CN101906132A - 芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法，该方法通过磷酸缓冲溶液提取、硫酸铵沉淀、以及阴离子交换树脂DEAE柱吸附、洗脱等步骤分离得到具有抗氧化活性的多肽，为维吾尔药食两用植物芹菜籽的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法提取、分离过程简单，又不易使多肽失活，制备的多肽抗氧化活性高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低纯化过程成本，是制备生物活性多肽的理想方法之一。通过该方法获得的多肽作为制备食品以及化妆品添加剂的用途。

Description

芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法
技术领域
本发明涉及一种芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法。
背景技术
芹菜“Apium graveolens L.”又名香芹、旱芹，是伞形科一年生或两年生草本植物，喜肥沃土壤，全国和世界各地均有栽培。芹菜籽为伞形科植物旱芹的干燥成熟果实，已记载于《中华人民共和国卫生部<药品标准>维吾尔药分册》和《维吾尔药志》等书籍，是新疆资源丰富的药食兼用植物资源。维吾尔医认为芹菜籽能消除寒湿闭阻，消食健胃，消肿散气，消石止痛，调和百药，增强泻药的功能，振奋性欲。用于寒湿性大小关节痛疼，颈项疼痛，胁肋疼痛，体内结石，呕吐血痢，小便不通，月事不行，死胎不下以及内脏寒湿性病变。维吾尔医药临床表明，芹菜籽有散气、消肿、利尿、开通阻滞、降血压等功效，在维吾尔药中主要用于治疗高血压病、关节炎、类风湿关节炎、气滞性子宫炎、腹水、肾脏等疾病。
蛋白质是人体的重要组成部分，也是人类饮食结构的重要成分。近来的研究结果表明，小分子量的多肽更容易被人体吸收，具有对人体有益的各种生理功能。抗氧化性多肽是生物活性肽的一种，通过减少氧自由基、羟自由基从而达到抗衰老的功能，使用安全性高。同时还能防止油脂氧化，作为抗氧化剂使用时，这类多肽安全、高效，无助氧化作用。目前食品工业中使用的抗氧化剂大多是人工合成的化学抗氧化剂，对人体有一定的毒害作用，使人们对其安全性产生忧虑。而抗氧化活性肽逐渐显示出其在医药、食品、化妆品、饲料等领域应用的优势。
目前，抗氧化肽在农业、医药、食品和化妆品等领域已经有了一定的应用实践并取得了较好的效果。近年来的研究发现自由基可以导致脂质过氧化，损伤蛋白质、脱氧核糖、机体细胞等，从而引发一系列疾病，如心血管疾病、白内障、老年痴呆、癌症等。而抗氧化多肽具有清除自由基、防止脂质过氧化的功效，可作为一种基料添加到功能性食品中，起到防止各种疾病发生的作用。另外，抗氧化性多肽可以应用于化妆品行业，作为一些修复型化妆品的添加剂，如营养霜和面膜，可以快速恢复皮肤的光泽与弹性，减少皱纹，对延缓衰老起着积极的作用；用于护发，有很好的光泽效果和高效的保护作用，可使头发免受环境条件和化学因素的破坏。
由于抗氧化多肽的分子小，所以直接从动植物组织中提取天然抗氧化多肽时，天然提取资源有限，工艺复杂，成本昂贵。如何提高生产效率、降低成本成为抗氧化多肽的问题。在国内植物多肽类化合物的研究尚处于初始阶段，研究范围小，对于多肽类化合物的化学研究文献很有限，而且使用的方法中植物多肽类化合物回收低，不适用于大规模制备，这很大程度上限制了抗氧化多肽类活性化合物的应用和工业化生产。因此，寻找安全高效的抗氧化替代品就显得十分重要。
发明内容
本发明目的在于，提供一种芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法，该方法通过磷酸缓冲溶液提取、硫酸铵沉淀、以及阴离子交换树脂DEAE柱吸附、洗脱等步骤分离得到具有抗氧化活性的多肽，为维吾尔药食两用植物芹菜籽的生物活性物质基础研究，并开发相应的产品提供了依据。该方法提取、分离过程简单，又不易使多肽失活，制备的多肽抗氧化活性高，无毒性、热稳定性好，易于扩大规模生产，降低纯化过程成本，是制备生物活性多肽的理想方法之一。通过该方法获得的多肽作为制备食品、药品以及化妆品添加剂的用途。
本发明所述的一种芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法，按下列步骤进行：
a、将脱脂芹菜籽用液氮研磨，再用磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取，时间为1-8小时，过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
b、将上清液加入无水硫酸氨，充分搅拌溶解后放置冰箱静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽；
c、将粗提多肽用乙酸铵缓冲液溶解，离心，滤液再用乙酸铵缓冲液稀释，经阴离子交换树脂DEAE柱，将吸附物用含有乙酸铵的氯化钠溶液洗脱，所得溶液透析脱盐，低温干燥，即可得到抗氧化多肽；
d、再利用常规方法十二烷基磺酸钠-PAAG确定提取的多肽的成分及其分子量，对分离的多肽进行抗氧化活性即2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除来确定多肽的抗氧化活性。
步骤a、b和c中的提取、分离、纯化过程所用水均为三蒸水。
步骤a、b和c中的低温离心速度为12000转/分。
步骤a中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，pH＝6.0-8.0。
步骤b中无水硫酸铵饱和度为30％-80％。
步骤d中乙酸铵缓冲溶液的浓度为0.01-0.05mol/L，pH＝8.0-9.0。
所述的方法获得的芹菜籽抗氧化多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
附图说明
图1为本发明芹菜籽抗氧化多肽的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中：0号为标准蛋白标记，甲状旁腺激素(1-34)(4.1kDa)，抑肽酶(6.5kDa)，甲状旁腺激素(1-84)(9.5kDa)，溶菌酶(14.4kDa)，胰蛋白酶抑制剂(20.0kDa)，磷酸丙糖异构酶(27.0kDa)，猪胃蛋白酶(35.0kDa)，卵清蛋白(45.0kDa)，牛血清白蛋白(66.0kDa)；1号为芹菜籽抗氧化多肽。
具体实施方式
实施例1
多肽的提取：
取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.1mol/L，pH＝6.0的磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取1小时，将提取液先用纱布过滤，将滤液用低温离心速度为12000转/分除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为30％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心速度为12000转/分，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到粗提多肽；
将粗提多肽用pH 9.0，浓度为0.01mol/L的乙酸铵缓冲液溶解，离心速度为12000转/分，滤液再用乙酸铵缓冲液稀释，经过已平衡好的阴离子交换树脂DEAE柱，将吸附物用含有乙酸铵的氯化钠溶液(即在乙酸铵溶液中加入氯化钠)洗脱，所得溶液透析脱盐，经低温干燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。
所述的方法获得的芹菜籽抗氧化多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例2
多肽的提取：
取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.08mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取4小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心速度为12000转/分除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为40％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心速度为12000转/分，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到粗提多肽；
