CN101903399B - 梭菌毒素netb - Google Patents

梭菌毒素netb Download PDF

Info

Publication number
CN101903399B
CN101903399B CN200880019023.XA CN200880019023A CN101903399B CN 101903399 B CN101903399 B CN 101903399B CN 200880019023 A CN200880019023 A CN 200880019023A CN 101903399 B CN101903399 B CN 101903399B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
present
polynucleotide
cell
netb
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200880019023.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN101903399A (zh
Inventor
罗伯特·约翰·穆尔
朱利安·艾安·鲁德
安东尼·莱斯利·凯伯恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Australian Poultry CRC Pty Ltd
Original Assignee
Australian Poultry CRC Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40093085&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN101903399(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Australian Poultry CRC Pty Ltd filed Critical Australian Poultry CRC Pty Ltd
Publication of CN101903399A publication Critical patent/CN101903399A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101903399B publication Critical patent/CN101903399B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/517—Plant cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于源于产气荚膜梭菌毒素的多肽。本发明进一步涉及含有这种毒素的免疫原组合物以及对动物如家鸡进行接种的方法，使得它们不易于患上梭菌病。本发明还公开了用以检测动物是否被暴露于毒素、编码毒素的多核苷酸以及表达毒素活性降低或毒性更少形式的减毒细菌的方法。

Description

梭菌毒素NETB
技术领域
本发明涉及一种新型毒素。本发明进一步涉及含有这种毒素的免疫原组合物以及对动物，例如家鸡接种而使之不易于患上梭菌病的方法。
背景技术
梭状芽孢杆菌属是由革兰氏阳性厌氧产芽胞细菌构成的。这些生物的天生栖息地是人类和其它动物的环境和肠道。尽管已经识别了大约100种梭菌，但是仅仅少数已经被认知为医疗和兽医重要性的病源物(或病原体)。尽管如此，这些物种还是与严重疾病有关，包括肉毒梭菌中毒、破伤风、厌氧的蜂窝织炎、气性坏疽、菌血症、假膜性结肠炎和梭菌肠胃炎。
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是在经济上有价值的家畜禽中发现的各种梭菌病的病源物。坏疽肠炎(NE)就是由产气荚膜梭菌引起的梭菌肠道疾病的一个实例。坏疽肠炎导致在肠壁上产生坏疽病变，而导致家禽发病和死亡。这也是一种复杂的多因子病，具有部分未知的流行病学和发病机理(Kaldhusdal，1999)。细菌，产气荚膜梭菌，通常在家禽肠道中能够发现(Tschirdewahn et al.，1991)，然而，坏疽肠炎的出现是偶发性的(Cowen et al.，1987)。尽管如此，被产气荚膜梭菌污染的进食还是间接表明在家鸡中坏疽肠炎的发作(Kaldhusdal，1999)。研究也表明，健康家鸡在其肠道中所具有的产气荚膜梭菌数量相对较低，同时细菌浓度的增长能够导致坏疽肠炎病症(Craven et al.，1999)。
临床坏疽肠炎被认为在小肠中产气荚膜梭菌增殖到高数量并产生毁坏肠道的胞外毒素时才发生。主要的毒素据信涉及的是α-毒素，但是其在疾病过程中的精确作用还未完全知晓。α-毒素是一种分泌型的锌金属酶，其不但具有磷脂酶C活性，还具有神经磷脂酶(或鞘磷脂酶)活性，是涉及到人类气性坏疽发病机理中的主要毒素(Awad，et al.，1995；Songer，1997)。产气荚膜梭菌的所有五种毒素类型(A至E)承载和表达α毒素结构基因，plc。
迄今为止，还没有其它毒素被证实为坏疽肠炎中的关键毒性因子。
发明内容
本发明已经鉴别了一种新型梭菌毒素。本发明已经命名这种多肽为NetB。
因此，本发明提供了一种基本纯化的或重组多肽，其中所述多肽含有：
i)按照SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3提供的氨基酸序列，
ii)至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或
iii)i)或ii)的生物活性片段和/或抗原片段。
在一个实施方式中，该多肽具有毒素活性。
在另一实施方式中，该多肽与通过SEQ ID NO：2和/或SEQ IDNO：3编码的多肽相比具有降低的毒素活性已经。
在一个优选实施方式中，该多肽所含的氨基酸序列至少90％相同于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。
在一个实施方式中，该多肽能够从梭状芽孢杆菌属的细菌中纯化。优选该多肽能够从产气荚膜梭菌中进行纯化。
在本发明的另一实施方式中，该多肽是类毒素。
在还有的另一个优选实施方式中，该多肽是含有至少一种其它多肽序列的融合蛋白。
例如，至少一种其它多肽可以是增强本发明多肽稳定性的多肽，或者是辅助该融合蛋白纯化的多肽，或者是增强本发明多肽的免疫性能的多肽。
在还有的另一个优选实施方式中，本发明的多肽是合成多肽。
本发明进一步提供了一种分离的和/或重组的多核苷酸，包含：
i)根据SEQ ID NO：1提供的核苷酸序列，
ii)编码根据权利要求1至8任一项的多肽的核苷酸序列，
iii)至少40％相同于SEQ ID NO：1的核苷酸序列，和/或
iv)在严格条件下与i)至iii)任意之一杂交的序列或其反相互补序列。
在一个实施方式中，分离的或重组的多核苷酸含有至少40％相同于SEQ ID NO：1的核苷酸226至1194的核苷酸序列。
本发明进一步提供了一种含有本发明多核苷酸的载体。
优选地，在该载体中的多核苷酸可操作地连接于启动子。
在一个实施方式中，该载体是病毒载体或质粒载体。
本发明进一步提供了一种宿主细胞，其含有本发明的多肽、本发明的多核苷酸和/或本发明的载体。
本发明的宿主细胞可以是能够产生至少一种本发明多肽的任何细胞，并包括动物、植物、细菌、真菌(包括酵母)和节肢动物的细胞。
优选该宿主细胞是细菌。
在一个实施方式中，细菌是大肠杆菌。在更优选的实施方式中，细菌是选自CCEC22，CCEC31和CCEC59的大肠杆菌。
