CN101903511B - 生物膜的酶促防止和控制 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于从表面除去生物膜的方法、组合物和试剂盒。本文描述的方法包括向表面上的生物膜同时或相继地施用过水解酶和其它酶如蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、甘露聚糖酶、磷脂酶、纤维素酶和/或淀粉酶的混合物，以去除生物膜。

Description

生物膜的酶促防止和控制
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年12月20日递交的美国临时专利申请号61/015,504的优选权，该临时申请完整地并入此处作为参考。 
发明领域
本发明涉及用于从表面除去生物膜的酶组合物和方法。具体地，用于除去生物膜的方法包括向表面上的生物膜联合施用过水解酶(perhydrolase)和其它酶。 
背景技术
生物膜由埋在粘性胞外聚合物(exopolymer)基质中的附着性微生物群落组成，尽管尝试通过设计以杀死自由漂浮微生物的传统方法控制该基质，但其常常是顽固的。生物膜对抗生素、防腐剂和氧化性杀生物剂的抗性已经在文献中充分报告。 
用于防止和/或减少生物膜的酶学方法已有描述，见例如PCT申请号WO06/031554、WO 01/98214、WO 98/26807、WO 04/041988、WO 99/14312、和WO 01/53010。然而，需要可以在工业、牙齿和健康护理应用中控制生物膜的改良方法和组合物。 
发明简述
本发明提供用于除去生物膜的方法、组合物和试剂盒。一方面，本发明提供从表面除去生物膜的方法，所述方法包括以足以使所述生物膜减少至少25％的施用时间，向所述生物膜施用过水解酶和清除酶混合物，其中所述酶混合物选自蛋白酶、葡聚糖酶和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、 酯酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少两种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；和至少两种淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。在一些实施方案中，生物膜包含铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。在一些实施方案中，过水解酶包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列或其变体或同源物。在一个实施方案中，过水解酶是SEQ ID NO：1的S54V变体。 
在一个实施方案中，清除酶混合物由三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶组成。在一个实施方案中，清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC 265、和LYSOMAX组成。 
在一个实施方案中，过水解酶和清除酶混合物同时施用于生物膜。在另一实施方案中，过水解酶混合物和清除酶混合物相继地施用于生物膜。在一个实施方案中，过水解酶在清除酶混合物施用前施用.在一个实施方案中，过水解酶和清除酶混合物协同作用从表面除去生物膜。 
另一方面，本发明提供用于从表面除去生物膜的组合物，所述组合物包含过水解酶和清除酶混合物，其中所述清除酶混合物选自：蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露 聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少两种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；和至少两种淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。 
在一个实施方案中，清除酶混合物由三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶组成。在一个实施方案中，清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC 265、和LYSOMAX组成。 
在一些实施方案中，过水解酶包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列或其变体或同源物。在一个实施方案中，过水解酶是SEQ ID NO：1的S54V变体。 
另一方面，本发明提供用于从表面除去生物膜的试剂盒，所述试剂盒包含过水解酶和清除酶混合物、以及任选地在本文所述的生物膜去除方法中使用的说明书，其中所述酶混合物选自：蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少两种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；和至少两种淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。在一个实施方案中，过水解酶和清除酶混合物在不同容器中。在一个实施方案中，过水解酶和清除酶混合物在相同容器中。 
在一个实施方案中，清除酶混合物由三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶组成。在一个实施方案中，清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC 265、和LYSOMAX组成。 
在一些实施方案中，过水解酶包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列或其变体或同源物。在一个实施方案中，过水解酶是SEQ ID NO：1的S54V变体。 
发明详述
本发明提供用于控制，即，清除或减少，表面上的生物膜或防止生物膜在表面上形成或生长的方法、组合物和试剂盒。本发明的含酶组合物和方法适用于在例如工业水管理如冷却塔、饮用水、废水、牙齿卫生、医学植入物和装置、血液透析系统、石油回收、生物除污井、纸和纸浆加工、船体、食物加工设备、以及水递送系统如导管、管道等中控制生物膜。 
除非本文中另有定义，否则本文中所用的所有科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，John Wiley and Sons，NewYork(1994)，和Hale&Markham，The Harper Collins Dictionary  ofBiology，Harper Perennial，NY(1991)可以向本领域技术人员提供本发明中所用许多术语的一般字典。与本文所述方法和材料相类似或等价的任何方法和材料均可以用于实施或检验本发明。 
本文提供的数值范围涵盖定义该范围的数。 
除非另行说明，否则核酸按5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列按氨基至羧基方向从左向右书写。 
定义
“生物膜”是指埋在附着于表面的细胞外聚合物基质中的微生物群落。生物膜还包括水，并可以包括其它陷入的颗粒。生物膜可以包括 一种或多种微生物，包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌(需氧的或厌氧的)、藻类、原生动物、和/或酵母或丝状真菌。在一些实施方案中，生物膜包括细菌属葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、李斯特氏菌属(Listeria)、链球菌属(Streptococcus)和埃希氏杆菌属(Escherichia)的活细胞。 
“表面”是指具有允许生物膜附着的足够大小的任何结构。硬表面包括，但不限于，金属、玻璃、陶瓷、木材、矿物(例如，岩石、石头、大理石、花岗岩)、聚集物如混制的(concrete)、塑料的、复合的材料、硬橡胶材料和石膏。硬材料可以用珐琅和/或油漆涂饰(finish)。硬表面可以见于例如水处理和贮存设备及罐、乳品和食品加工仪器及设备、医疗仪器和设备，例如手术装置、持久和暂时性植入物、和工业制药机器和设备中。软表面包括，但不限于，毛发和织物。多孔表面可以是生物学表面，包括但不限于，皮肤、角质(keratin)和内部器官。多孔表面还可以见于过滤用膜以及某些陶瓷中。其它表面包括但不限于船体和泳池。 
“酶剂量”是指用于处理生物膜的、酶混合物的量、酶混合物中单个酶的量、或单独使用的单个酶的量。影响酶剂量的因素包括但不限于酶的类型、待处理的表面、和预期结果。在一些实施方案中，酶剂量是使生物膜减少至少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、或99％所需的、酶混合物的量。一般地，酶混合物中酶含量总共为大约1％或以下、2％或以下、3％或以下、或5％或以下(w/w)。 
“处理”或“控制”或“除去”生物膜是指，从表面减少或清除生物膜，包括杀死和/或抑制生物膜中的微生物的生长、和/或预防性防止生物膜在表面上形成或生长。 
“酶混合物”是指至少两种酶。本发明酶混合物中所用的酶可以来源于植物或动物来源、细菌、真菌、或酵母，并且可以是野生型或变体酶。 
“酸性条件”、“中性条件”和“碱性条件”是本领域技术人员 熟知的。典型地，“酸性条件”是指pH为大约4至大约6。“中性条件”是指pH为大约6至大约8。“碱性条件”是指pH为大约8至大约10. 
