CN101014560A

CN101014560A - 了哥王提取物、其制备方法及其在制备抗炎药物中的应用

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Publication number: CN101014560A
Application number: CNA2004800437624A
Authority: CN
Inventors: 王立岩; 北中进
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2024-08-06
Also published as: WO2006012779A1; WO2006012779A8; CN101014560B

Abstract

本发明涉及一种了哥王提取物、其制备方法及其在制备药物中的应用，提取的化合物的结构式如图。

Description

了哥王提取物、其制备方法及其在制备抗炎药物中的应用技术领域

本发明涉及一种了哥王提取物、其制备方法及其在制备药物中的应用，特别是涉及从植物了哥王中提取一种具有抗炎效果的化合物。背景技术

困扰人们的日常炎性疾病包括，关节炎症例如骨关节炎、类风湿性关节炎、类风湿性脊推炎、痛风关节炎等；炎性皮肤病例如湿疹、牛皮癣、皮炎等；炎性眼疾例如眼色素层炎、结膜炎等；肺部疾病例如哮喘、支气管炎、急性呼吸窘迫综合症等；菌血症、那毒素血症、口疮溃疡、龈炎、胰腺炎等；胃肠道疾病例如节段性回肠炎、萎缩性胃炎、溃疡性结肠炎、腹腔炎、消化性溃疡、应激性肠道综合症例如由幽门螺旋杆菌感染而引起的粘膜炎症或者由非甾体类抗炎药引起的肠胃病等等。

有关各种炎症致病作用的机理是: 已知体内一氧化氮（N O )是介导细胞免疫和炎症的毒性物质。其前体是左旋精氨酸 (L-arg) , L-arg在 NO 合成酶（N O S )的作用下生成 N O。目前已经分离出三种不同类型的 N0S_: 包括内皮 NO合成酶 (eNOS) ,神经元 NO合成酶 (nNOS)及诱导型 NO合成酶 (iN0S)。目前巳知，巨噬细胞、肝细胞、平滑肌细胞、腺癌细胞以及上皮细胞均能表达 iN0S。某些炎性细胞因子和微生物产物如脂多糖（LPS )则可诱导 iNOS表达。 iNOS—旦被诱导即可表达出高度活性，产生大量 NO, 进而导致细胞损伤，造成炎症恶化，甚至导致癌症。

因此，长时间以来，人们致力于寻找 NO合成酶的抑制剂来治疗与之相关的炎性疾病。但这些抑制剂大多局限于化学合成的物质 , 副作用较大。

由于各种炎症长期困扰人类的健康生活，有关的科学工作者始终不遗余力的试图开发新型的疗效确切、副作用少、研制成本低的抗炎活性化合物。加深对中草药的研究可能是实现这个愿望的良好载体。

了哥王（ Wiks troemia indica C. A. Mey )是分布在中国广东、广西、台湾等地的瑞香科植物。很早就开始用于消肿、止痛、风湿、肿瘤等。此植物治疗慢性支气管炎和癌的临床效果已得到肯定。在《中药大辞典》

(上海人民出版社， 1977年出版， 5卜 53 页）记载：了哥王生于山脚及山坡潮湿的灌丛中，该植物的。茎、叶、根、果实均可入药，具有清热解毒、消肿散结、止痛功效，治痈肿、风湿痛、跌打损伤。

在中国专利申请号为 9811403. 9 的 "抗艾滋病新药了哥王提取物的制备方法" 专利中描述了提取了哥王中活性物质的方法，但并没有确认该活性物质群的化学结构和理化参数，从而不能清楚地了解到起作用的物质性能，也就不能进一步的深入研究等。发明内容

