CN101905037A - 一种修复骨缺损的生物复合支架及组织工程骨 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种修复骨缺损的生物复合支架，是由纳米羟基磷灰石和丝素蛋白构成的，其中，纳米羟基磷灰石与丝素蛋白的质量比为90∶10～60∶40，复合支架呈多孔状，孔隙率70％～95％，孔径尺寸100～600μm，以圆形为主，孔径间相互贯通。本发明还公开了一种组织工程骨，是由转染VEGF基因的BMSCs植入修复骨缺损的生物复合支架上构建而成的。本发明以丝素蛋白/纳米羟基磷灰石溶胶为原料，利用离子沥滤结合冷冻干燥工艺制备丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架，通过调节NaCl粒子的半径及冷冻参数控制复合支架内孔径的分布。与现有技术相比，采用本发明所得支架气孔率及孔径分布更易控制，且具有良好的力学性能。

Description

一种修复骨缺损的生物复合支架及组织工程骨

技术领域

本发明涉及一种丝素蛋白/纳米羟基磷灰石生物复合支架及其制备方法，以及由其构建的组织工程骨，属于生物医用材料领域。

背景技术

由于创伤、肿瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨组织缺损是临床面临的难题之一。目前，临床所用的骨修复材料各有利弊，不能达到理想的要求。研制具有生物相容性、可降解的三维多孔支架材料是解决这一问题的关键问题。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是天然骨组织的主要无机质成分，具有良好的生物相容性，已广泛应用于各类骨缺损的修复。但由微米级羟基磷灰石粉体制备的材料，质脆强度低，生物机械性能较差，植入后不能被新骨完全替代，在局部形成占位。前期研究表明通过控制试验条件可以得到不同形态的羟基磷灰石颗粒，其颗粒尺寸及形态对其生物相容性有较大影响。但是这距离结构功能一体化的组织工程骨相差很远，还存在某些不可克服的缺点，如缺少连通的、均匀的孔结构，不利于骨组织的生长；其降解速度与天然骨组织生长替代速度不协调；力学强度与天然骨组织的力学性能不匹配等；而且纯的羟基磷灰石只具有骨传导作用，不具有骨诱导活性。因此将纳米级羟基磷灰石与具有骨诱导活性的有机大分子复合构建与天然骨类似的复合骨替代支架材料已成为当前的研究趋势。

桑蚕丝蛋白来源丰富，除了用于传统的纺织原料外，由于其优越的力学性能和相对良好的生物体适应性，人们尝试多种方法，将其制备成不同的结构和复合材料，运用于骨组织工程。蚕丝主要由丝胶和丝素(silk fibroin，SF)两种蛋白构成。作为植入材料，丝胶的致敏性限制了其应用范围。相反，丝素蛋白却具有良好的生物相容性，对水和氧气具有良好的通透性。近年来，以其为基质的各种细胞生长支架材料的研究应运而生，成为组织工程学的一个热门研究领域。David L.Kaplan带领的小组研究了RGD、PTH、和mPTH共价修饰丝素蛋白及其诱导骨形成作用，发现造骨细胞可在丝素蛋白上粘附、增殖；通过冷冻干燥、粒子沥滤和气体发泡法分别制备了三维多孔丝素支架，考察了制备方法及条件对支架形态和功能的影响；探索了一种新的全水工艺法制备丝素支架，研究了该支架负载BMP-2后的体内外成骨能力；在此基础上研究了纳米羟基磷灰石在丝素支架的沉积。Li Wang等人通过湿法-机械化学合成路线制备出SF/HA纳米溶胶，研究了化学修饰对SF/HA复合凝胶微观结构及凝胶行为的影响。四川大学的赵勇、王江等人采用仿生矿化法构建三维多孔丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，并对其进行体外蛋白酶降解和成骨细胞培养。上述支架材料具有连通的三维多孔结构，显示出良好的生物相容性并能促进成骨细胞的生长和分化，因而有望成为新型有机/无机复合生物材料。但对于SF/HA复合支架的制备及其相关体内外实验仍处于起步阶段，缺少系统的研究。

