CN108236637A - 一种鱼腥草提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种鱼腥草提取物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

一种鱼腥草提取物及其制备方法和用途，所述提取物中鱼腥草素及其他挥发性成分的含量具有特定的范围，在提高了安全性的同时，显著提高了抗菌、抗病毒活性，增大了药物的治疗窗，而且所述提取物脂溶性好，容易制备成多种药物制剂，扩大了应用范围。此外，所述提取物的制备方法工艺简单，成本较低，适于大工业生产。

Description

一种鱼腥草提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种鱼腥草提取物及其制备方法和用途。
背景技术
鱼腥草(HouttuyniacordataThunb)又名蕺菜，为三白草科(Saururaceae)多年生草本植物，广泛分布于我国南方各省区，是一种重要的药食两用植物。
鱼腥草素(houttnin，癸酰乙醛)是鱼腥草挥发油中的主要活性成分，但其易挥发、易氧化、稳定性差、难以保存等缺点限制了其应用。为改善鱼腥草素的稳定性，已有对其结构进行改造获得的新鱼腥草素钠(Soudium New Houttuyfonate,SNH)，并已被制备成聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)水针剂或输液。然而，新鱼腥草素钠注射液在临床应用中，患者频繁出现呼吸困难、高热、皮疹、过敏性休克、甚至猝死等严重的不良反应。
中药是通过多种有效成分对人体代谢网络进行系统干预而发挥作用的，具有多靶点干预的特点，更重视整体观，与化药相比，中药提取物往往具有增效减毒的优点[张雪等.中药配伍减毒增效的研究概况.中华民族民间医药,2015,24(21),19-20]。
常见的鱼腥草提取方法包括水蒸气蒸馏法和溶剂提取法。临床上已有鱼腥草注射液，系以鱼腥草为原料，通过水蒸气蒸馏法提取的挥发油，以聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)为增溶剂制成的注射液。然而，水蒸气蒸馏法所得提取物中鱼腥草素含量低，提取物治疗效果和安全性差。
薛青松等室温下采用乙酸乙酯浸泡提取鱼腥草456小时，发现挥发油中癸酰乙醛的含量高达40.14％[薛青松,殷华茹.溶剂浸提条件下鱼腥草中癸酰乙醛的高效提取.分析科学学报,2013,(3)29,386-390]。然而，该文献中仅公开了采用GC/MS面积归一化法计算的挥发油中鱼腥草素的含量，没有测定其中未气化的成分，因此，无法定量鱼腥草素在总提取物中的含量。此外，该研究者未对提取物进行任何纯化和精制处理，亦未对提取物的活性和安全性进行评价。本发明人重复该文献的方法制备了鱼腥草提取物，采用2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生化-HPLC法测定鱼腥草素在整个提取物中的含量，结果发现含量较低，仅为5.8％。小鼠急性毒性试验证明其存在严重急性毒性；体外抗菌、抗病毒实验证明其不具有明显的抗菌、抗病毒活性。
由于新鱼腥草素钠注射液以及鱼腥草提取物制剂在临床应用中出现严重的不良反应，2006年国家食品药品监督管理局决定在全国范围内暂停使用含鱼腥草或新鱼腥草素钠的七种注射液。
因此，开发安全、有效的鱼腥草制剂有着重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述问题，本发明提供一种鱼腥草提取物，通过控制所述提取物中鱼腥草素以及挥发油的含量，提高了所述提取物的安全性，同时显著提高了抗菌、抗病毒活性，增大了药物的治疗窗。
本发明一方面提供一种鱼腥草提取物，其特征在于，所述提取物中采用气相(GC)面积归一化法测得的鱼腥草素含量为20％～90％，可选为30％～85％，或可选为40％～80％；采用DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为8％以上，可选为10％以上，或可选为12％以上，或可选为15％以上，或可选为20％以上。
可选地，上述提取物中还含有选自α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、双戊烯、月桂烯、柠檬烯、水芹烯、壬醇、白里香素、癸醛、癸酸、月桂醛、石竹烯、甲基正壬酮、乙酸龙脑酯、氧化石竹烯、十六酸、乙酸香叶酯、月桂酸、棕榈酸、植物醇、榄香烯、十六烷、十六烷酸、十八碳烯酸、软脂酸、亚油酸中的至少一种。
本发明的第二个方面是提供上述鱼腥草提取物的制备方法，所述制备方法包括向鱼腥草中加入有机溶剂进行的提取步骤，以及精制步骤。