“过水解酶”是指能够催化过水解反应的酶，该反应导致产生适用于诸如物体的清洁、漂白、消毒或灭菌等应用(例如，本文所述生物膜的处理)的、足够高量的过酸。一般地，本发明方法中使用的过水解酶表现出高的过水解对水解比率。在一些实施方案中，过水解酶包含SEQ ID NO：1所示的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)过水解酶氨基酸序列、或其变体或同源物，或由所述序列或其变体或同源物组成，或基本上由所述序列或其变体或同源物组成。在一些实施方案中，过水解酶包含酰基转移酶活性，催化水性酰基转移反应。 
“过酸”是具有式RC(＝O)OOH的有机酸。 
“过水解”是指产生过酸的酶促反应。在一些实施方案中，过酸通过在过氧化氢(H2O2)存在下式R1C(＝O)OR2的酯底物的过水解产生，其中R1和R2是相同或不同的有机部分。 
短语“过氧化氢源”包括过氧化氢以及能够自发地或酶促地产生过氧化氢作为反应产物的系统的组分。 
短语“过水解对水解比率”是指在规定的条件下以及在规定的一段时间内通过过水解酶自酯底物酶促产生的过酸的量与酶促产生的酸的量的比。 
本文中，术语“酰基”是指有机酸基团，其是羧酸除去羟基(-OH)基团后的残基(例如，乙酰氯CH3CO-Cl是从乙酸CH3CO-OH形成的酰基氯)。各酰基基团的名称一般通过将相应酸的“酸”改为“酰基”而形成。 
本文中，术语“酰化”是指将酰基(RCO-)基团替代入分子中(一般替代-OH基团的活性氢)的化学转化。 
本文中，术语“转移酶”是指催化官能团从一个底物转移至另一个底物的酶。 
本文中，“蛋白质”是指由氨基酸组成的、被本领域技术人员公认为蛋白质的任何组合物。术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质” 在本文中可互换，用于指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性的或分支的，其可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经天然地或通过干预被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其它操作或修饰，例如缀合标记性成分。该定义还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。 
本文中，“多聚体”是指共价地或非共价地结合的、在溶液中以复合物形式存在的两个或多个蛋白质或肽。“二聚体”是含有两个蛋白质或肽的多聚体；“三聚体”包含三个蛋白质或肽，等等。本文中，“八聚体”是指具有8个蛋白质或肽的多聚体。多聚体的蛋白质或肽可以相同或不同。 
本文中，“酶的有效量”是指达到在特定应用(例如生物膜的去除)中需要的酶活性所必需的酶量。 
本文中，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关蛋白质”。在一些实施方案中，相关蛋白质来源于不同属和/或种，包括纲或生物体之间的差别(例如，细菌蛋白质和真菌蛋白质)。在一些实施方案中，相关蛋白质来源于相同物种。此外，术语“相关蛋白质”包括三级结构同源物和一级序列同源物。该术语还包括具有免疫学交叉反应性的蛋白质。在一些实施方案中，相关过水解酶表现出高的过水解对水解比率。 
本文中，术语“衍生物”是指，通过在C和N末端之一或两者处添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列内的一个或几个不同位置替代一个或多个氨基酸、和/或在C和N末端之一或两者处和/或在氨基酸序列内一个或多个位置缺失一个或多个氨基酸、和/或在氨基酸序列内一个或多个位置插入一个或多个氨基酸，而从亲本蛋白质产生的蛋白质。蛋白质衍生物的制备常常可以通过如下方式实现：修饰编码天生蛋白质的DNA序列、将修饰的DNA序列转化至适宜宿主内、和表达该修饰的DNA序列以产生该衍生蛋白质。 
相关(和衍生)蛋白质包括“变体”蛋白。变体蛋白与亲本蛋白之间和/或彼此之间相差少数个氨基酸残基。在一些实施方案中，不同氨基 酸残基的数目是大约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50中之任一。在一些实施方案中，变体相差大约1至大约10个氨基酸。 
在一些实施方案中，相关蛋白，例如变体蛋白，包括以下任何氨基酸序列同一性：至少大约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或99.5％氨基酸序列同一性。 
本文中，术语“类似序列”是指相对于参照蛋白质提供相似功能、三级结构和/或保守残基的蛋白质内的多肽序列。例如，在含有α螺旋或β折叠结构的表位区域中，置换类似序列中的氨基酸将维持相同的结构元件。在一些实施方案中，提供类似序列，导致变体酶，该变体酶相对于变体来源自的亲本蛋白表现出相似或改良的功能。 
本文中，“同源蛋白”是指该蛋白质(例如过水解酶)与参照蛋白质(例如，来自不同来源的过水解酶)具有相似功能(例如酶活性)和/或结构。同源物可以来自进化相关或无关物种。在一些实施方案中，同源物与参照蛋白质具有相似的四级、三级和/或一级结构，由此可能允许将参照蛋白中的区段或片段置换为同源物中的类似区段或片段，且与用非同源蛋白的序列置换该区段或片助相比，对参照蛋白的结构和/或功能的破坏性降低。 
本文中，“相应于”是指一个蛋白质或肽中的一个氨基酸残基与另一蛋白质或肽中的编号氨基酸残基类似、同源或等价。 
本文中，“相应区域”是指两个蛋白质或肽(包括两个衍生或变体蛋白或一个衍生或变体蛋白与亲本蛋白)的多肽序列中类似的、同源的或等价的位置或区域。 
本文中，“野生型的”、“天生的”、和“天然的”蛋白质是在自然界中存在的蛋白质。术语“野生型序列”是指存在于自然界中或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施方案中，野生型序列是蛋白质工程，例如产生变体蛋白，的起点。 
短语“基本上相似”和“基本上相同”用于至少两个核酸或多肽时一般是指，一个多核苷酸或多肽包含与参照(例如野生型)多核苷酸或 多肽具有至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或99.5％序列同一性的序列。序列同一性可以使用已知程序例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL以及标准参数确定。(参见例如，Altshul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Henikoff等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.89：10915；Karin等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873；和Higgins等(1988)Gene 73：237)。实施BLAST分析的软件可从美国国家生物技术信息中心公开获得。此外，可以使用FASTA(Person等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448.)检索数据库。在一些实施方案中，基本上相同的多肽仅相差一个或多个保守氨基酸替代。在一些实施方案中，基本上相同的多肽是免疫学交叉反应的。在一些实施方案中，基本上相同的核酸分子在严紧条件(例如，中至高严紧性的范围中)彼此杂交。 
“分离的”多肽或多核苷酸是指该多肽或多核苷酸基本上不含天然与其相伴的物质。基本上不含是指无至少50％、常常至少70％、更常常是至少80％、甚至更常见是至少90％的天然与其相伴的物质。 
酶混合物
多种不同的酶可以用于本发明酶混合物和方法中用于减少生物膜。本文所述的酶混合物包括至少两种酶，例如糖酶，例如纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶；酯酶和角质酶；颗粒淀粉水解酶；脂肪酶，例如磷脂酶；和半纤维素酶，例如甘露聚糖酶，的组合。该酶混合物在本文中也称为“清除酶混合物”，包括此处所述酶的组合。清除酶混合物不包括过水解酶，但在本文所述的生物膜去除方法中与一种或多种过水解酶并行地或相继地联合使用。 
可以使用的水解酶(E.C.3)包括例如蛋白酶、葡聚糖酶(糖基水解酶家族16)、纤维素酶、酯酶、甘露聚糖酶、和阿拉伯聚糖酶(arabinases)。中性和丝氨酸蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶，可以用于本发明。中性蛋白 酶是在大约6至8的中性pH范围内具有最佳蛋白水解活性的蛋白酶。适宜的中性蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。适宜的商业金属蛋白酶是来自黑曲霉(Aspergillus niger)的GC106、MULTIFECT、PURAFECT L、FNA、PROPERASE L、和PURADAX EG7000L(所有均可获自GenencorDivision，Danisco US，Inc.，Palo Alto(“Genencor”)，California)、和Alcalase、Savinase、Esperase和Neutrase(Novo Nordisk A/S，Denmark)。中性蛋白酶可以来自细菌、真菌或酵母来源、或植物或动物来源，可以是野生型或变体酶。变体酶可以在表达突变自亲本基因的基因的来源中产生。 
可用于本发明的纤维素酶的实例包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶，包括在酸性至中性pH范围内具有最佳活性的纤维素酶，例如，Genencor的均来自真菌来源的LAMINEX和INDIAGE、或来自细菌来源的PURADAX。纤维素酶可以来自例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)和青霉属(Penicillium)真菌。 
有用的颗粒淀粉水解酶的实例包括来自腐质霉属、曲霉属和根霉属(Phizopus)菌株的葡糖淀粉酶。颗粒淀粉水解(GSH)酶是指水解颗粒形式的淀粉的酶。葡糖淀粉酶是指淀粉葡糖苷酶类型的酶(例如，EC.3.2.1.3葡糖淀粉酶，1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原性末端释放葡糖基残基的外切酶。该酶还水解α-1，6和α-1，3连接。葡糖淀粉酶活性可以使用基于葡糖淀粉酶催化对硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷(PNPG)水解为葡萄糖和对硝基酚的能力的熟知测定法进行测量。在碱性pH，硝基酚形成黄色，该颜色与葡糖淀粉酶活性成比例，可以在400nm监测，之后与酶标准品进行比较，度量为GAU。一个GAU(葡糖淀粉酶活性单位)定义为在pH4.2及60℃从可溶性淀粉底物(4％ds)每小时产生1克还原糖(计算为葡萄糖)的酶量。从Genencor商业可得的适宜葡糖淀粉酶包括OPTIDEX、DISTILLASE和G-ZYME。 
可用于本发明的脂肪酶的实例包括酸性、中性和碱性脂肪酶和磷脂酶。从Genencor商业可得的脂肪酶和磷脂酶包括LYSOMAX和 CUTINASE。 
可用于本发明的半纤维素酶甘露聚糖酶的实例包括Genencor的均来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的HEMICELL和PURABRITE、来自迟缓芽孢杆菌的GC265、以及Stahlbrand等(1993)J.Biotechnol.29：229-242描述的葡聚糖酶。 
可用于本发明的酯酶和角质酶的实例可以来自任何来源，包括例如细菌来源，如门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、或真菌来源如腐质霉属或镰孢属。可从Genencor获得几种此类酶。 
可用于本发明的淀粉酶的实例包括可从细菌或真菌来源获得的α或β淀粉酶，例如芽孢杆菌淀粉酶(淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearormophilus))、和真菌淀粉酶，例如，来自曲霉，如黑曲霉、A.kawachi或米曲霉(A.oryze)、腐质霉属和木霉属。可从Genencor获得的淀粉酶包括SPEZYME FRED、SPEZYME AA、CLARASE、AMYLEX和淀粉酶的混合物SPEZYME ETHYL。可从Novozymes A/S(Denmark)获得的淀粉酶包括BAN、AQUAZYM、AQUAZYM Ultra和TERMAMYL。其它淀粉酶包括淀粉酶混合物，例如Biocon的M1和Sumizyme的CuConc、Aris Sumizyme L(内切1，5α-L阿拉伯聚糖酶)、ACH Sumizyme(β甘露聚糖酶)，腐质霉葡糖淀粉酶、葡聚糖酶(dextranase)、dextramase、壳多糖酶、ENDOH和OPTIMAX L1000(葡糖淀粉酶)。 
如在共同待决PCT申请PCT/US2007/016461中所描述的，375种以上的不同酶混合物被检测了去除生物膜的性质。该筛选导致鉴定到引起生物膜实质性减少的33种令人惊奇的酶混合物。这33种酶混合物包括如下混合物：α淀粉酶和和甘露聚糖酶；淀粉酶和蛋白酶；淀粉酶和阿拉伯聚糖酶；至少一种α淀粉酶和至少两种另外的淀粉酶；蛋白酶、纤维素酶和葡聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、和三种葡聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶；蛋白酶、淀粉酶、和葡聚糖酶；蛋白酶、甘露聚糖酶、和淀粉酶；纤维素酶、阿拉伯聚糖酶和淀粉酶；蛋 白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和磷脂酶；蛋白酶、葡聚糖酶、淀粉酶、和阿拉伯聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、和两种葡聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、和三种葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、和磷脂酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；三种蛋白酶、甘露聚糖酶、磷脂酶和酯酶；三种蛋白酶、纤维素酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、和葡聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；至少三种淀粉酶和纤维素酶；淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、和纤维素酶；淀粉酶、阿拉伯聚糖酶和蛋白酶；至少三种淀粉酶和蛋白酶；至少三种淀粉酶、蛋白酶、和纤维素酶；葡聚糖酶和淀粉酶混合物；纤维素酶和淀粉酶混合物。 
在一些实施方案中，使用一种以下混合物：蛋白酶、葡聚糖酶和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；两种或以上淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；至少两种淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶. 