血管化是大块组织工程骨发展的瓶颈和研究热点。目前促进组织工程化骨血供重建的方法主要有：(1)利用显微外科技术，使用带血管蒂的筋膜瓣或血管束植入细胞与材料复合物；(2)采用内皮细胞与成骨细胞联合移植的方法；(3)利用血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)促进血管生长。其中VEGF是血管内皮细胞有效的有丝分裂原，是已知诱导血管再生作用最强的生长因子，并且在骨组织发生、发育以及再生过程中，VEGF起着重要调节作用，将VEGF应用于血管化组织工程骨组织的构建应能取得较好的效果。组织工程修复均属于血管形成过程，是一个多因子协调作用的复杂调控过程。目前认为毛细血管形成过程中，Ang-1、Ang-2及VEGF这三种因子发挥重要作用，构成Ang/血管生成素受体信号传导途径。当机体启动血管生长时，首先是VEGF与VEGF受体结合，引发内皮细胞增生并迁移，内皮细胞相互作用形成幼稚管腔，逐渐发育形成毛细血管。骨髓基质干细胞(Bonemarrow stromal cells，BMSCs)是骨组织工程临床应用良好的种子细胞来源。若将VEGF基因转入BMSCs中，就有可能使BMSCs在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成与长入，有利于血管化组织工程骨组织的新生，提高组织工程骨组织修复骨缺损的效果，并解决了活体直接应用VEGF不能长久保持其活性且价格昂贵等问题。

分析上述研究结果可知，将丝素蛋白和纳米羟基磷灰石复合有望制备出力学性能优良、微观结构与天然骨相似的复合支架材料。目前对丝素蛋白/纳米羟基磷灰石支架材料的制备及其生物相容性研究尚处于起步阶段，而通过基因转染技术将VEGF转染后的BMSCs植入该复合支架构建组织工程骨的研究目前少见报道。本发明的申请人曾于2009年06月10日申请过一项发明专利，公开号为CN 101085374A，发明名称为“一种组织工程化骨复合体及应用”，公开了一种组织工程化骨复合体，是由呈多空状且孔径间贯通的人工骨支架及植入孔中的转染有血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞组成的，其可作为骨缺损修复材料应用，可使种子细胞在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成或长入，为新骨生成提供物质基础，有利于血管化组织工程骨组织的新生，提高组织工程骨组织修复骨缺损的效果。但其存在以下缺陷：羟甲基壳聚糖粘度大，不易降解。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的发明人采用纳米技术和三维造孔技术，将无机纳米羟基磷灰石与丝素蛋白复合，构建了一种结构功能一体化的复合支架材料。同时，依照组织工程骨复合体三要素(支架材料、种子细胞、信号因子)的原则，利用基因转染技术将VEGF转染BMSCs植入复合材料内，构建了一种新型组织工程骨，使BMSCs在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，促进血管化，从而提高骨缺损修复的效率。本发明可以为研制理想的骨缺损修复替代材料提供一定的实验依据和理论基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种修复骨缺损的生物复合支架，是由纳米羟基磷灰石与丝素蛋白构成的，其中，纳米羟基磷灰石与丝素蛋白的质量比为90∶10～60∶40，复合支架呈多孔状，孔隙率70％～95％，孔径尺寸100～600μm，以圆形为主，孔径间相互贯通。

所述的修复骨缺损的生物复合支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将桑蚕丝置于0.02mol/L碳酸钠溶液中处理煮沸30～90min，然后用去离子水洗涤、干燥，除去对人体组织有致敏反应的丝胶蛋白；

(2)将上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于9.3mol/L LiBr溶液中室温下进行透析处理，获得丝素蛋白水溶液；