可选地，所述精制步骤包括选自沉淀法、溶剂萃取法、吸附法、分馏法中的至少一种。
可选地，上述的制备方法中，所述提取步骤采用的有机溶剂包括选自醇类、醚类、酮类、酯类、烷烃类、卤代烷烃类、芳香烃类、四氢呋喃、二硫化碳中的至少一种；可选为选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙醚、甲基乙基醚、二乙醚、二氧六环、丙酮、丁酮、乙酸乙酯、石油醚、己烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、二硫化碳中的至少一种。
可选地，上述的精制方法中，所述沉淀法采用的醇类选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇中的至少一种。
可选地，上述的精制方法中，所述溶剂萃取法所用的溶剂为选自醇类、醚类、酯类、烷烃类、卤代烷烃类、芳香烃类、中的至少一种；可选为选自正丁醇、异丁醇、乙醚、甲基乙基醚、二乙醚、乙酸乙酯、石油醚、环己烷、正己烷、正庚烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯中的至少一种；或可选为选自乙酸乙酯、正己烷、石油醚、二氯甲烷中的至少一种。
可选地，上述的精制方法中，所述吸附法采用的吸附剂包括大孔吸附树脂、硅胶、氧化铝、活性炭、硅藻土中的至少一种。
可选地，所述吸附法所用的大孔树脂包括苯乙烯型、聚丙烯酸酯型和丙烯酰胺型大孔树脂，可选为苯乙烯型大孔树脂。可选地，所述苯乙烯型大孔树脂为非极性、低极性或中等极性吸附树脂，或可选地，所述苯乙烯型大孔树脂选自DM301、NKA-9、AB-8、D101、DM130、DM-18、D312、HPD100、HPD200、HPD300、HPD400、HPD450、H103、HPD600、HPD750、HPD100A、XAD-1、XAD-2、XAD-3、XAD-4、XAD-5、HP-10、HP-20、HP-30、HP-40、HP-50型大孔树脂。
可选地，大孔树脂吸附法所用的洗脱液为选自乙醇、甲醇、丙酮及其混合物中的至少一种任选地和水组成的混合物。
可选地，所述硅胶吸附法所用的硅胶为50～400目，洗脱方式为常压洗脱、加压洗脱和减压洗脱中的至少一种。
可选地，所述硅胶法采用的洗脱液为石油醚、甲苯、乙醚、正己烷、环己烷、正庚烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、正丁醇、异丙醇、乙酸、丙酮、乙醇、甲醇、水中的至少一种。
可选地，所述分馏法选自减压分馏和分子蒸馏中的至少一种。
可选地，上述的制备方法中，所述提取步骤所用的方法选自索式提取法、溶剂浸渍法、溶剂回流法、微波提取法和超临界CO2萃取法中的至少一种。可选地，溶剂浸渍法任选地利用加热和/或超声辅助提取。
可选地，上述的制备方法包括以下步骤：
(1)提取步骤：以体积/重量(L/kg)计，每次向鱼腥草中加入1～10倍有机溶剂，提取1～3次，浓缩提取液，得粗提物；可选地，每次向鱼腥草中加入1～5倍有机溶剂，所述浓缩为减压浓缩；
(2)精制步骤：进行以下(a)、(b)、(c)、(d)操作中的至少一种：
(a)沉淀：将所得粗提物采用醇类絮凝，除去沉淀，上清液浓缩，得提取物；可选地，以体积/重量(L/kg)计，所述醇类为粗提物的1～5倍量，可选地，所述絮凝的温度为-20～4℃，可选地，絮凝的时间为4h以上；
(b)溶剂萃取：将步骤(1)中所得粗提物或步骤(a)中所得提取物，采用萃取溶剂萃取1～3次，浓缩得提取物；
(c)大孔树脂吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物或者步骤(b)中所得提取物经大孔树脂吸附后，用洗脱液冲洗树脂除杂，再用另一洗脱液解吸附提取物，回收解吸附洗脱液，浓缩得提取物；
可选地，将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物或者步骤(b)中所得提取物经20％～60％醇类分散后经大孔树脂柱吸附1h以上；
可选地，所述冲洗树脂所采用的洗脱液依次为1～10倍柱体积水和1～10倍柱体积的10％～60％的乙醇；
可选地，所述解吸附所用的洗脱液为1～10倍柱体积的60％～100％的乙醇；可选地，所述浓缩为减压浓缩。
(d)硅胶吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物、步骤(b)中所得提取物或者步骤(c)中所得提取物经硅胶吸附后，用洗脱液洗脱硅胶柱，回收洗脱液，浓缩得提取物。
可选地，所述洗脱液为1～30倍柱体积的任意比例的石油醚与乙酸乙酯溶液；