将得到的粗提多肽用pH 8.2，浓度为0.02mol/l的乙酸铵缓冲液溶解，离心速度为12000转/分，滤液再用乙酸铵缓冲液稀释，经过已平衡好的阴离子交换树脂DEAE柱，将吸附物用含有乙酸铵的氯化钠溶液(即在乙酸铵溶液中加入氯化钠)洗脱，所得溶液透析脱盐，经低温干燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。
所述的方法获得的芹菜籽抗氧化多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例3
多肽的提取：
取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.05mol/L，pH＝8.0的磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取6小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心速度为12000转/分除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为50％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心速度为12000转/分，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到粗提多肽；
将得到的粗提多肽用pH 8.7，浓度为0.04mol/l的乙酸铵缓冲液溶解，离心速度为12000转/分，滤液再用乙酸铵缓冲液稀释，经过已平衡好的阴离子交换树脂DEAE柱，将吸附物用含有乙酸铵的氯化钠溶液(即在乙酸铵溶液中加入氯化钠)洗脱，所得溶液透析脱盐，经低温干燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。
所述的方法获得的芹菜籽抗氧化多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例4
多肽的提取：
取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.01mol/L，pH＝7.5的磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取8小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心速度为12000转/分除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为60％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心速度为12000转/分，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到粗提多肽；
将得到的粗提多肽用pH 8.4，浓度为0.05mol/l的乙酸铵缓冲液溶解，离心速度为12000转/分，滤液再用乙酸铵缓冲液稀释，经过已平衡好的阴离子交换树脂DEAE柱，将吸附物用含有乙酸铵的氯化钠溶液(即在乙酸铵溶液中加入氯化钠)洗脱，所得溶液透析脱盐，经低温干燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。
所述的方法获得的芹菜籽抗氧化多肽作为制备食品或化妆品的添加剂的用途。
实施例5
多肽的提取：
取100克脱脂的芹菜籽用液氮研磨，再用浓度为0.03mol/L，pH＝6.5的磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取7小时，将提取液先用纱布过滤，滤液用低温离心速度为12000转/分除去沉淀，得到上清液备用；
多肽的分离：
将上清液根据体积添加无水硫酸氨至其饱和度为80％，充分搅拌溶解后放入于冰箱中静置24小时，离心速度为12000转/分，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐，干燥，得到粗提多肽；
将得到的粗提多肽用pH 8.0，浓度为0.03mol/l的乙酸铵缓冲液溶解，离心速度为12000转/分，滤液再用乙酸铵缓冲液稀释，经过已平衡好的阴离子交换树脂DEAE柱，将吸附物用含有乙酸铵的氯化钠溶液(即在乙酸铵溶液中加入氯化钠)洗脱，所得溶液透析脱盐，经低温干燥，即可得到芹菜籽抗氧化多肽。
实施例6
通过本发明所述方法获得的芹菜籽抗氧化多肽进行分子量范围的确定：
试剂配制及样品处理：
样品缓冲液：0.5mL的0.5mol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(pH：6.8)、2mL的10％十二烷基磺酸钠、1mL甘油、0.5mL的β-巯基乙醇、1mL的水、微量的溴酚蓝；
样品的处理：样品溶液和样品缓冲液等体积混合，隔水煮沸10min，离心10min；
电极缓冲液：将15.1克三羟甲基氨基甲烷、94克甘氨酸、50mL的10％十二烷基磺酸钠溶解并定容至4L。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液：30％(W/V)丙烯酰胺、0.8％(W/V)N，N’-甲叉双丙烯酰胺；
15％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：1.1mL的H2O、2.5mL的30％(V/V)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液、1.3mL的1.5mol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(pH：8.8)、0.05mL的10％(W/V)十二烷基磺酸钠、0.05mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.002mL的N，N，N′，N′-四甲基乙二胺；
5％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶配制：0.68mL的H2O、0.17mL的30％(V/V)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳储存液、0.13mL的0.5mol/L的三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(pH：6.8)、0.01mL的10％(W/V)十二烷基磺酸钠、0.01mL的10％(W/V)过硫酸铵、0.001mL的N，N，N′，N′-四甲基乙二胺；
电泳条件：恒压100伏，电泳时间约2小时。
考马斯亮蓝脱色液：25％无水乙醇、8％的冰乙酸。
考马斯亮蓝染色液：将0.6克的考马斯亮蓝G-250溶解在300mL的脱色液中，过滤，棕色瓶储存；
电泳结束后将凝胶片置于考马斯亮蓝染色液中4h，再用脱色液浸泡至背景色褪色完全为止。
实施例7
通过本发明所述方法获得的芹菜籽抗氧化多肽活性的确定：
将5mL的2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(简称Abts)(19.2mg)与88μL的7mmoL/L的过硫酸钾水溶液混合，在室温，避光的条件下静置过夜，形成2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基储备液，该储备液在室温，避光的条件下稳定，使用前用磷酸盐缓冲溶液释放成工作液，要求其在30℃，734nm波长下的吸光度为0.7+0.02。
将所得的芹菜籽抗氧化多肽用0.1M，pH＝8.7的磷酸盐缓冲溶液配成溶液，取10μL的多肽溶液，并加入6μL的磷酸盐缓冲溶液，再加入184μL的2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基工作液，准确振30秒，在20℃下测定反应液在734nm处5min的吸光值。实验以Vc为阳性对照，设试剂空白，样品空白和样品实验组。
根据样品的吸光值、样品空白和试剂空白的吸光值，计算所得多肽对2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除的IC50浓度。IC50浓度为当样品对2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除率达到50％时，所需的样品浓度。
表1所得多肽的IC50浓度(清除Abts自由基的IC50)