本发明的目的一是是通过分析提取了哥王中的活性成分，来寻找种可用于制备抗炎药物的有效活性化合物。

本发明的另一个目的是提供一种从了哥王植物中提取活性成分的方法。

本发明还提供了从了哥王中提取的化合物用于制备:^

病的药物用途。

在本发明中提供了从了哥王中提取的式（ 1 )化合物 ( 1 ), 本发明从了哥王中提取活性式（1 )化合物的方法包括如下步骤：

1 ) 了哥王经曱醇提取后的提取液减压浓缩、干燥得到萃取物；

2 ) 将萃取物用正乙烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；

3 ) 将乙酸乙酯的萃取物经层析柱用甲醇洗脱；

4 ) 对步骤 3 ) 收集到的洗脱液经高压液相色谱进一步分离精制，得到活性式（1 )化合物。

在上述提取方法中，减压浓缩优选在 40摄氏度进行。

在上述提取方法中，高压液相色谱的流动相为甲醇：水 =30: 70。

本发明的另一个方面是提供式（1 )化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体在用于治疗或预防抑制 NO生成活性是有益的疾病的药物制备中的用途。

本发明的另一个方面是提供式（1 )化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物在用于治疗或预防炎性疾病的药物制备中的用途。

适宜的盐包括与有机和无机酸或碱形成的盐；药学上可接受的盐包括与下列酸形成：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、丁酮二酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸；药学上可接受的碱式盐包括铵盐、碱金属盐、如钠盐和钾盐、碱土金属盐如钙盐和镁盐以及与有机碱如二环己基胺和 N -曱基 - D -葡糖胺形成的盐。

生理官能衍生物的实例包括酯、酰胺、氨基甲酸酯，优选酯和酰胺。本发明的化合物还可有利地与第二种药学活性物质 , 尤其是可诱导的环氧酶（ C0X - 2 ) 同工酶的选择性抑制剂联合用药 , 具体的本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体或互变异构体与 C0X - 2抑制剂联合用药以治疗炎症、炎性疾病以及与炎症相关的疾病的用途。

炎性疾病及临床病症包括关节疾病, 特别是关节炎（例如类风湿性关节炎、骨关节炎）、或胃肠道疾病（如溃疡性结肠炎、胃炎、以及其它感染引起的粘膜炎症、由非甾体抗炎药引起的肠病）、肺部疾病（如成人呼吸道窘迫症、哮喘、嚢纤维化、慢性阻塞性肺部疾病）、心脏病（如心肌炎）、神经组织疾病（如多发性硬化病）、胰腺疾病（如糖尿病及并发症）、肾疾病（如腎小球性肾炎）、皮肤病（如皮炎、牛皮癣、湿疹、荨麻疹）、眼部疾病（如青光眼）、移植器官疾病（如排斥反应）、多器官疾病（如系统性红斑狼疮）及病毒和细菌感染后的炎性后遗症。

此外，本发明提供的化合物可以有助于预防或治疗与 HIV感染有关的淋巴细胞的丢失、增加放射治疗期间肿瘤细胞的放射性敏感性、 P争低肿瘤的生长、肿瘤发展、血管生成和肿瘤转移。

本发明提供的化合物还可以用于制备保健食品、饮料、或饲料等。在本发明中提供的提取了哥王中活性化合物的方法简单实用，所提取的活性化合物结构明确，并具有确切的 NO抑制生成活性，达到抗炎的作用，没有细胞毒性。具体实施方式