本发明进一步提供了用于生产根据本发明的多肽的方法，该方法包括对根据本发明的宿主细胞或编码所述多肽的本发明载体在容许表达编码该多肽的多核苷酸的条件下进行培养。
优选地，该方法进一步包括分离所述多肽。
本发明进一步提供了一种特异性地结合于本发明多肽的基本纯化的抗体，或其片段。
本发明进一步提供了一种含有本发明多肽、本发明多核苷酸、本发明载体、本发明宿主细胞和/或本发明抗体的组合物。
在一个实施方式中，该组合物是免疫原的组合物。
在一个实施方式中，该免疫原的组合物进一步含有佐剂和/或药用载体。
本发明进一步提供了含有抗原的疫苗，其中抗原含有根据本发明的多肽。
在一个实施方式中，疫苗含有佐剂和/或药用载体。
在一个实施方式中，该疫苗进一步含有一种或多种附加抗原。
本发明进一步提供了含有编码根据本发明的多肽的多核苷酸的DNA疫苗，其中一旦向受试者给药，多肽就会表达而对多肽产生免疫应答。
本发明进一步提供一种减毒细菌，其能够产生含有至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽，其中该细菌与野生型细菌相比产生降低量的多肽和/或与野生型细菌相比具有降低的毒素活性。
在一个实施方式中，减毒细菌并不表达多肽。
在另一个实施方式中，减毒细菌经过了进一步改性(或修饰)而表达异源多肽。该异源多肽可以例如是生物活性多肽或抗原。生物活性多肽的实例包括细胞因子、生长因子和酶。抗原可以例如来自细菌、真菌、寄生生物病原体(或病原物)或病毒性病原体(或病原物)。
优选地，减毒细菌属于梭状芽孢杆菌属。在最优选的实施方式中，细菌是产气荚膜梭菌。
本发明进一步提供了一种削弱表达含有至少40％相同于SEQID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的细菌毒性的方法，该方法包括突变多核苷酸序列而降低多肽的表达和/或多肽的毒素活性，由此减毒细菌与未减毒细菌相比具有降低的毒素活性。
本发明进一步提供了一种提高受试者体内免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的组合物、本发明的疫苗、本发明的宿主细胞和/或本发明的细菌。
在一个实施方式中，宿主细胞或细菌是活的(或活体)。
在另一实施方式中，该多肽、多核苷酸、组合物、载体、宿主细胞或细菌是在卵中(或卵胚中，in ovo)递送的。
本发明进一步提供了一种检测受试者是否已经暴露于表达含有至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的病原体的方法，其中该方法包括检测由该受试者获得的样品中存在或不存在这种多肽，其中这种多肽的存在是暴露于病原体的指征(或指示)。
本发明进一步提供了一种检测受试者是否已经暴露于表达含有至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的病原体的方法，其中该方法包括检测由样品中特异性地结合于根据本发明多肽的抗体存在或不存在，其中这种抗体的存在是暴露于病原体的指征(或指示)。
本发明进一步提供了一种检测受试者是否已经暴露于表达含有至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的多核苷酸的病原体的方法，其中该方法包括检测由该受试者获得的样品中多核苷酸存在或不存在，其中这种多核苷酸的存在是暴露于病原体的指征(或指示)。
检测多核苷酸存在或不存在的任何合适技术都可以使用。例如，多核苷酸的存在或不存在可以通过杂交，例如通过DNA印迹(或萨慎印迹，Southern blot)，或通过多核苷酸的扩增，例如，通过PCR进行检测。
在一个实施方式中，病原体来自梭状芽孢杆菌属。在一个优选实施方式中，病原体是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。
在本发明方法的一个实施方式中，受试者是禽类。
优选地，受试者是家禽。例如，受试者可以是家鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭子、鸵鸟或其它常见的以商业量饲养的家禽。
在最优选的实施方式中，受试者是家鸡。
本发明进一步提供了一种用于筛选调节本发明的多肽活性的激动剂或拮抗剂的方法，该方法包括将本发明的多肽与候选化合物接触，并确定所述化合物是否增加或减少本发明多肽的毒素活性。在一个实施方式中，该化合物是拮抗剂。优选该化合物是抗体。
本发明进一步提供了一种测试样品毒素活性的方法，该方法包括：
(a)将疑似含有根据权利要求1至8任一项的多肽的样品分成至少第一和第二子样品，
(b)将所述第一子样品与根据权利要求1至8任一项的多肽的拮抗剂接触，和
(c)检测第一和第二子样品是否具有毒素活性，
其中在所述第一子样品中缺乏毒素活性和在所述第二样品中存在毒素活性是至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的多肽存在的指征(或指示)。
在一个实施方式中，步骤(c)包括独立地用动物细胞在各种条件下培养所述第一和第二子样品一段时间而足以使该多肽产生细胞病理效应，并检测细胞上是否存在或不存在细胞病理效应。
在一个优选实施方式中，拮抗剂是抗体。
本发明进一步提供了一种含有根据本发明多肽的拮抗剂的食物和/或饮料。
优选地，拮抗剂是根据本发明的抗体。
本发明进一步提供了本发明的食物和/或饮料降低由表达含有至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的细菌对动物的感染和/或群集(或殖民化，colonization)的用途。
本发明进一步提供了含有编码根据本发明的多肽的外源性多核苷酸的非人基因转移生物。优选地，非人基因转移生物是植物。
本发明进一步提供了含有本发明多肽的食物和/或饮料。
优选地，当非人基因转移生物和/或食物和/或饮料口服给予受试者时，该多肽提高对细菌病原体的免疫应答。细菌病原体可以是梭状芽孢杆菌属，例如，产气荚膜梭菌。优选地，受试者是禽类，例如，家鸡、火鸡或鸭子。
正如本领域技术人员所理解的那样，本发明的非人基因转移生物和/或食物和/或饮料能够用于向受试者给予本发明的多肽，使得在受试者体内提高对该多肽的免疫应答。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种提高对本发明多肽的免疫应答的方法，该方法包括向受试者口服给予本发明的非人基因转移生物和/或本发明的食物和/或饮料。
本发明进一步提供了一种提供对雌性禽类后代被动免疫的方法，该方法包括在所述雌性禽类产下含有所述后代的卵之前向该雌性禽类给予本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的组合物、本发明的疫苗、本发明的减毒细菌、本发明的非人基因转移生物、和/或本发明的食物和/或饮料，由此为所述后代提供对表达含有至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的细菌的被动免疫。
本发明进一步提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的组合物、本发明的疫苗、本发明的宿主细胞、本发明的细菌、本发明的非人基因转移生物和/或本发明的食物和/或饮料在生产用于提高受试者体内免疫应答的医药中的用途。
本发明进一步提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的组合物、本发明的疫苗、本发明的宿主细胞、本发明的细菌、本发明的非人基因转移生物和/或本发明的食物和/或饮料作为提高受试者体内免疫应答的医药的用途。
这将是很明显的，本发明一方面的优选特征和特性适用于本发明的许多其它方面。