可选地，所述浓缩为减压浓缩。或可选地，上述制备方法包括下述步骤：
(1)提取步骤：以体积/重量(L/kg)计，每次向鱼腥草中加入2～3倍有机溶剂，提取1～2次，减压浓缩提取液，得粗提物；
(2)精制步骤：进行以下(a)、(b)、(c)、(d)操作中的至少一种：
(a)沉淀：将所得粗提物采用1～3倍量的80％～100％的醇类于-20～0℃静置絮凝12h以上，过滤除去沉淀，上清液减压浓缩得提取物；
(b)溶剂萃取：将步骤(1)中所得粗提物或步骤(a)中所得提取物，采用萃取溶剂萃取2～3次，减压浓缩，得提取物；
(c)大孔树脂吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物或者步骤(b)中所得提取物经3～10倍量的30％～50％醇类分散后经大孔树脂柱吸附1～4h，用3～5倍柱体积水和3～5倍柱体积的20％～50％的乙醇冲洗树脂除杂，再用3～7倍柱体积的80％～95％的乙醇洗脱液解吸附提取物，回收解吸附洗脱液，减压浓缩得提取物。
(d)硅胶吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物、步骤(b)中所得提取物或者步骤(c)中所得提取物用1～5倍量硅胶拌样，将拌样后硅胶上样于3～50倍硅胶的硅胶柱顶端，用洗脱液洗脱硅胶柱，回收洗脱液，浓缩得提取物。可选地，所述洗脱液为1～20倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯体积比为50:1～1:20的混合溶液；收集洗脱液，减压浓缩得提取物。
本发明第三个方面提供一种药物组合物，包括上述的鱼腥草提取物以及任选的药学上可接受的辅料。可选地，上述药物组合物的剂型为片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、乳剂(普通乳剂、亚微乳剂、微乳剂)、滴丸剂、栓剂、注射溶液或雾化溶液剂。
可选地，上述药物组合物的剂型为环糊精包合物、油溶液、亚微乳、纳米乳、自微乳、微球、脂质体和固体脂质纳米粒。
上述药物组合物可以单独使用，也可与其它抗菌、抗病毒药物合并使用。
本发明的第四个方面提供上述的鱼腥草提取物在制备抗菌、抗病毒药物中的用途。
根据本发明的具体实施方式，所得鱼腥草提取物的毒性小，抗菌、抗病毒效果好；
根据本发明的具体实施方式，所得提取物脂溶性好，容易制备成多种药物制剂，扩大了应用范围；
根据本发明的具体实施方式，所述提取物的制备方法提取率高、工艺简单，成本较低，所用的有机溶剂可回收重复利用，适于大工业生产，具有巨大的开发价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1：实施例1提取物的GC色谱图(鱼腥草素保留时间为24.73min)。
图2：实施例3提取物的GC色谱图(鱼腥草素保留时间为24.67min)。
图3：实施例5提取物的GC色谱图(鱼腥草素保留时间为24.47min)。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下实施例和对比例制备的鱼腥草提取物的成分进行分析时所采用的GC面积归一化法和DNPH衍生化-HPLC法的测试条件为：
(1)GC面积归一化法
GC色谱条件：DB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.25μm)，程序升温：初温50℃，保持3min，5℃/min升至150℃，保持3min,20℃/min升至250℃，保持5min。进样口温度250℃，检测器温度250℃，分流比10∶1，载气：氮气，流速1mL/min,进样量1μL。
(2)DNPH衍生化-HPLC法
(1)2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生化条件：提取物用乙腈溶解，配成1mg/ml的待测样品溶液，取该样品溶液1mL,加入1.5mg/mL的DNPH溶液1mL，加30μL 2mol/L的盐酸溶液，于45℃条件下衍生化反应15min，然后进行HPLC测定。
(2)HPLC条件：Angilent Eclipse Plus C8色谱柱(5μm,4.6×250mm)；流动相：20％水(A)，80％乙腈(B)；流速0.8mL/min；进样量：5μL；检测波长：225nm。
以下实施例和对比例中所述“倍量”均为体积/重量(L/kg)比，如实施例1中“加3倍量丙酮”是指当鱼腥草重量为1kg时，丙酮的体积为3L。
实施例1
(1)鱼腥草500g，加3倍量丙酮，加热回流提取4h，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗提物；