在一些实施方案中，使用一种以下混合物：蛋白酶、葡聚糖酶和角质酶，其可以使用商业可得酶MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX BG和角质酶制备；蛋白酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和角质酶，其可以使用商业可得酶MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX BG；甘露聚糖酶和角质酶制备；蛋白酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和磷脂酶，其可以使用商业可得酶MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX BG；甘露聚糖酶和LYSOMAX制备；三种蛋白酶加纤维素酶的混合物、甘露聚糖酶和角质酶，其可以使 用商业可得酶PROPERASE L；PURAFECT L；FNA；和LAMINEX BG、甘露聚糖酶和角质酶制备。 
本发明一些实施方案包括可从Gnencor商业获得的如下酶制品：MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX；LYSOMAX；PROPERASE；PURADAX，PURAFECT；和SPEZYME，所有均注册了Genencor商标。 
MULTIFECT NEUTRAL包含淀粉液化芽孢杆菌蛋白酶(EC3.4.24.28)；LAMINEX BG，具有大约3200IU/g的活性水平，包含木霉属B-葡聚糖酶(纤维素酶EC3.3.1.6)；LYSOMAX，具有大约400U/g的活性水平，包含紫红链霉菌(Streptomyces violceoruber)磷脂酶；PROPERASE，具有大约1600PU/g的活性水平，包含嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)蛋白酶(EC3.4.21.62)；PURAFECT，具有大约42,000GSU/g的活性水平，包含枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)，描述于U.S.Pat.No.5,624,829；FNA包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蛋白酶(EC3.4.21.62)，描述于US专利号RE34,606和5,310,675；PURADAX，具有大约32U/g的活性水平，包含里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶(EC3.2.1.4)，描述于U.S.专利号5,753,484；SPEZYME FRED，具有大约15,100LU/g的活性水平，包含来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶(EC3.2.1.1)，描述于U.S.专利号5,736,499；5,958,739；和5,824,532。 
在一些实施方案中，使用商业可得酶的酶混合物包括如下混合物：1.MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX BG和角质酶。2.MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX BG；甘露聚糖酶和角质酶。3.MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX BG；甘露聚糖酶和LYSOMAX。4.PROPERASE L；PURAFECT L；FNA；LAMINEX BG、甘露聚糖酶和角质酶。5.PROPERASE L；PURAFECT L；FNA；甘露聚糖酶、角质酶和LYSOMAX。 6.PROPERATEL；PURAFECTL、FNA、甘露聚糖酶、LAMINEXBG。7.MULTIFECT NEUTRAL；LAMINEX BG；和甘露聚糖酶。8.FNA；PURADAX EG 7000L；LAMINEX BG、和角质酶。9.PURAFECT L；FNA；LAMINEX BG；和LYSOMAX。10.PROPERASE L；FNA；LAMINEX BG；和LYSOMAX。11.PROPERASE L；PURAFECT L；FNA；LAMINEX BG；PURADAX EG 7000L；和LYSOMAX。12.PROPERASE L；PURAFECT L；FNA；LAMINEX BG；角质酶和LYSOMAX。13.MULTIFECT NEUTRAL；PURADAX EG 7000L；LAMINEXBG；LYSOMAX；和角质酶。14.PROPERASE L；LAMINEX BG；LYSOMAX和角质酶。 
在一些实施方案中，酶混合物是上列组合1、2、3和4。其它酶组合包括：SPEZYME，其包含来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶；CuCONC，其是雪白根霉(Rhizopus niveus)Koji菌株葡糖淀粉酶的商品名，具有颗粒淀粉水解活性(Shin Nihon Chemical Co.Ltd.日本)；AFP GC 106，其是酸性真菌蛋白酶(Shin Hihon Chemical Co.Ltd.日本)；M1，其可获自Biocon India，Ltd.，Bangalore，印度；ARIS SUMIZYME(1，5-α阿拉伯聚糖酶)；和ACH SUMIZYME。15.SPEZYME FRED L；CuCON和LAMINEX BG。16.SPEZYME FLRED L；Aris SUMIZYME和LAMINEX BG。17.SPEZYME FRED L和CuCONC。18.SPEZYME FRED L；CuCONC和GC106。19.SPEZYME FRED L和GC106。20.SPEZYME FRED L和M1。21.SPEZYME FRED L；Aris SUMIZYME和GC106。22.SPEZYME FRED L；CuCONC；LAMINEX BG和GC106。 23.SPEZYME FRED L；ACH SUMIZYME和GC106。24.SPEZYME FRED L；Aris SUMIZYME；LAMINEX BG和GC106。25.CuCONC和LAMINEX BG。26.SPEZYME FRED L和Aris SUMIZYME。27.M1和LAMINEX BG。28.SPEZYME FRED L；LAMINEX BG和GC106。29.CuCONC；LAMINEX BG和GC106。 
过水解酶
一种或多种过水解酶可以与上述酶混合物联合用于本发明的生物膜去除方法中。 
在一些实施方案中，过水解酶是天然的(即，由细胞基因组编码的过水解酶)。一些实施方案中，过水解酶包含与天然过水解酶的氨基酸序列具有至少大约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一性的氨基酸序列，或由该序列组成、或基本上由该序列组成。 
一些实施方案中，过水解酶是天然耻垢分枝杆菌过水解酶。一些实施方案中，过水解酶包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其变体或同源物，或由所述序列或其变体或同源物组成，或基本上由所述序列或其变体或同源物组成。一些实施方案中，过水解酶包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少大约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％同一的氨基酸序列，或由该序列组成，或基本上由该序列组成。 
耻垢分枝杆菌过水解酶的氨基酸序列显示如下：MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGLSARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYFRRTPLDIALGMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTELARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL(SEQ ID NO：1) 
编码耻垢分枝杆菌过水解酶的相应多核苷酸序列为：5’-ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCCCCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGACCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGGGACTGAGCGCGCGCACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCAACGGCGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCTGGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACCCCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCAGCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTCGCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAGGGCGGCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCGTCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACGGCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGCCCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA-3’(SEQ ID NO：2) 