(3)按照纳米羟基磷灰石与丝素蛋白质量比为90∶10～60∶40，分别计算出所需Ca(NO₃)₂及(NH₄)₂HPO₄的质量；称取所需质量的Ca(NO₃)₂，将其加入上述丝素蛋白水溶液混合得到SF-Ca(NO₃)₂溶液；

(4)称取相应质量的(NH₄)₂HPO₄，配制成浓度为2mol/L的水溶液；在不断搅拌条件下将其逐滴加入上述SF-Ca(NO₃)₂混合溶液中，在此过程中添加氨水调节pH值，使其保持在9～10；

(5)将上述所得沉淀洗涤至中性，过滤得到SF/HA复合溶胶；将不同尺寸(粒径150～250μm)的NaCl颗粒加入到上述复合溶胶中，搅拌，注模，将其密封并于室温静置2～8h；脱模，并将其置于甲醇中10～90min以产生不溶于水的β-折叠结构；

(6)将所得复合材料室温下置于去离子水中浸泡24h，沥滤NaCl颗粒；-10～-80℃冷冻干燥10～24h，即得到SF/HA复合支架。

一种组织工程骨，是由转染VEGF基因的BMSCs植入修复骨缺损的生物复合支架上构建而成的。

本发明所植入的转染VEGF基因的BMSCs同发明专利CN 101085374A中所用的一致，在此不再赘述。

本发明具有如下突出的有益效果：

本发明以丝素蛋白/纳米羟基磷灰石溶胶为原料，利用离子沥滤结合冷冻干燥工艺制备丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架，通过调节NaCl粒子的半径及冷冻参数控制复合支架内孔径的分布。与现有技术相比，采用本发明所得支架气孔率及孔径分布更易控制，且具有良好的力学性能。本发明与现有技术相比，采用降解性更好的丝素蛋白代替羟甲基壳聚糖，其性能上差异不大，但能够在体内完全降解，效果更佳。

本发明所得组织工程骨使BMSCs在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成与长入，有利于血管化组织工程骨组织的新生，提高组织工程骨组织修复骨缺损的效果，并解决了活体直接应用VEGF不能长久保持其活性且价格昂贵等问题。

附图说明

图1为兔双侧桡骨缺损模型术后一周X照片；

图2为兔双侧桡骨缺损模型术后三个月X照片；

图3为兔双侧桡骨缺损模型术后八个月X照片；

图4为桡骨中段骨缺损大体标本照片(八个月后)；

图5为骨组织切片示意图(三个月后)(10×)；

图6为骨组织切片示意图(八个月后)(10×)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

(1)将桑蚕丝置于0.02mol/L碳酸钠溶液中处理煮沸30min，然后用去离子水洗涤、干燥，除去对人体组织有致敏反应的丝胶蛋白；

(2)将上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于9.3mol/L LiBr溶液中室温下进行透析处理，获得丝素蛋白水溶液；

(3)按照羟基磷灰石与丝素蛋白质量比为70/30，分别计算出所需Ca(NO₃)₂及(NH₄)₂HPO₄的质量；称取所需质量的Ca(NO₃)₂，将其加入上述丝素蛋白水溶液混合得到SF-Ca(NO₃)₂溶液；

(4)称取相应质量的(NH₄)₂HPO₄，配制成浓度为2mol/L的水溶液；在不断搅拌条件下将其逐滴加入上述SF-Ca(NO₃)₂混合溶液中，在此过程中添加氨水调节pH值，使其保持在10；

(5)将上述所得沉淀洗涤至中性，过滤得到SF/HA复合溶胶；将平均粒径为150μm的NaCl颗粒加入到上述复合溶胶中，搅拌，注模，将其密封并于室温静置2h；脱模，并将其置于甲醇中30min以产生不溶于水的β-折叠结构；