(2)粗提物分散于3倍量80％乙醇中，-20℃静置过夜，过滤，滤液浓缩至无醇味后，以正己烷-水液液萃取，萃取3次，合并正己烷层，浓缩得提取物。
对所得提取物成分进行分析，GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为28.6％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为15.8％。
实施例2
(1)鱼腥草100g，粉碎，加入索式提取器中，用2倍量石油醚加热回流提取5h，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗提物；
(2)粗提物分散于3倍量甲醇中，-10℃静置过夜，过滤，滤液浓缩除尽甲醇得提取物。
对所得提取物成分进行分析，GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为32.6％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为9.8％。
实施例3
(1)鱼腥草1kg，加5倍量乙醚，密封，静置3天，过滤，滤液减压回收乙醚，得粗提物；
(2)粗提物分散于3倍量乙醇中，-15℃静置过夜，过滤，滤液浓缩至无醇味后，以乙酸乙酯-水进行萃取，萃取1次，合并乙酸乙酯层，浓缩，得提取物。
对所得提取物成分进行分析，GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为62.3％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为25.1％。
实施例4
(1)鱼腥草500g，加3倍量丙酮，加热回流提取5h，过滤，滤液减压回收溶剂，得粗提物；
(2)粗提物分散于3倍量80％乙醇中，-20℃静置过夜，过滤，滤液备用；
(3)将步骤(3)滤液经40％乙醇分散后使其通过D101大孔树脂吸附柱，吸附1小时，依次用2柱体积蒸馏水、4柱体积20％乙醇洗脱去除强极性杂质，再用4柱体积90％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压去除溶剂，即得鱼腥草提取物。
对所得提取物成分进行分析，GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为40.2％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为26.9％。
实施例5
(1)鱼腥草1kg，加入2倍量的乙酸乙酯，密封，静置5天，过滤，滤液减压回收乙酸乙酯，得粗提物；
(2)粗提物分散于2倍量90％乙醇中，-20℃静置过夜，过滤，滤液备用；
(3)将步骤(2)滤液浓缩至无醇味，以二氯甲烷-水液液萃取，萃取2次，合并二氯甲烷层，浓缩得提取物1；
(4)取上述提取物1，经50％乙醇分散后使其通过HPD100大孔树脂吸附柱，吸附2小时，依次用2柱体积蒸馏水、3柱体积30％乙醇洗脱去除强极性杂质，再用6柱体积80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压去除溶剂，即得鱼腥草提取物。
对所得提取物成分进行分析，GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为73.2％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为45.3％。
实施例6
(1)鱼腥草1kg，加入2倍量的乙醚，密封，静置3天，过滤，滤液减压回收乙醚，得粗提物；
(2)粗提物分散于2倍量乙醇中，-20℃静置过夜，过滤，滤液备用；
(3)将步骤(2)滤液浓缩至无醇味，以正己烷-水液液萃取，萃取3次，合并正己烷层，浓缩得提取物1；
(4)取上述提取物1，经20mL乙酸乙酯溶解后加入4g硅胶拌样，旋转蒸发法除去乙酸乙酯至硅胶成流沙状，上样，依次用正己烷/乙酸乙酯为50/1，30/1，20/1和10/1的洗脱液减压洗脱，收集洗脱液，浓缩即得鱼腥草提取物。
对所得提取物成分进行分析，GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为54.3％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为33.7％。
实施例7
(1)鱼腥草100g装入萃取罐内，萃取时间60min，压力15MPa，温度40℃，CO2流量2kg/h，其中分离釜Ⅰ的压力10MPa，温度36℃，分离釜Ⅱ的压力7.5MPa，温度32℃，收集粗取物。