一些实施方案中，过水解酶在一个或多个与SEQ ID NO：1所示耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列中的位置等价的氨基酸位置包含一个或多个替代。一些实施方案中，过水解酶包含选自如下的任何一个氨基酸替代或选自如下的氨基酸替代的任何组合：M1，K3，R4，I5，L6，C7，D10，S11，L12，T13，W14，W16，G15，V17，P18，V19，D21，G22，A23，P24，T25，E26，R27，F28，A29，P30，D31，V32，R33，W34，T35，G36，L38，Q40，Q41，D45，L42，G43，A44，F46，E47，V48，149，E50，E51，G52，L53，S54，A55，R56，T57，T58，N59，160，D61，D62，P63，T64，D65，P66，R67，L68，N69，G70，A71，S72，Y73，S76，C77，L78，A79，T80，L82，P83，L84，D85，L86，V87，N94，D95，T96，K97，Y99F100，R101，R102，P104，L105，D106，I107，A108，L109，G110，M111，S112，V113，L114，V115，T116，Q117，V118，L119，T120，S121，A122，G124，V125，G126，T127，T128，Y129，P146，P148，W149，F150，I153，F154，I194和F196。 
一些实施方案中，过水解酶在一个或多个与SEQ ID NO：1所示耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列中的位置等价的氨基酸位置包含一个 或多个以下替代：L12C，Q，或G；T25S，G，或P；L53H，Q，G，或S；S54V，LA，P，T，或R；A55G或T；R67T，Q，N，G，E，L，或F；K97R；V125S，G，R，A，或P；F154Y；F196G。 
一些实施方案中，过水解酶在一个或多个与SEQ ID NO：1所示耻垢分枝杆菌过水解酶氨基酸序列中的氨基酸位置等价的氨基酸位置包含氨基酸替代组合：L12I S54V；L12M S54T；L12T S54V；L12Q T25S S54V；L53H S54V；S54P V125R；S54V V125G；S54V F196G；S54V K97R V125G；或A55G R67T K97R V125G。 
一些实施方案中，过水解酶具有至少1的过水解：水解比率。 
评价生物膜的去除
可以使用结晶紫测定法测量生物膜的去除。将样品浸没在结晶紫溶液(0.31％w/v)中10分钟，之后在磷酸缓冲盐水(PBS)中漂洗3次去除未结合的染料。用95％乙醇提取被生物膜保持的结合染料，在540nm读取该结晶紫/乙醇溶液的吸光度。生物膜的去除百分数计算为[(1-剩余生物膜百分数)x100]。剩余生物膜百分数按如下方式计算：从酶处理后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培养基+酶溶液的吸光度，除以未处理的对照生物膜的吸光度与仅生长培养基的吸光度之间的吸光度差。 
也可以通过如下方式评价生物膜的去除：将来自处理后的生物膜的细胞悬浮在缓冲液例如磷酸缓冲盐水(PBS)中、将细胞接种在含有适宜营养的生长培养基上、计算生长在培养基上的细胞的数目。活细胞计数的降低可以通过与自从对照未处理生物膜制备的悬浮液生长的细胞的数目比较而确定。 
方法
本发明提供从表面去除生物膜的方法。去除生物膜是指从表面上减少或清除生物膜。本发明方法包括向表面上的生物膜施用一种或多种过水解酶以及上述的清除酶混合物，其中所施用的酶剂量水平和时间量足 以使生物膜减少至少大约20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98，或99％。生物膜减少百分数是指与处理前生物膜中的活细胞和/或总细胞的数目相比，生物膜中活细胞数目的减少。一些实施方案中，待处理的生物膜包含铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特氏菌、或金黄色葡萄球菌，或由其组成、或基本上由其组成。本发明方法还包括预防性防止生物膜在表面上的形成或生长。 
一些实施方案中，清除酶混合物选自：蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、磷脂酶、酯酶和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种或以上淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；至少两种淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。在一些实施方案中，一种或多种选自PROPERASE、PURAFECT、MULTIFECT NEUTRAL、FNA、和GC106的商业可得蛋白酶包括在清除酶混合物中。在一些实施方案中，商业可得的纤维素酶PURADAX包括在清除酶混合物中。在一些实施方案中，商业可得的酯酶CUTINASE包括在清除酶混合物中。在一些实施方案中，选自GC265和HEMICELL的商业可得甘露聚糖酶包括在清除酶混合物中。在一些实施方案中，商业可得的葡聚糖酶LAMIINEX BG包括在清除酶混合物中。在一些实施方案中，内切阿拉伯聚糖酶也包括在清除酶混合物中。 
一些实施方案中，清除酶混合物包含3种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和甘露聚糖酶。一个实施方案中，蛋白酶来自枯草芽孢杆菌EC3.3.2.6和嗜碱芽孢杆菌EC 3.4.2.6，葡聚糖酶来自木霉属物种EC 3.3.1.6，磷脂酶来自链霉菌属物种EC 3.1.1.4，甘露聚糖酶来自迟缓芽孢杆菌。一个实施方案中，清除酶混合物包含PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC265和LYSOMAX，或由其组成。 
一个实施方案中，过水解酶嗜来自耻垢分枝杆菌的过水解酶(SEQ ID NO：1)或其变体或同源物。 
过水解酶(一种或多种)和清除酶混合物可以同时地(同时接触生物膜)或相继地(在不同时间接触生物膜)向生物膜施用。当同时施用时，过水解酶(一种或多种)和清除酶混合物可以自包含所有这些酶的单个组合物添加，或者自分开的包含过水解酶的组合物和包含清除酶混合物的组合物添加。 
一些实施方案中，过水解酶的施用是相继的，其中首先添加过水解酶之后添加清除酶混合物。一个实施方案中，向生物膜施用过水解酶，从生物膜除去该酶，然后向生物膜施用清除酶混合物。一些实施方案中，在除去过水解酶后大约15分钟至大约60分钟，例如大约15、30、45或60分钟，添加清除酶混合物。 
一个实施方案中，清除酶混合物包含PROPERASE，PURAFECT，FNA，LAMINEX BG，GC265和LYSOMAX，或由其组成，过水解酶是来自耻垢分枝杆菌的过水解酶(SEQ ID NO：1)，相继地添加该过水解酶和清除酶混合物，并且过水解酶在清除酶混合物之前添加。 
一些实施方案中，过水解酶的底物包括在施用于生物膜的含过水解酶组合物中。例如，当向生物膜施用过水解酶时，可以包括丙二醇二乙酸酯(PGD)和过碳酸盐。 
过水解酶和清除酶混合物在生物膜上的效应可以是加性的(即，生物膜的去除程度大约为单独用过水解酶得到的去除与单独用酶混合物得到的去除的和)或协同的(即，生物膜去除程度大于单独用过水解酶得到的去除与单独用酶混合物得到的去除的和)。 
一些实施方案中，清除酶混合物含有按重量计大约1％至大约6％总酶。一些实施方案中，过水解酶以按重量计大约0.01％至大约0.0001 ％的浓度使用。 
试剂盒
本发明还提供试剂盒。试剂盒包含足以用于本文所述生物膜处理方法中的量的过水解酶和清除酶混合物。一个实施方案中，过水解酶和清除酶混合物在分开的容器中。另一实施方案中，过水解酶和清除酶混合物在相同的容器中。清除酶混合物可以含有上述任何酶组合。过水解酶可以包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或如上所述其变体或同源物，或由SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或其变体或同源物组成，或基本上由SEQID NO：1所示氨基酸序列或其变体或同源物组成。试剂盒中提供的酶可以以固态形式或液体形式供给。试剂盒还可以包括缓冲剂、底物、或对于酶活性和/或稳定性适宜的其它成分。例如，试剂盒可以包含过水解酶活性的底物，例如丙二醇二乙酸酯(PGD)和过碳酸盐。试剂盒可以包括用于本文所述生物膜处理方法的说明书。 
提供适宜的包装。本文中，“包装”是指通常用于一个系统的、能够在固定边界内容纳本文所述试剂盒的一个或多个组分(例如酶、缓冲剂、底物)的固体基质或材料。此类材料包括玻璃和塑料(例如，聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸的、塑料的和塑料-箔层压的袋子等等。如果使用电子束辐射(e-beam)灭菌技术，该包装应具有足够低的密度以允许内容物灭菌。 