(6)将所得复合材料室温下置于去离子水中浸泡24h，沥滤NaCl颗粒；-20℃冷冻干燥24h，即得到SF/HA复合支架。

实施例2

(1)将桑蚕丝置于0.02mol/L碳酸钠溶液中处理煮沸30min，然后用去离子水洗涤、干燥，除去对人体组织有致敏反应的丝胶蛋白；

(2)将上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于9.3mol/L LiBr溶液中室温下进行透析处理，获得丝素蛋白水溶液；

(3)按照纳米羟基磷灰石与丝素蛋白质量比为80/20，分别计算出所需Ca(NO₃)₂及(NH₄)₂HPO₄的质量；称取所需质量的Ca(NO₃)₂，将其加入上述丝素蛋白水溶液混合得到SF-Ca(NO₃)₂溶液；

(4)称取相应质量的(NH₄)₂HPO₄，配制成浓度为2mol/L的水溶液；在不断搅拌条件下将其逐滴加入上述SF-Ca(NO₃)₂混合溶液中，在此过程中添加氨水调节pH值，使其保持在10；

(5)将上述所得沉淀洗涤至中性，过滤得到SF/HA复合溶胶；将平均粒径为180μm的NaCl颗粒加入到上述复合溶胶中，搅拌，注模，将其密封并于室温静置2h；脱模，并将其置于甲醇中30min以产生不溶于水的β-折叠结构；

(6)将所得复合材料室温下置于去离子水中浸泡24h，沥滤NaCl颗粒；-20℃冷冻干燥24h，即得到SF/HA复合支架。

实施例3

(1)将桑蚕丝置于0.02mol/L碳酸钠溶液中处理煮沸30min，然后用去离子水洗涤、干燥，除去对人体组织有致敏反应的丝胶蛋白；

(2)将上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于9.3mol/L LiBr溶液中室温下进行透析处理，获得丝素蛋白水溶液；

(3)按照纳米羟基磷灰石与丝素蛋白质量比为60/40，分别计算出所需Ca(NO₃)₂及(NH₄)₂HPO₄的质量；称取所需质量的Ca(NO₃)₂，将其加入上述丝素蛋白水溶液混合得到SF-Ca(NO₃)₂溶液；

(4)称取相应质量的(NH₄)₂HPO₄，配制成浓度为2mol/L的水溶液；在不断搅拌条件下将其逐滴加入上述SF-Ca(NO₃)₂混合溶液中，在此过程中添加氨水调节pH值，使其保持在10；

(5)将上述所得沉淀洗涤至中性，过滤得到SF/HA复合溶胶；将平均粒径为150μm的NaCl颗粒加入到上述复合溶胶中，搅拌，注模，将其密封并于室温静置2h；脱模，并将其置于甲醇中30min以产生不溶于水的β-折叠结构；

(6)将所得复合材料室温下置于去离子水中浸泡24h，沥滤NaCl颗粒；-20℃冷冻干燥24h，即得到SF/HA复合支架。

上述3个实施例所得丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架进行下列检测：

经过Nicolet AVATR360FT-IR证实：复合支架由丝素蛋白和纳米羟基磷灰石两相构成；

经JEM-100Cx II SEM分析证实：复合支架中孔洞相互连通，气孔率均超过80％，平均孔径在150～200μm。

经深圳三思万能材料试验机检测：复合支架抗压强度均超过150MPa，符合骨支架复合材料的要求。

实施例4构建组织工程骨

(1)VEGF基因转染BMSCs：由NCBI gene bank获得兔VEGF基因序列，利用分子生物学的原理和方法，自兔组织提取总RNA，根据合成的引物，反转录制备VEGF cDNA片段。与载体相连接，通过脂质体构建pcDNA3.1-VEGF质粒。抽取成年兔骨髓进行体外细胞培养、传代获得BMSCs。将构建的VEGF质粒导入BMSCs。

(2)取实施例1中制备的SF/nHA复合支架，然后通过常规方法将转染VEGF基因的BMSCs植入修复骨缺损的生物复合支架上，即得到组织工程骨。

实施例5构建组织工程骨及检测其性能

(1)首先传代培养BMSCs，然后将构建的VEGF质粒植入BMSCs，再置于实施例2制备的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石复合支架材料上。