(2)将步骤(1)滤液浓缩至无醇味，以乙醚-水液液萃取，萃取2次，合并乙醚层，浓缩得提取物；
对所得提取物成分进行分析，GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为21.7％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为14.3％。
对比例1
按照“薛青松,殷华茹.溶剂浸提条件下鱼腥草中癸酰乙醛的高效提取.分析科学学报,2013,(3)29,386-390”记载的方法进行提取：新鲜鱼腥草地下茎剪成约2cm长小段，精确称取50g，置磨口锥形瓶中，加入50mL乙酸乙酯，浸泡456h，过滤，滤液加足量无水硫酸钠干燥，减压回收乙酸乙酯，得提取物。
对所得提取物成分进行分析，由GC面积归一化法测得鱼腥草素含量为44.6％，DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为5.8％。
试验例1鱼腥草提取物小鼠急性毒性试验
(1)实验样品：对比例1提取物(A)，实施例1提取物(B)，实施例4提取物(C)，实施例5提取物(D)，鱼腥草素钠(E)，鱼腥草素(F)。将以上样品溶于0.025g/ml聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)的生理盐水中，将A、B、C、D和F分别配制成鱼腥草素含量为1.5mg/mL的溶液。0.025g/ml聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)(G)为对照。
(2)动物情况：ICR小鼠，20±2g，雌雄各半，10只/组，注射剂量为0.2ml/10g(小鼠体重)，尾静脉注射给药，观察动物的急性毒性反应。
(3)实验结果
表1小鼠急性毒性实验结果
(4)实验结论：由表1结果可知，对比例1提取物(A)给药后小鼠出现非常严重的急性毒性反应，包括呼吸困难、强直性昏厥、抽搐，且5min内全部死亡，而本发明所得提取物(B，C，D)小鼠尾静脉注射给药后急毒反应相对较轻，无死亡现象，明显降低了提取物的毒性，提高了安全性。
试验例2溶血性试验
(1)实验样品：实施例3提取物(A)，实施例5提取物(B)，鱼腥草素钠(C)，鱼腥草素(D)；以上各样品分别溶于0.025g/ml聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)的生理盐水中，各自配制成2mg/mL的供试样品溶液。0.025g/ml聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)(E)为对照样品溶液。
(2)实验方法：每种实验样品各取7个10mL离心管，编号，1～7。其中1～5号管为实验样品管；6号为阴性对照管，7号为阳性对照管。按表2所示配方分别向各试管中依次加入2％(v/v)红细胞混悬液、生理盐水或蒸馏水，及步骤(1)配制的实验样品溶液，混匀后，立即置37℃恒温箱中进行温育，开始每隔半小时观察一次，1小时后每隔1小时观察一次，共观察3小时。
表2溶血实验设计
(3)评价标准：
溶血实验结果按如下标准进行观察：
++(全部溶血)：溶液呈澄明红色，试管底部无红细胞残留；
+－(部分溶血)：溶液呈浅红色或深黄棕色，试管底部有少量红细胞残留；
－－(不溶血)：红细胞全部下沉，上清液无色澄明或呈淡黄色；
Agg.(絮凝)：溶液中有棕红色或棕褐色絮状沉淀，振摇后不分散。
(4)实验结果：
表3溶血性实验结果
注：※为该组红细胞1小时内即全部溶血。
(5)实验结论：由表3可以看出，鱼腥草提取物A、B组溶血作用非常弱，由于空白聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)(E)溶液本身具有一定的溶血作用，因此鱼腥草提取物A、B组的溶血现象很大程度上是由空白聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)溶液造成的，提示鱼腥草提取物不具有明显的溶血现象，其安全性较好；鱼腥草素钠(C)和鱼腥草素(D)存在严重的溶血作用，安全性差。
试验例3体外抗菌活性试验
(1)实验样品：对比例1提取物(A)，实施例1提取物(B)，实施例5提取物(C)，鱼腥草素(D)，鱼腥草素钠(E)，阳性对照：左氧氟沙星(F)。
(2)细菌株：表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，粪肠球菌，屎肠球菌。