在整个说明书中词语“包括”，或变体如“含有”或“包含”，应该理解为是指所陈述的元件、整体或步骤的包含，或元件、整体或步骤的分组，并不排除任何其它元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的分组。
本发明此后将通过以下非限制性实施例的方式并参照附图而进行描述。
附图说明
图1.来自产气荚膜梭菌的NetB和β-毒素的ClustalW对齐；“*”是指在该列中残基或核苷酸在对齐中的所有序列中相同；“：”是指已经观察到保守替换；“.”是指观察到半保守替换。
图2.NE18-ΔnetB染色体区域的示意图。netB的突变通过采用含有在基因两侧具有约2kb的同源DNA的插入性灭活netB基因的自毁质粒进行等位交换而构建并引入到EHE-NE18中。
图3.在LMH细胞上产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液的细胞毒性测定。a.TPG培养基介质(纯的)；b.产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液(1∶16稀释)；c.产气荚膜梭菌JIR325(菌株13-非坏疽肠炎菌株)培养基上清液(1∶2稀释)；d.产气荚膜梭菌NE18-M1(plc突变体)培养基上清液(1∶16稀释)。
图4在LMH细胞上EHE-NE18培养基上清液netB阴性衍生物的细胞毒性测定。a.EHE-NE18培养基上清液(1∶16稀释)；b.NE18-缺失(或消除)的netB培养基上清液(1∶2稀释)；c.NE18-缺失的netB1+pJIR1457(穿梭质粒)培养基上清液(1∶2稀释)；d.NE18-缺失的netB1+pALK20(netB互补质粒)培养基上清液(1∶16稀释)；e.TPG培养基介质(纯净的)；f.柱纯化的重组NetB(Columnpurified recombinant NetB)(1∶8稀释)。
图5.用NetB处理的LMH细胞的乳酸脱氢酶细胞毒性测定。在上清液中释放的LDH作为细胞溶解指示剂用Cyto-Tox(Promega)试剂盒进行测定并以细胞毒性百分数给出。每次稀释按照一式三份进行而对每次稀释计算SEM。
图6.对于netB存在的NE和非NE产气荚膜梭菌菌株的PCR筛选。a.NE菌株；b.非NE菌株。
图7.在各种产气荚膜梭菌菌株(NE和非-NE)中对于蛋白存在的蛋白印迹观测(Western blot survey)。对于NetB表达的产气荚膜梭菌筛选的NE菌株和非NE菌株的免疫印迹分析。产气荚膜梭菌菌株在TPG介质中生长直至达到由SDS-PAGE分离的0.6和培养基上清液OD600nm。将经分离的蛋白转移至PDVF膜并用兔rNetB抗血清探测。Brackets指示NE菌株和非NE产气荚膜梭菌菌株。
图8用NetB接种的家鸡血清的蛋白印迹分析。Lane 1：分子量标记(InvitrogenPlus2预染色标准)；Lanes 2-14：接种的鸟#1-#13的血清。
关键序列列表
SEQ ID NO：1-编码产气荚膜梭菌NetB毒素的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2-产气荚膜梭菌NetB毒素成熟氨基酸序列。
SEQ ID NO：3-包括信号肽序列的产气荚膜梭菌NetB毒素的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4-产气荚膜梭菌β-毒素的氨基酸序列。
SEQ ID No：5至10-寡核苷酸引物。
具体实施方式
一般性技术和定义
除非另外明确指出，本文中所使用的所有技术和科学术语都应采取本领域普通技术人员所共同理解的相同意义(例如，按照微生物学，细胞培养学，分子遗传学、免疫学、免疫计量化学，蛋白质化学，和生物化学领域)。
除非另外指出，本发明中所使用的重组蛋白、细胞培养基、微生物学和免疫学技术都是标准的方法，是本领域普通技术人员众所周知的方法。这种技术在文献源的整个文献中进行了描述和解释，例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley andSons(1984)，J.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，Volumes1 and 2，IRL Press(1991)，D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995 and1996)，and F.M.Ausubel et al.，(editors)，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，including all updates until present)，Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory，(1988)，和J.E.Coligan et al.，(editors)Current Protocolsin Immunology，John Wiley & Sons(including all updates untilpresent)，并将其结合于本文中作为参考。
正如本文中所使用的，术语“受试者”是指动物，例如鸟类或哺乳动物。在一个优选实施方式中，该受试者是禽类，例如家鸡。在另一个实施方式中，该受试者是人。其它优选的实施方式包括宠物(或同伴性动物，companion animals)如猫和狗，以及家畜如马、牛、绵羊和山羊。
如本文中所使用的，术语“禽类”是指分类学分类为鸟类的生物的任何种、亚种或品种，诸如但不限于家鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦和包括鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵在内的平胸鸟。该术语包括各种已知的原鸡(或红原鸡，Gallus gallus)的品系(strain)，或家鸡，(例如，白来航(White Leghorn)、棕色来航鸡(Brown Leghorn)、横斑芦花鸡(Barred-Rock)、苏塞克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡(New Hampshire)、罗德岛红鸡(RhodeIsland)、澳洲黑鸡(Australorp)、考尼什鸡(Cornish)、米诺卡鸡(Minorca)、Amrox、加利福尼亚灰鸡(California Gray)、意大利鹧鸪色鸡(Italian Partidge-colored))、以及火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟和其它以商业规模饲养的家禽的品系。
如本文中所使用的，“毒素活性”是指多肽或肽(例如，NetB毒素)杀死动物细胞、或导致动物细胞中的细胞病理效应的能力。在某些情况下，对于多肽与NetB毒素相比具有降低的毒素活性或许是合乎需要的。毒素活性的降低优选至少50、60、70、80、90、95或99％。毒素活性方面的降低可以例如作为细胞病理效应的降低而进行测定。
如本文中所使用的，术语“细胞病理效应”或“CPE”描述了细胞结构中由于细胞毒素的活性(即，病例效应)而产生的变化。常见的细胞病理效应包括细胞破坏、细胞圆形化、合胞体(即，融合的大细胞)形成、细胞空泡化形成、和内含体的形成。CPE产生于毒素在细胞上的作用，而负面地影响细胞实施其保持存活体的所需功能的能力。在体外细胞培养系统中，当细胞与含有毒素的样品接触后，作为部分融合性单层，显示非融合性的区域时CPE是显而易见的。细胞病理效应易于被本领域技术人员辨别和区分。