说明书可以以印刷物的形式或以电子介质如软盘、CD或DVD的形式、或以可获得该说明书的网址的形式提供。 
以下实施例旨在举例说明而非限制本发明。 实施例 实施例1.筛选用于去除铜绿假单胞菌生物膜的酶混合物 
一般实验设置
基于设计的酶研究矩阵，使用高通量方法筛选了大量酶混合 物。使用PBS和乙酸缓冲液制备该溶液(Tris缓冲液：pH 7.0或8.5以及乙酸缓冲液：pH 5.0)。根据酶的pH和温度规格，制备了各种酶混合物组合。含有所有375种不同组合的表包括在附表A中。使用96孔方法筛选该375种不同酶组合，每一组合进行4次重复。该分析允许在96孔微量滴定板的孔中形成生物膜，所述板可以用于提供多达96个不同测试样品。 
细菌接种物培养物(铜绿假单胞菌，PO1，形成生物膜)生长在胰胨豆胨培养液(TSB)中于摇瓶中21℃过夜。然后将20ml该培养液加入另一摇瓶中的大约180ml新鲜胰胨豆胨培养液中。然后使用96针复制器，向96孔板的每孔加入200μl该稀释的接种物。每8-10小时，吸出营养物、浮游生物细胞和培养基，替换为新鲜TSB培养基。生物膜在21℃在孔中生长24小时。 
生物膜形成后，从96孔板孔中除去培养基，将各种酶和对照处理溶液转移至该板的孔中。允许生物膜浸泡给定时间(90分钟用于本研究)。然后用去离子水清洗孔两次，以从该系统中去除任何剩余的处理溶液和悬浮的细胞。然后用结晶紫染色生物膜10分钟。每孔各清洗4次以从该系统中去除任何多余的染料，然后用300μl乙醇进行洗脱。该洗脱步骤提高分析过程中对染料的检测。然后立即用微量滴定板读数器读板(J.Microbiological Methods(2003)54：269-276)。所有处理均至少一式四份地运行。在筛选条件下，漂白剂对照(bleach control)在pH 7.0具有75％降低、在pH 5.0具有75％降低，且在pH 8具有93％降低。 
酸性pH条件下的生物膜去除
筛选在酸性条件(pH 5)下有效催化水解反应的特定酶，例如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和其它糖酶，去除生物膜的效力。例如，本研究使用GC106酸性蛋白酶组合在酸性条件下具有催化效力的脂肪酶、纤维素酶和其它糖酶。从本研究筛选出的17种酶组合达到了69％-88％的生物膜去除。 
中性pH条件下的生物膜去除
选择在中性条件(pH 7)下有效催化水解反应的特定酶，例如蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和糖酶，筛选它们去除生物膜的效力。例如，本研究使用中性蛋白酶组合在中性条件下具有催化效力的脂肪酶、纤维素酶和其它糖酶。从本研究筛选出的5种酶组合达到了71％-84％的生物膜去除。 
碱性pH条件下的生物膜去除
选择在碱性条件(pH 8.4)下有效催化水解反应的特定酶，例如碱性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和其它糖酶，筛选它们去除生物膜的效力。例如，本研究使用丝氨酸蛋白酶，例如，FNA、PURAFECT和PROPERASE，组合在碱性条件下具有催化效力的脂肪酶、纤维素酶和其它糖酶。从本研究筛选出的11种酶组合达到了70％-80％的生物膜去除。 
数据的统计学分析
分析数据的统计学显著性。方差分析确定了下表1所示酶混合物与对照显著不同。族误差率(family-wise error rate)设在0.05；即，95％置信区间为在一组143个检测结果中无假阳性结果。用于统计学分析的该方法的细节可以见于 http://core.ecu.edu/psyc/wuenschk/docs30/multcomp.doc，该概念充分举例说明于 http://www.brettscaife.net/statistics/introstat/08multiple/lecture.html。 
结果
有效去除至少40％生物膜的酶混合物列在表1中，其中按降序排列各不同酶组。 表1各种酶组合的生物膜去除 
  酶组合   去除百分数   条件
  漂白剂对照   93   碱性
  Pep 3，Cel 2，Pal 2   84   碱性
  Pep 3，Cel 2，Car 1，Pal 2   82   碱性
  Pep 3，Cel 2，Car 1，Pal 1   80   碱性
  Pep 1，2，4，Cel 2，Car 1，Pal 1   80   碱性
  Pep 1，2，4，Car 1，Pal 1，Pal 2   78   碱性
  Pep 1，2，4，Cel 2，Car 1   77   碱性
  Pep 2，4，Cel1，Cel 2，Car 1，Pal1   76   碱性
  Pep 4，Cel 1，Pal 1，Pal 2   75   碱性
  Pep 2，4，Cel 2，Pal 1   75   碱性
  Pep 1，4，Cel 2，Car 1，Pal 1   74   碱性
  漂白剂对照   75   中性
  Pep 1，2，4，Cel 1Cel 2，Pal 1   72   中性
  Pep 1，2，4，Cel 1，Car 1，Pal 1   72   中性
  Pep 1，2，4，Cel 2，Pal 1，Pal 2   72   中性
  Pep 3，Cel 1，Cel 2，Pal 1，Pal 2   72   中性
  Pep 1，4，Cel 2，Pal 1，Pal 2   70   中性
  漂白剂对照   75   酸性
  Car 2&7，Cel 2   88   酸性
  Car 2&4，Cel 2   83   酸性
  Car 2&7   81   酸性
  Car 2&7，Pep 5   81   酸性
  Car 2，Pep 5   81   酸性
  Car 2&6   78   酸性
  Car 2&4，Pep5   78   酸性
  Car 2&7，Cel 2，Pep 5   77   酸性
  Car 2&5，Pep 5   77   酸性
 
 Car 2&4，Cel 2，Pep 5   77   酸性
 Car 7，Cel 2   75   酸性
 Car 2&4   75   酸性
 Car 6，Cel 2   74   酸性
 Car 2，Cel 2，Pep 5   72   酸性
 Car 7，Cel 2，Pep 5   72   酸性
 Car 2&6，Cel 2   69   酸性
 Car 2&5，Cel 2，Pep 5   69   酸性
表2对表1所示混合物中的酶的解释
  代码   酶名称   酶类型
  CAR1   GC265   甘露聚糖酶
  CAR2   SPEZYME FRED-L   α淀粉酶
  CAR4   ARIS SUMIZYME   1，5-αL阿拉伯聚糖酶
  CAR5   ACH SUMIZYME   β甘露聚糖酶
  CAR6   BIOCON M1   淀粉酶混合物
  CAR7   CUCONC SUMIZYME   淀粉酶混合物
  CEL1   PURADAX   纤维素酶
  CEL2   LAMINEX BG   葡聚糖酶
  PAL1   LYSOMAX   磷脂酶
  PAL2   CUTINASE   酯酶
  PEP1   PROPERASE   蛋白酶
  PEP2   PURAFECT   蛋白酶
  PEP3   MULTIFE CT NEUTRAL   蛋白酶
  PEP4   FNA   蛋白酶
  PEP5   GC106   蛋白酶
由该高通量方法提供的数据用于筛选大数量的混合物。接着进行候选混合物的进一步研究，以验证其对生物膜(包括铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌的生物膜，以及饮用水聚生体生物膜(drinking water consortium biofilms))的效力，见以下实施例的描述。 实施例2：在CDC生物膜反应器中评价表1的酶混合物 
实验方法
使用实验室模型系统CDC生物膜反应器(CBR 90模型，Biosurface Technologies Corporation，Bozeman，MT)，评价表1的酶混合物的生物膜去除。该系统由Centers for Disease Control开发，已经用于研究过由多种细菌物种形成的生物膜。CDC生物膜反应器由一个1升的罐子组成，盖上悬8个聚丙烯取样管支架(coupon holder)。每个取样管支架可以容纳3根0.5英寸直径的样品取样管。对于此处报告的实验，样品取样管由聚苯乙烯制成，以便与使用聚苯乙烯微量滴定板进行的高通量筛选试验相一致。两个CDC生物膜反应器平行地运行，提供每实验总共48根样品取样管。液体生长培养基通过罐顶进入，并通过侧臂排放口排出。混合桨叶加上磁力搅拌棒提供流体混合和表面剪切。 
铜绿假单胞菌生物膜
CDC生物膜反应器罐具有大约400ml工作体积，包含10％浓度的胰胨豆胨液体培养基，接种铜绿假单胞菌，以分批模式(无注入的培养基)37℃运行6小时。建立该分批培养物后，以600ml/hr速率提供再42小时的培养基流，以在聚苯乙烯样品取样管上建立铜绿假单胞菌生物膜。在生物膜生长期结束时，从两个反应器之每一个取出6根对照取样管，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗以去除未附着的细菌。然后使用下述结晶紫染色法，分析来自各反应器的三根取样管的生物膜。来自每个反应器的剩余3根对照取样管在PBS中超声，系列稀释，接种在胰胨豆胨琼脂上以计算生物膜中可培养的细菌的数目。 