(3)最低抑菌浓度(MIC)的测定：采用平皿法测定，实验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌，药物溶解后用MH肉汤二倍稀释至各所需浓度，分别加适量到平皿中，MH琼脂培养基溶化后定量注入含药平皿中混匀，培养基凝固后用多点接种器接种实验菌(105cfu/点)，置35℃恒温培养18h后观察结果。无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为MIC。
(4)实验结果
表4体外抗菌活性实验结果：
注：“–”表示样品在最大测定浓度下无抗菌活性。
MSSE：甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌；
MRSE：甲氧西林耐药的表皮葡萄球菌；
VSE：万古霉素敏感的肠球菌；VRE：万古霉素耐药的肠球菌
(5)实验结论：结果表明，上述实验条件下阳性对照F组左氧氟沙星对各细菌的MIC与现有文献公开的数据接近，表明本发明的体外抗菌活性实验系统成立，试验结果可信；对比例1提取物(A)对所有实验菌无明显抗菌活性，而本发明实施例鱼腥草提取物(B，C)对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌及屎肠球菌均具有一定的抑制作用。鱼腥草素(D)和鱼腥草素钠(E)的抗菌活性稍强于提取物，说明随着鱼腥草素含量的提高，其活性增强。该实验证明鱼腥草提取物具有一定的抗菌活性。
试验例4体外抗病毒活性试验
(1)实验样品：对比例1提取物(A)，实施例1提取物(B)，实施例3提取物(C)，实施例5提取物(D)，鱼腥草素钠(E)，鱼腥草素(F)，阳性对照：利巴韦林(G)。
(2)病毒株：流感病毒A/汉防/359/95(H3N2)，柯萨奇病毒B3型(CVB3)，柯萨奇病毒B6型(CVB6)。
(3)CPE(细胞病变程度)法测定IC50(半数抑制浓度)
H3N2以MDCK(狗肾)细胞为病毒宿主，将实验样品A、B、C、D、E和F分别溶于细胞培养液配成初始浓度为200μg/mL的溶液，再用细胞培养液稀释，每次稀释至上一次稀释后溶液浓度的1/3，共稀释8次得8个稀释度。以细胞病变为指数在显微镜下进行观察。完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1：无病变为0。待病毒对照组病变程度(CPE)达4时观察各组细胞病变程度，用Reed-Muench法分别计算样品对病毒的半数抑制浓度(IC50)。
CVB3与CVB6以Vero(非洲绿猴肾)细胞为病毒宿主，将实验样品A、B、C、D、E和F分别溶于细胞培养液配成初始浓度为200μg/mL的溶液，再用细胞培养液稀释，每次稀释至上一次稀释后溶液浓度的1/3，共稀释8次得8个稀释度。待病毒对照组CPE达4时观察各组细胞病变程度，用Reed-Muench法分别计算样品对病毒的半数抑制浓度(IC50)。
(4)实验结果：
表5体外抗病毒活性实验结果：
(5)实验结论：由表5结果可知，上述实验条件下，阳性对照G组利巴韦林的IC50与现有文献公开的数据接近，表明本发明的体外抗病毒活性实验系统成立，试验结果可信；对比例1提取物(A)的IC50＞66.67μg/mL，不具有明显的抗病毒的活性，而本发明实施例鱼腥草提取物(B，C，D)的IC50小于30μg/mL，且随着鱼腥草素含量的提高，其活性增强，证明提取物具有显著的抗病毒活性。
试验例5软胶囊的制备
取实施例3中制备的鱼腥草提取物0.4g，维生素E 10mg，溶于20mL大豆油中，分装于软胶囊中，每粒理论装量为0.5mL。
试验例6脂肪乳的制备
取实施例3中制备的鱼腥草提取物0.4g，卵磷脂2.4g，注射用大豆油40mL，加热至50℃形成油相；另取甘油4.5g，泊洛沙姆(F68)4g，加入至150mL水中，加热至50℃形成水相。在16000r/min高剪切条件下，将油相缓慢加入至水相，剪切乳化8min,迅速冷却得初乳。将初乳用高压均质机在800Bar条件下乳化6次，即得均匀的类白色脂肪乳剂。
试验例7β-环糊精包合物的制备
取实施例3中制备的鱼腥草提取物0.4g，溶于5mL乙醇；另取β-环糊精5g，加入至100mL水中，加热至50℃形成环糊精饱和溶液。在磁力搅拌条件下，将提取物乙醇溶液缓慢加入至环糊精饱和溶液中，继续搅拌30min后，停止加热，继续搅拌5小时，4℃静置12h，冷冻干燥即得白色粉末状挥发油-环糊精包合物。以此包合物为中间载体，可进行胶囊剂、片剂、颗粒剂的制备。
试验例8脂质体的制备
取实施例3中制备的鱼腥草提取物40mg，大豆卵磷脂600mg，胆固醇200mg，溶于30mL氯仿；然后将该氯仿溶液在圆底烧瓶中旋转蒸发，直至形成均匀薄膜，再加入含2％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)的PBS6.8的缓冲液，摇瓶法使茄形瓶内壁薄膜完全脱落，静置30min，在冰水浴条件下150W探头超声10min，过0.45μm微孔滤膜，得到淡黄色均匀乳状液。可在此基础上冷冻干燥，得粉末状挥发油脂质体。