实施例 1: 提取物的制备与化合物结构的确定

将 2.3 kg的了哥王的径或全草粉碎，加入 80%甲醇 (曱醇：水 = 8: 2 ) 10升，提取三次，在 40°C減压浓缩干燥，得到 286g萃取物。把全部的萃取物溶解于 2升水中，依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇各 1升分 3 次萃取，这些萃取液在 40°C下减压浓缩干燥，得到正乙烷萃取物 ⁶.⁵g、乙酸乙酯萃取物 62.0g、正丁醇萃取物 25.0g。对各种萃取物进行 NO生成抑制活性实验（参照实施例 2)，在供试品浓度为 lOO g/ml的条件下，正乙烷萃取物（76, 1%)、乙酸乙酯萃取物（86.9%)、丁醇萃取物（⁶.⁴⁵%), N0生成抑制率得到肯定；全部萃取物在 MTT细胞毒性实验中都被认定没有细包毒' 1"生。取活性最强的乙酸乙酯萃取物 62g, 用 SephadexLH- 20 层析柱（ 6.5 X 35cm)进行分离，依次用 30%甲醇、 70%的曱醇、曱醇洗脱， 40°C下减压浓缩干燥，得出四个洗脱馏分： fr.1 ( 6.9g) fr.2 ( 14.7g )、 fr.3 (12. lg)、 fr.4 (2.7g)。对这些萃取物再次进行 NO生成抑制实验， N0 生成抑制率为 fr.1(22.6%)、 fr.2(89.7%)、 fr.3(58.6% ) fr.4(89· 7%)。取萃取物 fr.2, 用 silica层析柱 (wako gel C-300, 2.2 χ 22cm) 进行分离，用氯仿：甲醇（ 100: 0-0: 100 ) 洗脱， 40°C下减压浓缩干燥，得 11个（ fr.2-1至 fr.2-11 )洗脱馏分。取 fr.2 - 3 (1. lg), 用 CHP-20层析柱（4x 48cra)进行分离，依次用 30%甲醇、 50%甲醇、 70%的甲醇、甲醇洗脱，得四个馏分： fr. 2-3- A ( 0. 12 g )、 fr. 2-3-B ( 0. 65 g )、 fr. 2-3-C ( 0. 03 g )、 fr. 2 - 3-D ( 0. 07 g )。用反相的 HPLC对 fr. 2- 3- C进行精制，层析柱 YMC Guard park ODS- AL、流动相 H₂0 -甲醇 ( 30: 70 )、流速 4ml/min、测定波长 254nm, 收集保留时间为 6. 4分钟的峰， 40°C下减压浓缩干燥，得化合物（ 1 )〔 3. 5mg〕。经确定结构时后发现未见文献记载。实施例 2: 确定理化参数及化合物的结构

式（ 1 )化合物的性状见表 1 , 和 ¹³C-NMR的数据见表 2。并由以上数据最终确定了化合物的结构式。

表 1 :

化合物（ 1 )的¹ H 和 ¹³C -醒 R光谱数据 (500 MHz, CDC1₃)

s:—重线、 d: 二重线、 t ：三重线、 m: 多重线 ( 1 )化合物的结构式确定如下:

(1)

实施例 3: 抑制 NO生成的活性试验

由于干 4尤素 r以及脂多糖刺激而产生的巨噬细胞对 NO生成的阻碍效果（抑制 NO生成的效果）通过下面的实臉方法求得。并且据阻碍效果的 IC50 (urn)来评价 NO生成的抑制效果。

所用材料：

RAW 264.7细胞（大日本制药）

盐酸萘乙二胺（lg 和光纯药）

磺胺（ 500g 和光纯药）

Ham' s F12 培养基 ( SIGMA N488 500mL)

IFN- γ ( Geneyme/Techne lOO g)

脂多糖（LPS, 055: B5 lOmg, Sigma)

磷酸（ ⁵00ml 和光纯药）

DMS0 ( 500ml 和光纯药）

96孔^:滴定板（50/盒住友电木，商品名〔8096R〕）

NO生成抑制活性的试验方法：

将 RAW264.7细胞（ 2盘）放入 50mlFalcon软管中。用离心机（ lOOOrpm, 3min, 4°C )使细胞沉淀，用移液器将上清除去。加入新鲜培养基 10ml, 使之悬浊。浓度调整为 1, 5 X 10⁵个 / ml, 以每孔 20(^L的标准分别注入到 96孔板（住友电工 8096R), 将细胞在 C0₂恒温箱中培养 1-2小时后。加入 LPS( lO g/Ml, Sigma, 055: B5)2 L, 鼠 INF— γ ( 33ng/raL, Genzyme ) 2μΙ, 样品 0.4 L。在 C0₂恒温箱中培养 16 小时。最终浓度为 INF- γ 0.33ng/mK LPS100ng/ml。样品溶解于 DMS0, DMS0相对培养基的含量调整为 0, 2%。取培养上清 100 ，加入 0.1%萘二胺溶液 50 L、对氨基苯磺酰胺溶液 5(^L，室温中避光放置 10分钟。用分光光度计测定 57 Onm (对照 655mn )的吸光度 O. D. 。 STD使用亚硝酸钠溶液（ 100, 50, 20, 10, 5， 2 , 1， 0 um )。对细胞成活率，进行镜检观察和 MTT实验。