Claims (6)

1.一种芹菜籽中原生抗氧化多肽的快速制备方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、将脱脂芹菜籽用液氮研磨，再用磷酸缓冲液在温度4℃搅拌提取，时间为1-8小时，过滤，将滤液用低温离心机除去沉淀，得到上清液备用；
b、将上清液加入无水硫酸氨，充分搅拌溶解后放置冰箱静置24小时，离心，沉淀，将沉淀物采用透析脱盐后，干燥得到粗提多肽；
c、将粗提多肽用乙酸铵缓冲液溶解，离心，滤液再用乙酸铵缓冲液稀释，经阴离子交换树脂DEAE柱，将吸附物用含有乙酸铵的氯化钠溶液洗脱，所得溶液透析脱盐，低温干燥，即可得到抗氧化多肽；
d、再利用常规方法十二烷基磺酸钠-PAAG确定提取的多肽的成分及其分子量，对分离的多肽进行抗氧化活性即2，2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除来确定多肽的抗氧化活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a、b和c中的提取、分离、纯化过程所用水均为三蒸水。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤a、b和c中的低温离心速度为12000转/分。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于步骤a中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，pH＝6.0-8.0。
5.根据权利要求2-3所述的方法，其特征在于步骤b中无水硫酸铵饱和度为30％-80％。
6.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于步骤d中乙酸铵缓冲溶液的浓度为0.01-0.05mol/L，pH＝8.0-9.0。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105566474A (zh) * 2016-03-08 2016-05-11 山西大学 一种芝麻粕阳离子多肽的制备方法和应用
CN109355335A (zh) * 2018-12-03 2019-02-19 天津科技大学 芹菜籽发酵制备的降血脂肽的提取方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《new zealand journal of botany》 19970930 LAST D.I等 Antifungal proteins from seeds of Australian native plants isolation of an antifungal peptide from Atriplex nummularia 第385-394页 1-6 第35卷, 第3期 2 *
《井冈山大学学报（自然科学版）》 20100531 王文君等 芹菜籽中总黄酮提取工艺条件的研究 第61-64页 1-6 第31卷, 第3期 2 *
《农产品加工（学刊）》 20060331 张纯丽等 活性多肽提取分离方法研究进展 第27-30页 1-6 , 第3期 2 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105566474A (zh) * 2016-03-08 2016-05-11 山西大学 一种芝麻粕阳离子多肽的制备方法和应用
CN109355335A (zh) * 2018-12-03 2019-02-19 天津科技大学 芹菜籽发酵制备的降血脂肽的提取方法

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