试验例9固体脂质纳米粒的制备
山嵛酸甘油酯(Compritol 888ATO)(3％)及大豆磷脂S75(2％)，80℃水浴加热，得黄色透明液体，作为油相；2％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)加至20mL蒸馏水中，加热至同等温度，作为水相；取实施例3中制备的鱼腥草提取物40mg，加入200mg油酸，超声溶解，加至熔融的油相中，迅速将水相加至含药油相中，在14000rpm剪切3min得初乳。将初乳转移至探头超声仪中，200W超声10min，过0.45μm微孔滤膜，得到淡黄色均匀乳状液。可在此基础上冷冻干燥，得粉末状挥发油固体脂质纳米粒。
试验例10复合物的制备
取实施例3中制备的鱼腥草提取物0.2g，大豆卵磷脂1g，将二者溶于30mL四氢呋喃中，置250mL茄形瓶中，40℃条件下以60r/min旋转蒸发除尽四氢呋喃，即得鱼腥草挥发油磷脂复合物。

Claims (10)

1.一种鱼腥草提取物，其特征在于，所述提取物，采用气相(GC)面积归一化法测得的鱼腥草素含量为20％～90％，可选为30％～85％，或可选为40％～80％；采用DNPH衍生化-HPLC法测得鱼腥草素的含量为8％以上，可选为10％以上，或可选为12％以上，或可选为15％以上，或可选为20％以上。
2.根据权利要求1所述的鱼腥草提取物，其特征在于，所述提取物中还含有选自α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、双戊烯、月桂烯、柠檬烯、水芹烯、壬醇、白里香素、癸醛、癸酸、月桂醛、石竹烯、甲基正壬酮、乙酸龙脑酯、氧化石竹烯、十六酸、乙酸香叶酯、月桂酸、棕榈酸、植物醇、榄香烯、十六烷、十六烷酸、十八碳烯酸、软脂酸、亚油酸中的至少一种。
3.权利要求1或2所述的鱼腥草提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括向鱼腥草中加入有机溶剂进行的提取步骤，以及精制步骤；可选地，所述精制步骤包括选自沉淀法、溶剂萃取法、吸附法、分馏法中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述提取步骤采用的有机溶剂包括选自醇类、醚类、酮类、酯类、烷烃类、卤代烷烃类、芳香烃类、四氢呋喃、二硫化碳中的至少一种；可选为选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙醚、甲基乙基醚、二乙醚、二氧六环、丙酮、丁酮、乙酸乙酯、石油醚、己烷、环己烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、二硫化碳中的至少一种。
可选地，所述沉淀法采用的溶剂选自醇类，可选为选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇中的至少一种，
可选地，所述溶剂萃取法所用的溶剂为选自醇类、醚类、酯类、烷烃类、卤代烷烃类、芳香烃类、中的至少一种；可选为选自正丁醇、异丁醇、乙醚、甲基乙基醚、二乙醚、乙酸乙酯、石油醚、环己烷、正己烷、正庚烷、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、甲苯、二甲苯中的至少一种；或可选为选自乙酸乙酯、正己烷、石油醚、二氯甲烷中的至少一种。
可选地，所述吸附法采用的吸附剂包括大孔吸附树脂、硅胶、氧化铝、活性炭、硅藻土中的至少一种。可选地，所述大孔树脂吸附法所用的大孔树脂包括苯乙烯型、聚丙烯酸酯型和丙烯酰胺型大孔树脂，可选为苯乙烯型大孔树脂；可选地，所述苯乙烯型大孔树脂为非极性、低极性或中等极性吸附树脂，或可选地，所述苯乙烯型大孔树脂选自DM301、NKA-9、AB-8、D101、DM130、DM-18、D312、HPD100、HPD200、HPD300、HPD400、HPD450、HPD600、HPD750、HPD100A、H103、XAD-1、XAD-2、XAD-3、XAD-4、XAD-5、HP-10、HP-20、HP-30、HP-40、HP-50型大孔树脂；可选地，大孔树脂吸附法所用的洗脱液为选自乙醇、甲醇、丙酮及其混合物中的至少一种任选地和水组成的混合物；
可选地，所述硅胶吸附法所用的硅胶为50～400目，洗脱方式为常压洗脱、加压洗脱和减压洗脱中的至少一种。
可选地，所述硅胶吸附法所采用的洗脱液为石油醚、甲苯、乙醚、正己烷、环己烷、正庚烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、正丁醇、异丙醇、乙酸、丙酮、乙醇、甲醇、水中的至少一种；