细胞毒性通过 MTT法、由镜检确定。 MTT法是已知的常规方法。即，于 96孔^:滴定板，每孔 200 μ 1细胞浓度为 1. 0 χ 10⁵细胞 /ml , 添加不同浓度的提取物或单体组分，将细胞培养 16小时，加入 MTT试剂，再培养 4小时。弃上清，添加 150 LDMSO, 将生成的甲臜（ f ormazane )完全溶解，测定 570nm下的吸光度。

活性评价

计算出 N0₂—的量，代入下面的公式求出抑制效果

抑制效果 ( % ) = {1- ( X-Y ) / ( Z-Y ) } X 100

X：在实验化合物存在下, 由 IFN- γ和 LPS诱导产生的 N0₂-的量, Y; 在实—臉化合物、 IFN- γ和 LPS均不存在的情况下，诱导产生的 N0₂ —的量，

Z: IFN- γ和 LPS诱导产生的 N0₂—的量。

化合物（ 1 ) 的冊生成抑制效果的 IC₅。如下所示：

实施例 4: 制备药物剂型

当化合物（1 )或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物单独给药时，优选以药用制剂提供，该制剂包括当化合物（1 )或其药学上可接受的盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物其药学上可接受的载体或赋形剂以及可任选的一种或多种其它的治疗成份。

所述制剂包括口服给药制剂、胃肠外给药制剂（包括皮内注射、肌内注射、静脉注射以及关节腔内注射）、吸入制剂（包括由不同剂量的加压气雾器、喷雾器、吹入器中产生的微粒粉剂或雾剂）、直肠和局部给药制剂（包括皮肤给药、口腔给药、舌下给药、眼内给药）。最适合的给药途径取决于用药患者的状况和疾病。制剂通常以单位剂型提供，并且可以通过药学领域中已知的任何方法进行制备。所有的方法都包括将活性成份与载体混合的步骤，载体由一个或多个辅助成分构成。通常情况下通过使活性成分与液体或精细固体载体或两者均匀紧密结合，随后根据需要将所述产物制成制剂；适宜口服给药的本发明制剂可以以独立的单位如胶嚢剂、扁嚢剂或片剂提供，而每单位含有预定量的活性成分；散剂或颗粒剂；水溶性液体或悬浮液；或水包油型乳剂或油包水型乳剂；也可以是大丸剂、药糖剂或糊剂。

通过任选与一种或多种辅助成分一起压片或塑型可以制备片剂；通过在适当的机器上压制自由流动形式如粉末或颗粒（任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合）中的活性组分可以制备压制片剂；所述片剂可任选为包衣或压痕的，并且配成制剂以提供活性成分的緩释或控释。

胃肠外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射液，该注射液可以含有抗氧化剂、緩冲剂、抗菌剂及使制剂与患者血液等张的溶质，水性和非水性的无菌悬浮液，该悬浮液可以含有悬浮剂和增稠剂；所述制剂可以以单位剂量或多剂量包装，例如用密封的安剖管和管制瓶提供；并且可以在冷冻干燥的条件下储存，自使用前仅需提供无菌的液体载体如盐水或注射用水；可以用散剂、颗粒剂及前面描述的各种片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