如本文中所使用的，术语“类毒素”是指任何至少部分失活的毒素，但并非意指以任何方式限制产生类毒素的毒素失活的具体方式。这种失活技术包括：(i)改性(或修饰)完整毒素的化学方法，例如甲醛或戊二醛处理；(ii)物理方法如加热；(iii)改变毒性的酶方法，如将毒素切割成片段的蛋白酶；(iv)重组方法，如移除或改变毒素酶区域但保留一个或多个抗原决定基(或抗原决定部位)的毒素基因的遗传工程化。
如本文中所使用的，有关细菌的术语“野生型”是指天然存在的细菌，其产生含有至少40％相同，更优选至少90％相同于具有毒素活性的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽。
如本文中所使用的，术语“处理”“治疗”或“处治”包括给予治疗有效剂量的本发明的多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、组合物、疫苗和/或减毒细菌而足以降低或消除由表达具有毒素活性的多肽的细菌感染所导致的疾病的至少一种症状。
术语“预防”是指保护或许被暴露于细菌的受试者免于发展由于细菌感染和/或群集(或殖民化，colonization)而导致的至少一种症状，或降低被暴露于细菌的受试者体内感染和/或群集症状的严重度。
多肽/肽
术语“多肽”和“蛋白”一般可以互换使用，是指可以或不可以通过添加非氨基酸基团改性的单多肽链。应该理解到，这种多肽链可以与其它多肽或蛋白或其它分子如辅助因子相关。如本文中所使用的，术语“蛋白”和“多肽”包括本文中描述多肽的变体、突变体、生物活性片段、改性体(或修饰物)、类似物和/或衍生物。
对于“基本纯化的多肽”或“分离的多肽”，我们意指一般从脂质、核酸、其它肽、和其它与其天然状态有关的污染分子中分离出来的多肽。优选地，基本纯化的多肽至少60％游离出，更优选至少75％游离出，而更加优选至少90％游离出与之天然相关的其他组分。
在多肽的上下文中的术语“重组”是指当由细胞、或在无细胞表达系统中，以变化的量或以变化的速率产生时的多肽。在一个实施方式中，该细胞是并不会天然产生多肽的细胞。然而，该细胞可以是含有导致该多肽的产生量改变，优选提高的非内源性基因的细胞。本发明的重组多肽包括还未从转录(重组)细胞、或产生该蛋白的无细胞表达系统的其它组分中分离出的多肽，以及在随后从至少一些其它组分中纯化出的这种细胞或无细胞系统中产生的多肽。
多肽的识别％通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)采用间隔生成罚分＝5、和空格延伸罚分＝0.3进行测定。在长度上查询序列为至少15个氨基酸，而GAP分析在至少15个氨基酸的区域内比对两个序列。更优选地，查询序列在长度上为至少50个氨基酸，而GAP分析在至少50个氨基酸的区域内比对两个序列。更优选地，查询序列在长度上为至少100个氨基酸，而GAP分析在至少100个氨基酸的区域内比对两个序列。更加优选地，查询序列在长度上为至少250个氨基酸，而GAP分析在至少250个氨基酸的区域内比对两个序列。更加优选地，在其整个长度内比对这两个序列。
关于定义的多肽，应该理解到，比以上提供的识别％图更高的那些多肽将会涵盖优选的实施方式。因此，根据最低的识别％图，只要适用，优选该多肽含有的氨基酸序列为至少40％，更优选至少45％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，而甚至更优选至少99.9％相同于相关指定的SEQ ID NO。
本发明多肽的氨基酸序列突变能够通过向本发明的核酸中引入合适的核苷酸而变成本发明的核酸、或通过所需多肽的体外合成而进行制备。这种突变例如包括，该氨基酸序列中的残基的缺失(或删除)、插入或替换。缺失(或删除)、插入或替换的组合能够使之达到最终的构建，条件是，最终的肽产品具有所需要的特性。
突变(经改变的)多肽能够采用本领域已知的任何合适技术进行制备。例如，本发明的多核苷酸能够进行体外诱发突变。这种体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适载体中，将载体变换成“增变”菌株，如大肠杆菌XL-1红(Stratagene)并繁殖所转化细菌达到合适的繁殖代数。在另一实例中，本发明的多核苷酸进行按照Harayama(1998)广泛描述的DNA改组技术。这些DNA改组技术可以包括与本发明的那些(多肽)相关的毒素编码基因，如来自细菌而不是产气荚膜梭菌的那些。衍生于突变的/经改变的DNA的产品采用本文中描述的技术能够易于被筛选而确定它们是否具有毒素活性。
在设计氨基酸序列的突变体中，突变位点的定位和突变的性质将取决于待修饰的特性。突变位点能够进行个别或连续修饰，例如，通过(1)首先用保守氨基酸选项进行替换而后用更激进选项替换，这要取决于所实现的效果，(2)删除(或缺失)靶残基，或(3)在邻近于定位位点插入其他残基。
氨基酸序列删除(或缺失)一般在约1至15个残基，更优选约1至10个残基而典型地约1至5个毗邻残基的范围内。
替换突变体在移除的多肽分子中具有至少一个氨基酸残基和在其位置处插入不同的残基。对于替换突变最感兴趣的位点包括验证为活性位点的位点。其它感兴趣的位点是其中由各种菌株或物种获得的特定残基相同的位点。这些位置对于生物活性而言或许是很重要的。这些位点，尤其是落入至少三个其它同等保守位点的序列中的那些位点，优选以相对保守的方式进行替换。这种保守替换如下表1中“典型替换”标题下所示。
表1-典型替换
 原始残基 典型替换
 Ala(A) val；leu；ile；gly
 Arg(R) lys
 Asn(N) gln；his
 Asp(D) glu
 Cys(C) ser
 Gln(Q) asn；his
 Glu(E) asp
 Gly(G) pro，ala
 His(H) asn；gln
 Ile (I) leu；val；ala
 Leu(L) ile；val；met；ala；phe
 Lys(K) arg
 Met(M) leu；phe
 Phe(F) leu；val；ala
 Pro(P) gly
 Ser(S) thr
 Thr(T) ser
 Trp(W) tyr
 Tyr(Y) trp；phe
 Val(V) ile；leu；met；phe，ala
本发明的多肽的生物活性片段也包含在本发明范围内。如本文中所使用的，“生物活性片段”是本发明多肽的一部分，其保持了全长多肽的指定活性。生物活性片段能够是它们保持所指定活性的长度的任何长度。优选地，生物活性片段保持全长蛋白的至少10％的活性。正如熟练的收阅人(addressee)所知，验证多肽的生物活性片段的技术在本领域内是已知的。例如，本发明多肽的片段可以用合适的测定(或分析)法，例如通过确定该片段是否能够诱导细胞中的细胞病理效应，进行测试而确定该片段是否具有毒素活性。在一个实施方式中，生物活性片段在长度上为至少100个氨基酸，更优选在长度上为至少110个氨基酸，更优选在长度上为至少120个氨基酸，更优选在长度上为至少130个氨基酸，更优选在长度上为至少140个氨基酸，更优选在长度上为至少150个氨基酸，更优选在长度上为至少175个氨基酸，或更优选在长度上为至少200或更多个氨基酸。
术语“抗原”和“抗原的”在本领域内很好理解，是指通过免疫系统的组分特异性识别的大分子的部分，例如，抗体或T-细胞抗原受体。术语“抗原”是指肽、多肽或其它在宿主中能够被诱导对其产生免疫应答的其它大分子。因此，本发明包括本发明多肽的抗原片段。优选地，抗原片段能够提高对细菌病原体例如来自梭状芽孢杆菌属包括但不限于产气荚膜梭菌的细菌的免疫应答。在一个实施方式中，抗原是本发明多肽的抗原决定基(或部位)。在一个实施方式中，抗原片段在长度上是6个氨基酸，更优选在长度上是7个氨基酸，更优选在长度上是8个氨基酸，更优选在长度上是9个氨基酸，更优选在长度上是10个氨基酸。可替代地，抗原片段在长度上为至少20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。在一个实施方式中，当向受试者给药时抗原能够诱发对含有按照SEQID NO：2和/或SEQ ID NO：3提供的氨基酸序列的多肽的免疫应答。