(2)建立兔桡骨中段15～20mm长的骨缺损模型(建立模型的方式与发明专利CN 101085374A中记载的一致)，随机分为4组：空白对照组、单纯丝素蛋白/纳米羟基磷灰石材料组、BMSCs复合SF/nHA材料组、转染VEGF基因的BMSCs复合SF/nHA材料组，采用X线方法观察转染VEGF基因的BMSCs复合SF/nHA材料组的成骨能力。

观察指标：影像学观察——按照不同时间段拍摄X线照片观察成骨情况；

结果：植入组织工程骨一周后如图1所示，骨缺损明显；植入组织工程骨三个月后，如图2所示，可见，支架部分降解，髓腔贯通；植入组织工程骨八个月后，如图3所示，可见，修复良好，完全愈合，自体骨形成。

另外，实验中并未发现明显异常反应，生物相容性良好。

植入组织工程骨八个月后，取出桡骨，如图4所示，可以看到，骨质连续均匀，质地硬韧。完全愈合，复合材料已降解。

植入组织工程骨三个月后，组织切片如图5所示，由图可见，复合支架材料已基本降解完，新骨生成，骨髓腔贯通。(图中，黑色的代表复合支架，灰色代表骨头，白色发亮处代表骨髓腔)；植入组织工程骨八个月后，组织切片如图6所示，由图可见，复合支架材料已完全降解，骨髓生成，骨头已修复成正常骨组织状态。

结论：

经上述动物实验证实：

1.复合支架具有良好的生物相容性；

2.支架降解速度较为理想，且能完全降解；

3.骨生长良好；

4.骨组织周围血管生长丰富，给骨生长提供了良好的生长环境；

5.BMSCs具有良好的促进骨生长能力。

Claims (3)

1.一种修复骨缺损的生物复合支架，其特征在于：是由纳米羟基磷灰石和丝素蛋白构成的，其中，纳米羟基磷灰石与丝素蛋白的质量比为90∶10～60∶40，复合支架呈多孔状，孔隙率70％～95％，孔径尺寸100～600μm，以圆形为主，孔径间相互贯通。

2.权利要求1所述的修复骨缺损的生物复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将桑蚕丝置于0.02mol/L碳酸钠溶液中处理煮沸30～90min，然后用去离子水洗涤、干燥，除去对人体组织有致敏反应的丝胶蛋白；

(2)将上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于9.3mol/L LiBr溶液中室温下进行透析处理，获得丝素蛋白水溶液；

(3)按照羟基磷灰石与丝素蛋白质量比为90∶10～60∶40，分别计算出所需Ca(NO₃)₂及(NH₄)₂HPO₄的质量；然后称取所需质量的Ca(NO₃)₂，将其加入到上述丝素蛋白水溶液，超声分散得到SF-Ca(NO₃)₂溶液；

(4)称取相应质量的(NH₄)₂HPO₄，配制成浓度为2mol/L的水溶液；在不断搅拌条件下将其逐滴加入到上述SF-Ca(NO₃)₂混合溶液中，在此过程中通过添加氨水调节pH值，使其保持在9～10；

(5)将上述所得沉淀洗涤至中性，过滤得到SF/HA复合溶胶；将粒径150～250μm的NaCl颗粒加入到上述复合溶胶中，搅拌，注模，将其密封并于室温静置2～8h；脱模，并将其置于甲醇中10～90min，以产生不溶于水的β-折叠结构；

(6)将所得复合材料室温下置于去离子水中浸泡24h，沥滤NaCl颗粒；-10～-80℃冷冻干燥10～24h，即得到SF/HA复合支架。

3.一种由权利要求1所述的修复骨缺损的生物复合支架构建的组织工程骨，其特征在于：是由转染VEGF基因的BMSCs植入修复骨缺损的生物复合支架上构建而成的。

Images