直肠给药的制剂可用常见的载体（如可可脂或聚乙二醇）的栓剂形式提供。

用于口腔的局部给药的制剂（如口腔含化剂或舌下给药剂），包括在调味基质（如蔗糖、阿拉伯糖）中的活性成份的锭剂。

可以理解，除上面特别提到的成分外，本发明的制剂还包括本领域相关制剂类型的其它常规成分，例如适于口服给药的调味剂等。

①将从了哥王提取的化合物（ 1 ) 10g与玉米淀粉 40g混合，加水制成软材，过 12目筛造粒、干燥，得到颗粒剂，在本颗粒剂中每 500mg中含化合物（1 ) 100mg。 ②将从了哥王提取的化合物（ 1 ) 40g与乳糖 100g、硬脂酸镁 10g混合，以每 600mg填充肠溶胶嚢，本肠溶胶嚢剂中，每个胶嚢含化合物（ 1 ) 160mg。

③将从了哥王提取的化合物（1 ) 25g以普通的注射剂制造法，用加热至 60摄氏度的注射用蒸榴水 1000ml溶解，用 NaCL调解等张，封入安剖瓶。本注射液 10ml中含有化合物 ( 1 ) 250mg。

实施例 5、制备食品

本发明提供的化合物（1 )也可以以食品的形式提供，优选的食品形式包括粉末、颗粒、糊剂、胶状物等，颗粒形式可以添加糖（如乳糖）来增加甜味；也可以制备成饮料的形式；这些食物或饮料除石仙桃提取物外，还可以加入维生素、无机元素，如钙、醇类、去味剂，如多酚。这些食物包括特殊的健康食品、医用食品等种类。

Claims

权利要求

1、一种从了哥王中提取的式（1 )化合物或其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物

( 1 )。

2、根据权利要求 1所述的化合物或其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物在制备治疗或预防炎性疾病药物中的用途。

3、根据权利要求 2所述的用途，其特征在于所述化合物或其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物可与第二种药学活性物质联合用于制备治疗或预防炎性疾病药物的用途。

4、根据权利要求 2或 3所述的用途，其特征在于炎性疾病及临床病症包括关节疾病，特别是关节炎（例如类风湿性关节炎、骨关节炎）、或胃肠道疾病（如溃疡性结肠炎、胃炎、以及其它感染引起的粘膜炎症、由非体抗炎药引起的肠病）、肺部疾病（如成人呼吸道窘迫症、哮喘、嚢纤维化、慢性阻塞性肺部疾病）、心脏病（如心肌炎）、神经组织疾病 (如多发性硬化病）、胰腺疾病（如糖尿病及并发症）、腎疾病（如腎小球性肾炎）、皮肤病（如皮炎、牛皮癣、湿疹、荨麻疹）、眼部疾病（如青光眼）、移植器官疾病（如排斥反应）、多器官疾病（如系统性红斑狼疮）及病毒和细菌感染后的炎性后遗症。

5、根据权利要求 1所述的化合物或其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物，其特征在于适宜的盐包括与有机和无机酸或碱形成的盐；药学上可接受的盐包括与下列酸形成：盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、丁酮二酸、甲磺酸、乙磺酸、对曱苯磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸；药学上可接受的碱式盐包括铵盐、碱金属盐、如钠盐和钾盐、碱土金属盐如钙盐和镁盐以及与有机碱如二环己基胺和 N -曱基 - D -葡糖胺形成的盐。 6、根据权利要求 1所述的化合物或其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物，其特征在于生理官能^"生物包括酯、酰胺、氨基甲酸酯。

7、根据权利要求 1所述的化合物或其盐、对映体、外消旋体、互变异构体或生理官能衍生物在制备保健食品、饮料、或飼料中的用途。

8、一种从了哥王中提取活性化合物的方法包括如下步骤：

1) 了哥王经甲醇提取后的提取液减压浓缩、干燥得到萃取物；

2 )将萃取物用正乙烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取；

3 )将乙酸乙酯的萃取物经层析柱用甲醇洗脱；

4 )对步驟 3 ) 收集到的洗脱液经高压液相色谱进一步分离精制，得到活性化合物。

9、根据权利要求 8所述的方法，其特征在于得到的活性化合物结构

为：。

10、根据权利要求 8所述的方法，其特征在于減压浓缩在 4G摄氏度进行。

11、根据权利要求 8 所述的方法，其特征在于高压液相色谱的流动相为甲醇：水 =30: 70。