将剩余30根测试取样管和6根对照取样管转移至12孔组织培养板，用选择的高效酶混合物(以1％wt总酶的酶剂量使用)在缓冲液中45 ℃处理90分钟。以用于制备酶混合物的相同缓冲液处理6根对照取样管。在处理之后，用PBS清洗取样管3次，并使用结晶紫染色法分析生物膜。该方法包括：将取样管浸没在结晶紫溶液(0.31％w/v)中10分钟，在PBS中清洗取样管3次以去除未结合的染料。然后使用95％乙醇从生物膜提取结合的染料，并在540nm读取该结晶紫/乙醇溶液的吸光度。根据[(1-剩余生物膜百分数)x100]计算假单胞菌生物膜的去除百分数。剩余生物膜百分数按如下方式计算：从酶处理后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培养基+酶溶液的吸光度，除以未处理的对照生物膜的吸光度与仅生长培养基的吸光度之间的吸光度差。生物膜平均厚度为0.2mm。 
使用在CDC-BR中生长的生物膜评价的生物膜去除百分数稍低于之前使用高通量筛选方法(HTA)确定的生物膜去除百分数，见下表3。这可能是因为CDC-BR中生长的生物膜性质上更顽固。与用于HTA的96孔微量滴定板法相比，CDC-BR产生更高的剪切环境，这可能导致更难于去除的生物膜。然而，使用一些酶组合观察到多达77％的生物膜去除。在HTA试验中组合“Pep 1，2，4，Cel 2，Car 1，Pal 1”排名第9，实现80％去除，但对CDC-BR生物膜具有比任何其它组合都好的表现，实现77％去除。针对在碱性缓冲液(50mM Bis-Tris，pH 8.5)中制备的酶混合物，观察到最高的生物膜去除百分数。表3使用在CDC生物膜反应器中生长的铜绿假单胞菌生物膜进行的生物膜去除试验的结果 
  酶组合   HTA％  去除＊   CDC-BR％  去除   CDC-BR St.  Dev.  CDC-BRn
  漂白剂对照   75-93   75-93    
  Pep 3，Cel 2，Pal 2   84   51   15   4
  Pep 3，Cel 2，Car 1，Pal 2   82   61   19   4
  Pep 3，Cel 2，Car 1，Pal 1   80   51   17   4
  Pep 1，2，4，Cel 2，Car 1，Pal 1   80   77   5   3
  Pep 1，2，4，Car 1，Pal 1，Pal 2   78   73   13   3
 
  酶组合  Pep 1，2，4，Cel 2，Car 1   HTA％  去除＊  77   CDC-BR％  去除  75   CDC-BR St.  Dev.  7   CDC-BRn   3
  Pep 2，4，Cel 1，Cel 2，Car 1，Pal  1   76   58   13   3
  Pep 3，Cel 2，Car 1   76   51   26   3
  Pep 4，Cel 1，Pal 1，Pal 2   75   66   4   3
  Pep 2，4，Cel 2，Pal 1   75   63   8   3
  Pep 1，4，Cel 2，Car 1，Pal 1   74   59   23   3
  Pep 1，2，4，Cel 1，Car 1，Pal 1   72   74   9   3
  Pep 1，2，4，Cel 2，Pal 1，Pal 2   72   58   28   3
  Pep 3，Cel 1，Cel 2，Pal 1，Pal 2   71   60   9   4
  Car2&4，Cel 2   83   67   5   3
  Car2&7   81   51   11   2
  Car2&7，Pep 5   81   37   25   3
  Car 2，Pep 5   81   35   32   2
  Car2&6   78   15   20   2
  Car 2&4，Pep5   78   28   4   2
  Car 2&7，Cel 2，Pep 5   77   35   n/a   1
  Car2&5，Pep 5   77   31   n/a   1
  Car 2&4，Cel 2，Pep 5   77   24   n/a   1
  Car7.Cel2   75   36   33   3
  Car2&4   75   50   12   3
  Car 6，Cel 2   74   26   4   2
  Car2，Cel2，Pep 5   72   9   7   2
  Car 7，Cel 2，Pep 5   72   54   18   3
使用具有铜绿假单胞菌的CDC生物膜反应器系统测试30种酶混合物，结果显示，20种酶混合物具有大于40％的生物膜去除，19种混合物具有大于50％的生物膜去除百分数，10种混合物具有大于60％的生物膜去除百分数，4种混合物具有70％以上的生物膜去除。根据基于HTP和CDC反应器的铜绿假单胞菌生物膜的生物膜去除分析，发现对于假单胞菌生物膜去除最有效的大多数酶混合物在碱性至中性条件中。在酸性条件下，发现的性能最佳混合物是Car2+Car7+Cel2。Cel2出现在所测试的大多数有效去除假单胞菌生物膜的酶混合物中。
实施例3
基于在假单胞菌上的CDC生物膜反应器数据以及在牙齿生物膜上的单独HTP研究(4个物种模型)，测试了下列酶混合物，评价对三种其它主要的商业相关生物膜的效力。鉴于对可用于清除的时间和节约剂量的实际考虑，清除酶混合物与生物膜取样器的接触时间减少至40分钟，酶混合物中所有酶组分的最终组合酶浓度被限制在总共1％。例如，PEP5+CAR2+CEL3酶混合物含有0.33+0.33+0.34％的各酶，形成1％的用于测试的最终酶混合物剂量。 
试验在以下所列3种pH进行，使用了下列6种酶混合物。试验在李斯特氏菌、葡萄球菌和饮用水生物膜上进行。结果提供在实施例4-6。pH 5.51.PEP5+CAR2+CEL32.PEP5+CAR2+CEL2pH 7.03.PEP6+PAL2+CEL34.PEP3+PAL2+CEL2pH 8.55.PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL16.PEP4+CEL1+PAL1+PAL2 
在轻度碱性条件下，对于所有类型的生物膜去除最有效的酶混合物是FAN、Purafect L、Properase L、Laminex BG、GC265和Lysomax的组合。对于中性至酸性pH条件，最有效的酶混合物包括MultifectNeutral、Laminex BG和Cutinase酶。 
实施例4.单核细胞增生李斯特氏菌生物膜
带不锈钢取样管的CDC生物膜反应器罐具有大约400ml工作体积，含有10％浓度的脑心浸液(BHI)培养基，接种4ml在10％BHI中37℃过夜培养的单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19112)。反应器以分批模式运行24小时，之后接着24小时以7ml/min连续补料BHI培养基流。48小时(24分批+24连续)后，终止和拆卸反应器。 
使用无菌钳子从把手(wand)上取下所有不锈钢取样管，尽可能少地接触取样管的前面和背面，将取样管放在无菌12孔板中用于处理。 每反应器总共24根取样管可用，每种酶混合物组合分别处理3根取样管(6个组合，组合的所有酶组分的总酶混合浓度为1％，40分钟，45℃)。三根取样管未处理，用作未处理对照。自处理中取出所有处理后的取样管，在PBS中清洗3次，放在12孔板的75％结晶紫溶液中10分钟。染色后，PBS中清洗取样管3次，放在5.0ml 95％乙醇中置于摇床上室温5分钟以洗脱结晶紫。然后将洗脱的溶液吸入比色杯，在分光光度计上在540nm读数。根据[(1-剩余生物膜百分数)x100]计算李斯特氏菌生物膜的去除百分数。剩余生物膜百分数按如下方式计算：从酶处理后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培养基+酶溶液的吸光度，除以未处理的对照生物膜的吸光度与仅生长培养基的吸光度之间的吸光度差。表4在CDC反应器中酶混合物对李斯特氏菌生物膜的去除 
  酶组合   CDC-BR  ％去除   CDC-BR  St.Dev.   CDC-  BR n
  漂白剂对照(碱性)   93    
  漂白剂对照(中性)   75    
  漂白剂对照(酸性)   75    
  PEP5+CAR2+CEL3   39   8   3
  PEP5+CAR2+CEL2   30   35   3
  PEP3+PAL2+CEL2   40   2   3
 
  PEP6+PAL2+CEL3   41   10   3
  PEP4+CEL1+PAL1+PAL2   51   21   3
  PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1   56   13   3
实施例5：金黄色葡萄球菌生物膜
带聚氨基甲酸酯取样管的CDC生物膜反应器罐具有大约400ml工作体积，含有10％胰胨豆胨液体培养基(TSB)，接种4ml在10％TBS培养基中37℃过夜培养的金黄色葡萄球菌(SRWC-10943)。CDC反应器以分批模式运行24小时，之后接着24小时以7ml/min连续补料TBS培养基流。48小时(24分批+24连续)后，终止和拆卸反应器。 
使用无菌钳子从把手(wand)上取下所有聚氨基甲酸酯取样管，尽可能少地接触取样管的前面和背面，将取样管放在无菌12孔板中用于处理。 
每反应器总共24根取样管可用，每种酶混合物组合分别处理3根取样管(6个组合，组合的所有酶组分的总酶混合浓度为1％，40分钟，45℃)。三根取样管未处理，用作未处理对照。自处理中取出所有处理后的取样管，在PBS中清洗3次，放在12孔板的75％结晶紫溶液中10分钟。染色后，PBS中清洗取样管3次，放在5.0ml 95％乙醇中置于摇床上室温5分钟以洗脱结晶紫。然后将洗脱的溶液吸入比色杯，在分光光度计上在540nm读数。根据[(1-剩余生物膜百分数)x100]计算葡萄球菌生物膜的去除百分数。剩余生物膜百分数按如下方式计算：从酶处理后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培养基+酶溶液的吸光度，除以未处理的对照生物膜的吸光度与仅生长培养基的吸光度之间的吸光度差。 表5在CDC反应器中酶混合物对金黄色葡萄球菌生物膜的去除 