而且，如果需要，非天然氨基酸或化学合成氨基酸类似物能够作为替换物到或插入物而引入本发明的多肽中。这种氨基酸包括但不限于，常见氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸(t-butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t-butylalanine)、苯基甘氨酸(phenylglycine)、环己基丙氨酸(cyclohexylalanine)、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计的(designer)氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。
本发明的多肽，在合成期间或之后，例如通过生物素化、苯甲酰化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解、连接于抗体分子或其它细胞配体等进行差异化改性(或修饰)，也都包含在本发明的范围内。这些改性(或修饰)可以用于提高本发明多肽的稳定性和/或生物活性。
本发明的多肽能够以各种方式进行生产，包括天然多肽的生产和回收，重组多肽的生产和回收、以及多肽的化学合成。在一个实施方式中，本发明分离的多肽是通过在有效生产多肽的条件下培养能够表达该多肽的细胞、并回收多肽而进行生产的。用以培养的优选细胞是本发明的宿主细胞。有效的培养条件包括但不限于，有效的介质、生物反应器、温度、pH和容许多肽生产的氧条件。有效介质是指其中细胞被培养而生产本发明多肽的任何介质。这种介质典型地包括具有可吸收碳、氮和磷酸盐(酯)源的含水介质，和合适的盐、矿物质、金属和其它营养成分，如维生素。本发明的细胞能够在传统的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微孔板盘和培养皿中进行培养。培养能够在温度、pH和适用于重组蛋白的氧含量条件下实施。这些培养条件都在本领域普通技术人员的专门知识的范畴之内。
抗体
如本发明中所使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、异源偶联抗体(hetreoconjugate antibodies)、包括完整分子及其片段的嵌合抗体，例如能够结合抗原决定基(或部位)决定子的Fab、F(ab′)2和Fv，以及其它的类抗体分子。
抗体片段保持了与其抗原或受体选择性结合的一些能力，而定义如下：
(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，能够通过用酶木瓜蛋白酶消化整个抗体而产生完整轻链和一个重链的部分而进行生产；
(2)Fab′，抗体分子的片段，能够通过用胃蛋白酶处理整个抗体接着还原而产生完整轻链和重链的部分而获得；每分子抗体能够获得两个Fab′片段；
(3)(Fab′)2，能够通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体但随后并不还原而获得的抗体片段；F(ab)2是通过两个二硫键固定到一起的两个Fab′片段的二聚体；
(4)Fv，定义为含有表达为双链的轻链可变区域和重链可变区域的基因工程片段；和
(5)单链抗体(“SCA”)，定义为含有轻链可变区域、重链可变区域、由合适的多肽连接子连接成为基因融合单链分子的基因工程分子。
制备这些片段的方法在本领域内是已知的。(参见，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York(1988)，结合于此作为参考)。
(6)单结构域抗体，典型地为无轻链的可变重结构域。
多克隆抗体
本发明的抗体可以是多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法对于本领域技术人员是已知的。多克隆抗体能够在哺乳动物或禽类体内，例如通过一次或多次注射表达该多肽的细胞以及如果需要还有佐剂而进行提高。典型地，细胞和/或佐剂在哺乳动物或禽类体内通过多次皮下或腹膜内注射而进行注射。可以采用的佐剂实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰类脂A，人工合成的海藻糖二霉菌酸酯)。免疫方案可以通过本领域技术人员进行选择而无须采取过分(或不当)实验。
单克隆抗体
可替代地，由本发明方法生产的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以采用杂交瘤方法进行制备，例如，文献Kohler andMilstein，(1975)描述的那些方法。在杂交瘤方法中，鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物典型地采用表达衍生于基因转移哺乳动物的第一物种的多肽的细胞进行免疫而诱发产生或能够产生将会特异性地结合于第一物种多肽的抗体的淋巴细胞。
一般而言，如果需要人源细胞，则要么使用周围血液淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后采用合适的融合剂如聚乙二醇而使淋巴细胞与永生化细胞系融合而形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibody：Principles and Practice，Academic Press，(1986)pp.59-103)。永生化细胞系通常由哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞转化。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在优选含有一种或多种抑制不融合的永生化细胞生长或存活的物质的合适培养介质中进行培养。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养介质典型地将含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(“HAT介质”)，该物质能够阻止HGPRT-缺乏细胞的生长。
优选的永生化细胞系是通过所选的产生抗体的细胞有效融合、维持抗体稳定的高水平表达、而对介质如HAT介质敏感的那些。更优选的永生化细胞系是鼠科骨髓瘤细胞系，其能够例如从SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.和American TypeCulture Collection，Manassas，Va.获得。人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系对于人单克隆抗体的生产也进行了描述(Kozbor，1985；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987 pp.51-63)。
其中进行杂交瘤细胞培养的培养介质然后能够针对第一物种多肽的单克隆抗体的存在进行分析(或测定)。优选地，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性由免疫沉淀法或通过体外结合测定(或分析)，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(或分析)(ELISA)来确定。这些技术和分析(或测定)在本领域内是已知的。例如，单克隆抗体的结合亲和力能够通过芒森和波拉德(Munson and Pollard，(1980))的斯卡查德分析来确定。
