算结果如表6。
表6马钱子生物碱不同组分对RAW264.7细胞增殖的抑制
注:
同浓度水平组下,与纯士的宁组比较,*P<0.05,**P<0.01;与纯马钱子碱+士的宁组比较,△P<0.05,△△P<0.01。
上述实验结果显示:在高浓度时,士的宁对RAW264.7细胞具有增殖抑制效果强于马钱子碱,但是在低浓度组时马钱子碱相比于纯士的宁,其抑制效果强具有显著性差异;马钱子总生物碱中含有非马非士的其他组分,相比于纯士的宁或纯马钱子碱和马钱子碱士的宁混合物,其抑制效果都具有显著性差异。由表6可知,马钱子总生物碱的抗炎作用明显优于纯士的宁或纯马钱子碱和马钱子碱士的宁简单混合物,且相较纯的马钱子碱士的宁易于制得。
实施例8:不同配比的马钱子碱与士的宁对HaCaT细胞的增殖抑制作用
选择实施例1、2、3、4,以人永生化表皮细胞(HaCaT)为试验对象,研究马钱子碱与士的宁在不同配比下对HaCaT细胞的毒性:
1.实验材料
1.1样品:称取称取用实施例1、2、3、4制得的马钱子总生物碱适量和纯马钱子碱,用细胞培养液溶解,得到不同配比的含药培养液如表7。
表7各组别的含药培养液(mg/mL)
1.2试剂:胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,批号:121112);MTT(sigama分装,批号:M2128),DMEM高糖培养液(吉诺生物医药技术有限公司,批号:13040204)。
1.3仪器:倒置相差显微镜(Leica DMIL),细胞培养箱(Thermo Forma3111),全波长酶标仪(M4型,MD公司)。
1.4细胞:HaCaT细胞,购于武汉细胞库公司,有本实验室传代培养。
2.方法与结果
取HaCaT细胞,向96孔细胞培养板每孔中加入100μl细胞悬液,细胞数为1×104/孔。培养24h使细胞贴壁后,分别加入200μl含马钱子碱士的宁不同配比的含药培养液(见表10)。每个浓度设3复孔。以含细胞不加药物的DMEM培养液作为标准对照,以不含细胞的DMEM培养液作为空白对照。给药培养24h后,每孔加入MTT工作液200μl;培养4h后,除去MTT工作液,再每孔加200μl DMSO,摇床180rpm,避光,室温孵育10min;在波长570nm下用酶标仪测定吸光度值。
计算细胞抑制率,抑制率计算公式如下:抑制率%=[1-(样品孔吸光度/标准对照孔吸光度)]×100%,其计算结果如表8。
表8不同配比的马钱子碱士的宁对HaCaT细胞增殖的抑制
注:
1.与A1比较,*P<0.05,**P<0.01;与A5比较,△P<0.05,△△P<0.01。
上述实验结果显示:在马钱子碱士的宁比例为1:1.5和1:1.0时,对HaCaT细胞具有增殖抑制效果强,且没有显著性差异;在马钱子碱士的宁比例为1:0.1和1:0时对HaCaT细胞具有增殖抑制效果较弱,且没有显著性差异。从表8中也可证明,在一定的马钱子碱与士的宁的配比下,随马钱子碱与士的宁的比例逐渐增大,马钱子总生物碱对HaCaT细胞的毒性逐渐减小。本发明中提取纯化方法所得的产品,治疗风湿痹症的效果方面可以达到低毒的作用,有利于长期给药治疗类风湿性风湿关节炎。
实施例9:马钱子总生物碱对HaCaT细胞的凋亡作用
选择实施例3,以人永生化表皮细胞(HaCaT)为试验对象,对所得的纯化马钱子总生物碱进行毒性评价:
1.实验材料
1.1样品:称取称取用实施例3制得的马钱子总生物碱、纯马钱子碱、纯士的宁和马钱子碱士的宁混合物适量,用细胞培养液溶解,得到不同配比的含药培养液如表9。
表9各组别的含药培养液(mg/mL)
1.2试剂:胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,批号:121112);BU-ANNEXIN V-FITC凋亡试剂盒(Biouniquer Technology CO,LTD.批号:BU-AP0102),DMEM高糖培养液(吉诺生物医药技术有限公司,批号:13040204)。
1.3仪器:倒置相差显微镜(Leica DMIL),细胞培养箱(Thermo Forma3111),流式细胞仪(Epics Altra)。
1.4细胞:HaCaT细胞,购于武汉细胞库公司,有本实验室传代培养。
2.方法与结果
取对数期细胞接种至培养瓶中,培养24h后,分别加上述含药培养液如表9所示。培养24h,设对照组(只加细胞不加药物),收集细胞,调整浓度为5×105/mL,取0.5mL结合缓冲液(binding buffer)悬浮细胞,加入5μL Annexin V-FITC,5μL碘Propidium Iodide,混匀,室温避光孵育10min,用流式细胞仪进行检测。马钱子生物碱对细胞的凋亡结果如表10。
表10马钱子生物碱影响HaCaT细胞的凋亡结果
组别 |
早期凋亡率/% |
晚期凋亡率/% |
马钱子总生物碱组 |
2.9±3.1 |
20.8±4.4 |
马钱子碱士的宁混合物组 |
19.4±3.9 |
22.5±5.2 |
马钱子碱组 |
8.2±3.6 |
30.9±5.3 |
士的宁组 |
21.9±4.2 |
36.3±8.5 |
上述实验结果显示:与士的宁比较,马钱子碱对HaCaT细胞的凋亡作用明显弱很多;马钱子总生物碱比马钱子碱士的宁混合物的凋亡作用弱。由此可以推断,本发明制得的马钱子总生物碱不仅具有明显的抗类风湿性关节炎作用,而且其毒性较马钱子碱士的宁混合物的毒性低,有利于用于临床治疗,实现对毒性中药材的增效减毒。
以上对本发明的优选实施例进行了详细说明,对本领域的普通技术人员而言,依据本发明提供的思想,在具体实施方式上会有改变之处,而这些改变也应视为本发明的保护范围。