  酶组合   CDC-BR  ％去除   CDC-BR  St.Dev.   CDC-BR  n
  漂白剂对照(碱性，中性，酸性)   93，75，75    
  PEP5+CAR2+CEL3   25   8   3
  PEP5+CAR2+CEL2   30   10   3
  PEP3+PAL2+CEL2   36   8   3
  PEP6+PAL2+CEL3   32   19   3
  PEP4+CEL1+PAL1+PAL2   28   18   3
  PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1   41   8   3
实施例6.饮用水聚生体生物膜
使用以下成分预备具有19L BAC/GAC饮用水(含低CFU的混合饮用水聚生体)和1L碳修饰溶液的20L无菌大玻璃瓶(carboy)以获得额外的碳浓度：L-谷氨酸.......0.0047g/LL-天冬氨酸.....0.0053g/LL-丝氨酸...........0.0055g/LL-丙氨酸..........0.0047g/LD+葡萄糖.........0.0048g/LD+半乳糖.......0.0048g/LD-阿拉伯糖.......0.0048g/L 
将无菌CDC反应器放在层流净化罩中，装入BAC/GAC水到出口。37℃温箱中，进行所有到进口和出口的管道连接，将CDC反应器放在搅拌板上。分批模式运行反应器24小时，之后接着24小时为7ml/min的连续的碳增补BAC/GAC水流。在48小时(24分批+24连续)结束时，关闭流入流，将培养基从反应器倒出至废料容器，并将反应器放在层流净化 罩中。 
使用无菌钳子从把手(wand)上取下所有取样管。然后将含有饮用水聚生体生物膜的PVC取样管放在无菌12孔板中用于处理。 
每反应器总共24根取样管可用，每种酶混合物组合分别处理3根取样管(6个组合，1％总浓度，40分钟，45℃)。三根取样管未处理，用作未处理对照。自处理中取出所有处理后的取样管，在PBS中清洗3次，放在12孔板的75％结晶紫溶液中10分钟。染色后，PBS中清洗取样管3次，放在5.0ml 95％乙醇中置于摇床上室温5分钟以洗脱结晶紫。然后将洗脱的溶液吸入比色杯，在分光光度计上在540nm读数。根据[(1-剩余生物膜百分数)x100]计算生物膜的去除百分数。剩余生物膜百分数按如下方式计算：从酶处理后的生物膜提取溶液的吸光度中扣除培养基+酶溶液的吸光度，除以未处理的对照生物膜的吸光度与仅生长培养基的吸光度之间的吸光度差。表6在CDC反应器中酶混合物对饮用水聚生体生物膜的去除 
  酶组合   CDC-BR  ％去除   CDC-BR  St.Dev.   CDC-BR n
  漂白剂对照(碱性，中性，酸性)   93，75，75    
  PEP5+CAR2+CEL3   7   29   4
  PEP5+CAR2+CEL2   12   18   4
  PEP3+PAL2+CEL2   47   22   4
  PEP6+PAL2+CEL3   43   16   4
  PEP4+CEL1+PAL1+PAL2   53   8   4
  PEP1+PEP2+PEP4+CEL2+CAR1+PAL1   59   8   4
实施例7.用酶化合物和过水解酶去除生物膜 
方法
无菌条件下将加有4.0ml一种以下接种物的适宜培养基装入 CDC生物膜反应器(http://www.imt.net/～mitbst/CDCreactor.html)：.在10％胰胨豆胨培养液(TSB)中的铜绿假单胞菌过夜培养物。用于该系列的取样管是聚苯乙烯的。.在10％脑心浸液(BHT)中的单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19112)过夜培养物。用于该系列的取样管是不锈钢的。.在具有碳修饰的水中的饮用水聚生体。用于该系列的取样管是聚乙烯氯(PVC)的。 
对于假单胞菌和李斯特氏菌培养物，反应器在37℃以分批模式培养24小时。在T＝24hr，接下来的24小时开始以7ml/min的连续流。在T＝48hr(24hr分批+24hr连续)，检测取样管。 
以分批模式在实验台上室温生长饮用水生物膜48小时，之后为24小时的连续流。在T＝72hr(48hr分批+24hr连续)，检测饮用水取样管。 
酶处理
将取样管放在无菌12孔板中进行酶处理。实施如下处理：.过水解酶，之后PEP1、PEP2、PEP4、CEL2、CAR1和PAL1的混合物(“清除酶混合物”).清除酶化合物，之后过水解酶.单独过水解酶 
用以上每种酶处理方式或用无菌磷酸缓冲盐水(PBS)(用作对照)分别处理6根取样管。处理时间为45℃90分钟(45分钟清除酶化合物和45分钟过水解酶)，或者当单独使用过水解酶时45℃45分钟。在处理时间结束时，从处理溶液中取出取样管，在PBS中清洗3次。 
清除酶溶液：50mM Tris，pH 8.5中PEP1、PEP2、PEP4、CEL2、CAR1和PAL1，各酶的终酶浓度为1％。 
过水解酶溶液，终浓度：100mM丙二醇二乙酸酯(PGD)、100mM过碳酸、4ppm SEQ ID NO：1的S54V变体、400mM KH2PO4，pH 7.1。 
过水解酶的贮存溶液；125mM PGD-2ml/100ml 400mMKH2PO4(800μl每1ml反应混合物)；10.5mg/ml过碳酸(10.5mg每1ml反应混合物)；20ppm过水解酶(200μl每1ml反应混合物)。 
过水解酶处理程序：称重过碳酸盐并与PGD/KH2PO4缓冲液混合以溶解。(备选地，可以使用pH 6-12的另外适宜缓冲剂，或不加入缓冲剂，以过碳酸盐充当缓冲剂。)加入过水解酶并再次混合溶液。室温放置溶液20分钟，然后立即使用。 
过乙酸测试溶液：50ml 125mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.0，500μl100mM在水中的2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，CAS#30931-67-0(ABTS)，100μl 25mM在水中的KI。 
过乙酸测定程序：25μl过水解酶溶液与225μl水混合。该溶液再次稀释(25μl+25μl水)。25μl终溶液与75μl水混合，随后加入比色杯中的900μl过乙酸测定溶液中。室温孵育溶液3分钟。读取420nm吸光度。过乙酸浓度计算为：A420x 0.242＝[过乙酸]mM。 
对于第一铜绿假单胞菌PA01轮，测试方案如下： 
  处理   结晶紫  (生物膜)  板计数 (Log减少)   取样管  总数
  PBS对照   3取样管   3取样管   6
  过水解酶，之后清除酶混合物   3取样管   3取样管   6
  清除酶，之后过水解酶   3取样管   3取样管   6
  过水解酶单独   3取样管   3取样管   6
      总计   24
随后的试验包括用单独清除酶化合物进行的处理，根据如下测试方案进行： 
  处理   结晶紫  (生物膜)  板计数 (Log减少)   取样管  总数
  PBS对照   2取样管   2取样管   4
  过水解酶，之后清除酶混合物   3取样管   3取样管   6
  清除酶，之后过水解酶   3取样管   3取样管   6
  过水解酶单独   2取样管   2取样管   4
  清除酶混合物单独   2取样管   2取样管   4
      总计   24
结晶紫试验确定去除效力
将来自每个处理的取样管放入12孔板的75％结晶紫溶液中10分钟。染色后，PBS中清洗取样管3次，然后放入5.0ml 95％乙醇中，置于摇床上室温5分钟以洗脱结晶紫。然后将洗脱的溶液吸入比色杯，在分光光度计中540nm读取吸光度。 
板计数确定log减少
将来自每个处理的取样管放入含有10ml无菌PBS的无菌锥形瓶。依照在Medical Biofilm Laboratory，Center for Biofilm Engineering atMontana State University，Bozeman，Montana(MBL)建立的标准化程序，涡旋瓶子1分钟，超声2分钟，涡旋30秒。细菌悬浮液进行系列稀释，之后铺板以确定活细胞计数和由处理导致的log减少。对于活细胞计数，将铜绿假单胞菌铺在100％胰胨豆胨琼脂(TSA)上，将单核细胞增生李斯特氏菌铺在1005BHI琼脂上，以及将饮用水聚生体铺在100％R2A琼脂上。 结果表7在CDC反应器中通过酶混合物和过水解酶对铜绿假单胞菌生物膜的去除 
  酶组合   平均％  生物膜减少  (结晶紫)＊   标准差 平均Log减少(板计数)   标准差
  过水解酶，之后清除酶   30.60   5.90   2.9   0.18
  清除酶，之后过水解酶   9.26   6.06   1.7   0.50
  过水解酶单独   29.04   4.90   3.2   0.39
  清除酶单独   25.58   6.36   未计算   未计算
＊对于表中所列头三个处理为三轮的平均值，对于第4个处理为两轮的平均值(清除酶单独)表8在CDC反应器中酶混合物和过水解酶对单核细胞增生李斯特氏菌生物膜的去除 
  酶组合   平均％生物  膜减少  (结晶紫)＊   标准差  平均Log减 少 (板计数)   标准差
  过水解酶，之后清除酶   33.24   未计算   1.8   未计算
  清除酶，之后过水解酶   25.30   未计算   0.9   未计算