在识别所需的杂交瘤细胞之后，该克隆通过限制稀释步骤就可以进行亚克隆而通过标准方法进行生长。为此目的的合适培养介质，例如，包括Dulbecco’s Modified Eagle′s Medium和RPMI-1640介质。可替代地，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内作为腹水进行体内生长。
通过亚克隆分泌的单克隆抗体可以从培养介质或腹水流体中通过传统的免疫球蛋白纯化技术如例如蛋白A-琼脂糖凝胶(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、或亲合色谱进行分离或纯化。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法，如描述于美国专利US4,816,567中的那些方法制备。编码本发明的单克隆抗体的DNA能够易于采用传统方法(例如，通过使用能够特异性结合于编码鼠科抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和排序(或定序)。本发明的杂交瘤细胞能够作为这种DNA的优选来源。一旦分离，这种DNA就可以被置入表达载体，然后表达载体被转染到宿主细胞如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，而在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。DNA也可以例如通过用编码序列替换人重链和轻链恒定结构域而代替同源鼠科序列(美国专利US 4,816,567)或通过共价结合于免疫球蛋白编码序列、非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列而进行改性(或修饰)。这种非免疫球蛋白多肽能够替换本发明抗体的恒定结构域，或者能够替换本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域而产生嵌合二价抗体。
抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法在本领域内是众所周知的。例如，方法之一涉及免疫球蛋白轻链和经修饰(或改性)重链的重组表达。重链一般在Fc区域的任何点发生短截以便防止重链交联。可替代地，相关的半胱氨酸残基用另一氨基酸残基替换或缺失(或删除)而防止交联。
体外方法也适用于制备单价抗体。产生其片段，尤其是Fab片段的抗体的消化，能够采用本领域已知的常规技术来完成。
抗体也可以是采用已知的选择和/或本领域已知的突变形成方法成熟的亲合性。优选的亲合力成熟的抗体具有的亲合力比成熟抗体制备所用的起始抗体高5倍、更优选10倍。甚至更优选20倍或30倍。
双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，结合特异性之一可以是对本发明的多肽，另一结合特异性是对于任何其它抗原，而优选是对于细胞表面蛋白或受体或受体亚单元的结合特异性。
用于制备双特异性抗体的方法在本领域也是已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello，1983)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤(quadromas)产生10个不同抗体分子的潜在混合物，其中仅仅一个具有正确的双特异性结构。该正确分子的纯化通常通过亲合色谱步骤完成。类似的方法公开于WO93/08829和文献Traunecker(1991)中。
双特异性抗体能够作为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)来制备。由抗体片段产生双特异性抗体的技术在文献中已经进行了描述。例如，双特异性抗体能够采用化学键连来进行制备。各种直接从重组细胞培养基中制备和分离双特异性抗体片段的技术也已经进行了描述。
Hollinger et al.(1993)提供了一种用于制备双特异性抗体片段的可替代机制。该片段含有通过太短而不容许在同一链上的两域之间配对的连接子连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。因此，一个片段的VH结构域和VL结构域被迫与另一片段的互补VL结构和VH结构域域配对，由此而形成两个抗原-结合位点。通过使用单链Fv(sFv)二聚体用于制备双特异性抗体片段的另一策略已经由文献Gruber et al.(1994)进行了报道。
具有多于两价的抗体也是可设想的。例如，三特异性抗体也能够制备，如Tutt et al.(1991)。
异源偶联抗体(Hetreoconjugate Antibodies)
异源偶联抗体也落入本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体构成。这种抗体，例如，有人提出将免疫系统细胞靶向不希望的(或多余)细胞(美国专利US 4,676,980)，而用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。可以设想，这些抗体可以采用合成蛋白化学中已知的方法，包括那些涉及交联剂的方法而进行体外制备。例如，免疫毒素可以采用二硫化物交换反应或通过形成硫醚碱而进行构建。为此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚氨甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及例如在美国专利US4,676,980中公开的那些试剂。
多核苷酸
对于“分离的多核苷酸”，我们意指一般从与其有关的或在其天然状态与之连接的多核苷酸序列中分离出来的多核苷酸。优选地，经分离的多核苷酸至少60％游离出，更优选至少75％游离出，而更优选至少90％游离出天然与之相关的其它组分。而且，术语“多核苷酸”在本文中可以与术语“核酸分子”、“基因”和“mRNA”互换使用。
在多核苷酸的上下文中术语“重组”是指当与其天然状态相比，在细胞中，或在无细胞表达系统中，以变化的量存在时的多核苷酸。在一个实施方式中，该细胞是并不天然含有该多核苷酸的细胞。然而，该细胞可以是含有导致编码的多肽生产量的改变，优选提高的非内源性多核苷酸的细胞。本发明的重组多核苷酸包括还未从转录(重组)细胞、或者在其中其存在的无细胞表达系统的其它组分中分离出的多核苷酸，以及在随后从至少一些其它组分中纯化出的这种细胞或无细胞系统中产生的多核苷酸。
“多核苷酸”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。这可以是染色体组或合成源、双链或单链的DNA或RNA，而与碳水化合物、脂质、蛋白或其它物质化合而实施本文中定义的特定活性。
多核苷酸的识别％通过GAP(Needleman and Wunsch，1970)分析(GCG程序)采用间隔生成罚分＝5和空格延伸罚分＝0.3而进行测定。在长度上查询序列为至少45个核苷酸，而GAP分析在至少45个核苷酸的区域内比对两个序列。更优选地，查询序列在长度上为至少150个核苷酸，而GAP分析在至少150个核苷酸的区域内比对两个序列。更加优选地，查询序列在长度上为至少300个核苷酸，而GAP分析在至少300个氨基酸的区域内比对两个序列。更优选地，在其整个长度内比对这两个序列。