可选地，所述分馏法选自减压分馏和分子蒸馏中的至少一种。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述提取步骤所用的方法选自索式提取法、溶剂浸渍法、溶剂回流法、微波提取法和超临界CO2萃取法中的至少一种；可选地，溶剂浸渍法任选地利用加热和/或超声辅助提取。
6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取步骤：以体积/重量(L/kg)计，每次向鱼腥草中加入1～10倍有机溶剂，提取1～3次，浓缩提取液，得粗提物；可选地，每次向鱼腥草中加入1～5倍有机溶剂，所述浓缩为减压浓缩；
(2)精制步骤：进行以下(a)、(b)、(c)、(d)操作中的至少一种：
(a)沉淀：将所得粗提物采用醇类絮凝，除去沉淀，上清液浓缩，得提取物；可选地，以体积/重量(L/kg)计，所述醇类为粗提物的1～5倍量，可选地，所述絮凝的温度为-20～4℃，可选地，絮凝的时间为4h以上；
(b)溶剂萃取：将步骤(1)中所得粗提物或步骤(a)中所得提取物，采用萃取溶剂萃取1～3次，浓缩得提取物；
(c)大孔树脂吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物或者步骤(b)中所得提取物经大孔树脂吸附后，用洗脱液冲洗树脂除杂，再用另一洗脱液解吸附提取物，回收洗脱液，浓缩得提取物；可选地，将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物或者步骤(b)中所得提取物经20％～60％醇类分散后经大孔树脂柱吸附1h以上；可选地，所述冲洗树脂所采用的洗脱液依次为1～10倍柱体积水和1～10倍柱体积的10％～60％的乙醇；可选地，所述解吸附所用的洗脱液为1～10倍柱体积的60％～100％的乙醇；可选地，所述浓缩为减压浓缩。
(d)硅胶吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物、步骤(b)中所得提取物或者步骤(c)中所得提取物经硅胶吸附后，用洗脱液洗脱硅胶柱，回收洗脱液，浓缩得提取物。可选地，所述洗脱液为1～30倍柱体积的任意比例的石油醚与乙酸乙酯溶液；可选地，所述浓缩为减压浓缩。
可选地，所述制备方法包括下述步骤：
(1)提取步骤：以体积/重量(L/kg)计，每次向鱼腥草中加入2～3倍有机溶剂，提取1～2次，减压浓缩提取液，得粗提物；
(2)精制步骤：进行以下(a)、(b)、(c)、(d)操作中的至少一种：
(a)沉淀：将所得粗提物采用1～3倍量的80％～100％的醇类于-20～0℃静置絮凝12h以上，过滤除去沉淀，上清液减压浓缩得提取物；
(b)溶剂萃取：将步骤(1)中所得粗提物或步骤(a)中所得提取物，采用萃取溶剂萃取2～3次，减压浓缩，得提取物；
(c)大孔树脂吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物或者步骤(b)中所得提取物经3～10倍量的30％～50％醇类分散后经大孔树脂柱吸附1～4h，用3～5倍柱体积水和3～5倍柱体积的20％～5％的乙醇冲洗树脂除杂，再用3～7倍柱体积的80％～95％的乙醇洗脱液解吸附提取物，回收解吸附洗脱液，减压浓缩得提取物。
(d)硅胶吸附：将步骤(1)中所得粗提物、步骤(a)中所得提取物、步骤(b)中所得提取物或者步骤(c)中所得提取物用1～5倍量硅胶拌样，将拌样后硅胶上样于3～50倍硅胶的硅胶柱顶端，用洗脱液洗脱硅胶柱，回收洗脱液，浓缩得提取物。可选地，所述洗脱液为1～20倍柱体积的石油醚与乙酸乙酯体积比为50:1～1:20的混合溶液；收集洗脱液，减压浓缩得提取物。
7.一种药物组合物，包括权利要求1或2所述的鱼腥草提取物以及任选的药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述药物组合物的剂型为片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、乳剂(包括普通乳剂、亚微乳剂、微乳剂)、滴丸剂、栓剂、注射溶液或雾化溶液剂。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，所述药物组合物的剂型为环糊精包合物、油溶液、亚微乳、纳米乳、自微乳、微球、脂质体和固体脂质纳米粒。
10.权利要求1或2所述的鱼腥草提取物在制备抗菌、抗病毒药物中的用途。
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