  过水解酶单独   23.80   未计算   1.9   未计算
  清除酶单独   23.18   未计算   未计算   未计算
＊对于表中所列所有处理均为2轮的平均值 表9在CDC反应器中通过酶混合物和过水解酶对饮用水聚生体生物膜的去除 
  酶组合   ％生物膜减少  (结晶紫)＊   Log减少  (板计数)
  过水解酶，之后清除酶   28.4   2.0
  清除酶，之后过水解酶   28.5   1.0
  过水解酶单独   29.9   2.0
  清除酶单独   21.7   1.4
＊基于一轮的数据 实施例8：用酶混合物和有和无底物的过水解酶去除铜绿假单胞菌生物膜 
方法
向安装有24个聚苯乙烯取样管的CDC生物膜反应器中装入大约450ml 10％TSB加4ml铜绿假单胞菌24小时培养物。在连续搅拌下反应器以分批模式培养24小时。在T＝24hr，开始7ml/min的连续流，持续接下来的24小时。在T＝48hr(24hr分批+24hr连续)，将取样管放入无菌12孔板中进行酶处理。 
酶处理
分别用：·无底物的过水解酶(SEQ ID NO：1的S54V变体；4ppm)+清除酶混合物(每种酶各1％)·无底物的过水解酶(4ppm)·有底物的过水解酶(4ppm)·PBS，7.2(对照) 
在45℃的处理温度，处理时间总共90分钟。处理结束时，在 PBS中清洗取样管3次。 
酶混合物和混合方案
无底物的过水解酶+清除酶混合物：PEP1，PEP2，CEL2，CAR1和PAL1在400mM KH2PO4缓冲液pH 7.1中各酶的总最终酶溶度为1％，加上4ppm终浓度的过水解酶。 
无底物的过水解酶：400mM KH2PO4缓冲液，4ppm过水解酶 
有底物的过水解酶：100mM PGD，100mM过碳酸盐，4ppm过水解酶，400mM KH2PO4缓冲液，pH 7.1。称重过碳酸盐，与PGD/KH2PO4缓冲液混合以溶解。加入过水解酶，再次混合溶液。在室温放置溶液20分钟，之后立即使用。 
PBS：混合NaCl 8g/l，KCl 0.2g/L，Na2HPO41.15g/L和KH2PO40.2g/L。调整pH至7.2，溶液高压灭菌。 
测试方案
测试方案如下： 
  处理   结晶紫  (生物膜)  板计数 (Log减少)   取样管  总数
  PBS对照   3取样管   3取样管   6
  无底物的过水解酶，加清除酶混合  物   3取样管   3取样管   6
  无底物的过水解酶   3取样管   3取样管   6
  有底物的过水解酶   3取样管   3取样管   6
      总计   24
结晶紫试验确定去除效力
将来自每个处理的取样管放入12孔板的75％结晶紫溶液中10分钟。染色后，PBS中清洗取样管3次，然后放入5.0ml 95％乙醇中，置 于摇床上室温5分钟以洗脱结晶紫。然后将洗脱的溶液吸入比色杯，在分光光度计中540nm读取吸光度。 
板计数确定log减少
来自每个处理的3个取样管放入含有10ml无菌PBS的无菌锥形瓶。依照在MBL建立的标准化程序，涡旋瓶子1分钟，超声2分钟，涡旋30秒。细菌悬浮液进行系列稀释，之后铺在100％TSA板上以确定活细胞计数和由处理导致的log减少。结果表10用酶混合物和有或无底物的过水解酶对铜绿假单胞菌生物膜的去除 
    吸光度  (结晶紫)   ％生物膜  减少   Log cfu/cm2  (板计数)   Log减少
 第1轮        
 PBS对照   0.746     8.0  
 过水解酶-底物   0.637   14.5   6.7   1.3
 过水解酶+底物   0.588   21.1   5.0   3.1
 过水解酶+底物，以及清除酶   0.504   32.4   3.7   4.4
 第2轮        
 PBS对照   0.708     7.1  
 过水解酶-底物   0.582   17.8   5.6   1.6
 过水解酶+底物   0.464   34.4   3.8   3.4
 过水解酶+底物，以及清除酶   0.483   31.8   3.9   3.2
 第3轮        
 PBS对照   0.783     8.4  
 过水解酶-底物   0.492   37.1   6.0   2.4
 过水解酶+底物   0.382   51.2   4.2   4.2
 过水解酶+底物，以及清除酶   0.220   71.8   2.5   5.8
[0138] 尽管为了清楚理解的目的前述发明已经以某种详细程度通过举例说明和实施例进行了描述，但本领域技术人员明了可以实施某些变化和改变而不偏离本发明的精神和范围。因此，说明书不应理解为限制本发明的范围。 
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均完整地为了所有目的而特此引入作为参考，其程度等同于具体地单独地指出每一出版物、专利或专利申请并入作为参考。 

Claims (19)

1.从表面去除生物膜的方法，所述方法包括向所述生物膜施用清除酶混合物和过水解酶，其中施用时间足以使所述生物膜减少至少25％，
其中所述清除酶混合物选自：蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少两种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；和至少两种淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。
2.权利要求1的方法，其中所述过水解酶和所述清除酶混合物同时施用于生物膜。
3.权利要求1的方法，其中所述过水解酶和所述清除酶混合物相继地施用于生物膜。
4.权利要求3的方法，其中所述过水解酶在所述清除酶混合物施用前施用。
5.权利要求1的方法，其中所述过水解酶和所述清除酶混合物协同地起作用以从表面去除生物膜。
6.权利要求1的方法，其中生物膜包含铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特氏菌、或金黄色葡萄球菌。
7.权利要求1的方法，其中所述清除酶混合物由三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶组成。
8.权利要求1的方法，其中所述清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC265、和LYSOMAX组成。
9.权利要求1的方法，其中所述过水解酶包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。
10.用于从表面去除生物膜的组合物，所述组合物包含清除酶混合物和过水解酶，
其中所述清除酶混合物选自：蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少两种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；和至少两种淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。
11.权利要求10的组合物，其中所述清除酶混合物由三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶组成。
12.权利要求10的组合物，其中所述清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC265、和LYSOMAX组成。
13.权利要求10的组合物，其中所述过水解酶包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列。
14.用于从表面去除生物膜的试剂盒，所述试剂盒包含清除酶混合物和过水解酶，
其中所述清除酶混合物选自：蛋白酶、葡聚糖酶、和酯酶；蛋白酶、葡聚糖酶、酯酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；两种蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、葡聚糖酶、和甘露聚糖酶；蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；两种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和葡聚糖酶；三种蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶；三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶和酯酶；蛋白酶、纤维素酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和酯酶；至少两种淀粉酶和葡聚糖酶；至少三种淀粉酶；和至少两种淀粉酶、葡聚糖酶、和蛋白酶。
15.权利要求14的试剂盒，其中所述过水解酶和所述清除酶混合物在分开的容器中。
16.权利要求14的试剂盒，其中所述过水解酶和所述清除酶混合物在相同容器中。
17.权利要求14的试剂盒，其中所述清除酶混合物由三种蛋白酶、葡聚糖酶、磷脂酶、和甘露聚糖酶组成。
18.权利要求14的试剂盒，其中所述清除酶混合物由PROPERASE、PURAFECT、FNA、LAMINEX BG、GC265、和LYSOMAX组成。
19.权利要求14的试剂盒，其中所述过水解酶包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列。
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