关于所定义的多核苷酸，应该理解到，比以上提供的识别％图更高的多核苷酸将会涵盖优选的实施方式。因此，根据最低识别％图，只要适用，优选该多核苷酸含有的多核苷酸序列为至少40％，更优选至少45％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，而更加优选至少99.9％相同于相关指定的SEQ ID NO。
本发明的多核苷酸，当对比于天然存在的分子时，可以拥有一个或多个核苷酸残基的缺失(或删除)、插入或替换的突变。突变体能够是天然发生的(也就是说，从天然来源中分离出的)或人工合成的(例如通过在以上描述的核酸上实施定位突变或DNA改组)。因此，显而易见本发明的多核苷酸能够是天然产生的或重组的。
本发明的多核苷酸包括在对于含有至少40％相同于，优选至少90％相同于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸的严格条件下杂交的那些。如在本文中所使用的，术语“严格的杂交条件”等是指与本领域中所熟悉的那些参数，包括随寡核苷酸的长度变化的杂交温度。核酸杂交参数可以在编撰这些方法的文献Sambrook，et al.(supra)，and Ausubel，et al.(supra)中找到。例如，如在本文中所使用的，严格杂交条件能够是指在65℃下的杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中的杂交。
载体和宿主细胞
本发明的一个实施方式包括重组载体，其包含本发明的至少一种分离的多核苷酸分子，被插入到能够将多核苷酸分子递送到宿主细胞中的任何载体中。这样的载体含有异源性多核苷酸序列，这是并非天然发现的毗邻本发明的多核苷酸分子而优选衍生于除了多核苷酸衍生物种之外的物种的多核苷酸序列。该载体能够是RNA或DNA，原核的或是真核的，而典型地是转位子(或转座子)(例如描述于美国专利US 5,792,294)，病毒或质粒。
如本文中所使用的，“可操作地连接”是指两个或多个核酸(例如DNA)片段之间的功能关系。典型地，这是指转录调控元件对转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或调节合适细胞中的编码序列的转录，则启动子可操作地连接于编码序列，例如本文中所定义的多核苷酸。一般而言，可操作地连接于转录序列的启动子转录调节元件对转录序列是物理上邻近的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节元件，如增强子，并不需要是物理上邻近的或定位于它们增强其转录的编码序列的紧邻。
正如本文中所使用的，表达载体是能够转变宿主细胞并实施指定多核苷酸分子表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体也能够在宿主细胞中进行复制，表达载体能够是原核的或真核的，而典型地是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的重组细胞，包括在细菌、真菌、内源性寄生生物(或体内寄生生物)、节肢动物、动物、和植物细胞中发挥功能(即，引导基因表达)的任何载体。
具体而言，本发明的表达载体含有调节序列，如转录控制序列，翻译控制序列，复制起点、和其它与重组细胞相容并控制本发明的多核苷酸分子表达的调节序列。具体地，本发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录开始、延长和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录开始，如启动子、增强子、操纵基因和阻抑物序列的那些序列。合适的转录控制序列包括那些能够在本发明至少一种重组细胞中发挥功能的任何转录控制序列。各种这样的转录控制序列对于本领域的技术人员而言是已知的。
本发明的重组分子也可以(a)含有使本发明所表达的多肽能够从产生该多肽的细胞中分泌出来的分泌信号(即，信号片段核酸序列)，和/或(b)含有导致本发明的核酸分子作为融合蛋白表达的融合序列。合适的信号片段的实例包括任何能够引导本发明的多肽分泌的信号片段。重组分子也可以包括围绕和/或在本发明的核酸分子的核酸序列内的插入序列(或间插序列)和/或非翻译序列。
本发明的另一实施方式包括含有本发明的一种或多种重组分子的宿主细胞。多核苷酸分子转化到细胞中能够通过多核苷酸分子能够插入到细胞中的任何方法来完成。转化技术包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、脂质体转染、吸附、和原生质体融合。重组细胞可以保持单细胞或者可以生长成组织、器官或多细胞生物。本发明的转化的多核苷酸分子能够保持是染色体外的、或者能够以保留其表达能力的这种方式结合到所转化的(即重组)细胞的染色体中的一个或多个位点。
待转化的合适宿主细胞包括能够用本发明的多核苷酸转化的任何细胞。本发明的宿主细胞能够内源性地(即，天然的)生产本发明多肽或在用本发明的至少一种多核苷酸分子转化后能够产生这种多肽。本发明的宿主细胞能够是能够产生本发明至少一种蛋白的任何细胞，包括动物、植物、细菌、真菌(包括酵母)、寄生生物、和节肢动物的细胞。优选地，该宿主细胞是细菌细胞。在一个优选实施方式中，该宿主细胞是具有血清型H抗原H10的大肠杆菌菌株。合适的大肠杆菌菌株实例包括在WO 2007/025333中描述的CCEC22、CCEC31和CCEC59。
重组DNA工艺学能够用于通过，例如，可操作控制宿主细胞中的多核苷酸分子复制体的数目而改进所转化多核苷酸分子的表达、这些多核苷酸分子的转录效率、所得转录物的翻译效率、和翻译后修饰的效率。对提高本发明的多核苷酸表达的有用重组技术包括但不限于，可操作地将多核苷酸分子连接到高复制数质粒，将多核苷酸分子结合到一个或多个宿主细胞染色体中，将载体稳定性序列添加入质粒中，替换或修饰转录控制信号(例如，启动子、操纵基因、增强子)，替换或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点，Shine-Dalgarno序列(或SD序列))，修饰本发明的多核苷酸分子而对应于宿主细胞的密码子使用，以及确实(或删除)对转录去稳定化的序列。
多核苷酸的检测
任何容许用于检测本发明多核苷酸的合适技术都可以使用，包括那些容许定量评价多核苷酸在组织和/或细胞中的表达水平的技术。例如，转录基因的存在或水平能够通过RNA印迹法(或诺慎印迹法，Northernblotting)、和/或多核苷酸的扩增，如通过PCR就能够检测。比较可以通过参照标准对照进行。例如，转录基因的水平能够通过RNA印迹法和/或RT-PCR就能够测定。随着定量(实时)PCR的出现，基因表达的定量分析通过采用对于所感兴趣基因的合适引物就能够实现。核酸可以在基因阵列上进行标记和杂交，在这种情况下，基因浓度将直接与阵列中产生的放射性或荧光信号的强度成比例。
“聚合物酶链反应”(“PCR”)是其中复制副本采用构成“上游”和“下游”引物的“引物对”或“引物组”、以及聚合催化剂如DNA聚合物酶、和典型的热稳定性聚合物酶而制成多核苷酸靶的反应。用于PCR的方法在本领域内是已知的，例如于″PCR″(Ed.M.J.McPherson and S.G Moller(2000)BIOS Scientific Publishers Ltd，Oxford)中所教导的。PCR能够在由从生物样品中分离出的反转录mRNA获得的cDNA上实施。然而，如果PCR在染色体组的DNA上实施，则一般这将会更容易些。
引物通常是约20个核苷酸长，最少约15个核苷酸的寡核苷酸，其能够在序列特异性模式下杂交到靶序列中而在PCR期间扩展。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是含有引物和靶序列的新近合成的复制体的扩展产物。多重PCR系统含有导致同时产生多于一个扩增子的多组引物。引物可以极好地匹配于靶序列或它们可以含有能够在特异性靶序列中产生限制内切酶或催化性核酸识别/裂解位点诱导的内部不匹配碱基。引物也可以含有其它序列和/或修饰或标记的核苷酸而有利于捕获或检测扩增子。DNA的热变性、引物的退火到其互补序列和退火引物用聚合物酶进行扩展的重复循环，导致了靶序列的指数扩增。术语“靶”或“靶序列”或“模板”是指扩增的核酸序列。
本领域技术人员将会理解到，还有许多可替代的技术可以用于扩增本发明的多核苷酸。其它扩增技术的实例包括反转录聚合物酶链反应(RT-PCR)、连接酶链反应(“LCR”)，还包括等温扩增技术，如链替换扩增(SDA)、DNA环介导等温扩增(LAMP)。
可替代地，本发明的多核苷酸可以在样品中采用合适的杂交技术，例如采用合适标记探针的DNA印迹杂交，进行检测。“探针”是能够碱基配对到含有互补序列(靶)的第二DNA或RNA分子的定义序列的单链DNA或RNA分子。所得的杂交分子的稳定性取决于所发生的碱基配对的程度，并受到参数如探针和靶分子之间的互补程度、以及杂化条件的严格程度的影响。对于本文中描述的多核苷酸、或其部分具有特异性的探针，在长度上可以变化，包括从至少8个核苷酸到500个核苷酸之间的任何在内的整数值，这取决于探针所使用的目的、和在此目的下的条件。例如，探针在长度上可以是至少8、10、15、20或25个核苷酸，或者在长度上可以是至少30、40、50或60个核苷酸，或在长度上可以是100、200、500或1000个核苷酸内的长度。例如采用比对(Align)程序分析(Myersand Miller，1989)，对本文中描述的多核苷酸具有特异性的探针一般至少40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多达96％、97％、98％或99％相同于本文中描述的核酸序列。
如本文中所使用的，术语“杂交”是指两个核酸分子相互之间通过氢键的关联作用。影响这种结合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；阻断液相分子非特异性连接于固体载体的试剂(登哈特试剂或BLOTTO)；分子的浓度；用于增加分子关联比率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；和杂交后的冲洗条件的严格度(参见，Sambrook et al.，Molecular Cloning；ALaboratory Manual，Second Edition(1989))。根据这些原理，互补分子与靶分子的杂交的抑制作用可以采用杂交试验分析进行检测；具有更大程度同源性的基本同源的分子，接着就会竞争而在各种严格条件下抑制竞争性同源分子结合于靶分子，正如在文献Wahl et al.，(1987)中所教导的。
正如本文中关于杂交所使用的，“严格条件”是指这样一些条件：(1)采用低离子强度和高温冲洗，例如，50℃的0.015MNaCl/0.0015 M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4；(2)杂交期间采用变性试剂如甲酰胺，例如，42℃的50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清清蛋白、0.1％菲可(聚蔗糖，Ficoll)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、50mM pH6.5磷酸钠缓冲液与750mM NaCl、75mM柠檬酸钠；或(3)采用42℃在0.2×SSC和0.1％SDS中的50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×登哈特溶液(Denhardt′s solution)、超声处理的鲑鱼精子DNA(50g/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖。
减毒细菌
细菌病原体的减毒方法在本领域内是已知的。典型地，将突变引入到细菌染色体组中以阻止或降低毒素或其它毒性基因的表达而缺失(或删除)或使该基因失活。在某些情况下，它们完全敲除这些基因的功能。这可以通过完全从基因中废止任何多肽的合成、或通过使之产生突变而导致非功能性多肽的合成而实现。为了废止多肽的合成，整个基因或其5′-端部可以进行删除(或缺失)。在基因编码序列中删除或插入，可以用于产生仅仅合成非功能性多肽的基因(例如，仅仅含有野生型蛋白的N-端序列的多肽)。在毒素基因的情况下，突变可以导致该基因产物变成无毒性。
“突变”包括与亲代菌株相比在生物的DNA序列，即染色体组中的任何改变。这种改变可以通过将生物暴露于诱变刺激物，如诱变化学品、能量、辐射、重组技术、交配、或任何用于改变DNA的其它技术而产生。突变可以包括在本文中描述的任何核苷酸序列中的改变，或者可以包括在编码本文中描述的任何多肽的核苷酸序列中的改变。
作为突变的结果，当与亲本菌株相比时，如果突变细胞的毒性水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则突变可以“弱化毒素毒性”。毒性的降低也可以通过当与亲本菌株相比时降低多肽，例如含有基本相同于序列SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3、或其片段或变体的氨基酸序列在突变菌株中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的表达和/或毒素活性而进行测定。
本领域技术人员将会理解到，本发明的减毒细菌病原体可以适用于向受试者递送一种或多种生物活性多肽。适用于通过本发明的减毒细菌递送的生物活性多肽的实例包括能够局部或系统地发挥功能的多肽，例如能够发挥内分泌活性而影响局部或全身代谢的多肽。
在一个实施方式中，生物活性多肽可以是异源多肽。术语“异源多肽”在本领域内很好理解，是指非细胞内生的多肽。编码所感兴趣的多肽的核酸分子可以源于能够产生所感兴趣多肽的任何生物，或者可以是完全人工合成的基因。编码该多肽的核酸分子能够例如通过感染、转染、显微注射、电穿孔、(高速粒子)喷射技术(microprojection)等加入到细胞中。
以举例的方式，生物活性多肽可以是能够调节免疫造血系统的多肽。可替代地，生物活性多肽可以是能够影响体内各种正常细胞或肿瘤细胞的生存力、生长和分化的多肽。可替代地，生物活性多肽可以是能够影响免疫调节或对受伤和感染的急性期发炎应答的诱导的多肽。可替代地，生物活性多肽可以是能够增强或诱导对由作用于其靶细胞受体上的趋化激素介导的细胞和组织感染的抗性、或上皮细胞增殖或伤愈促进的多肽。
这种多肽的具体实例包括胰岛素，生长激素，催乳素，降钙素，黄体生成素，甲状旁腺激素，促生长素抑制素，促甲状腺激素，血管活性肠肽，结构组1细胞因子(structural group 1 cytokine)如IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-32、cMGF、LT、GM-CSF、M-CSF、SCF、IFN-γ、IFN-λ、EPO、G-CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL或IFNα/β，结构组2细胞因子如TNF族的细胞因子例如TNFα配体、TNFβ配体、CD40配体、CD27配体或FAS配体，IL-1族的细胞因子，成纤维细胞生长因子族，血小板衍生的生长因子，转化生长因子β和神经生长因子，结构组3细胞因子例如上皮生长因子族的细胞因子，趋化因子，胰岛素相关的细胞因子，结构组4细胞因子如调蛋白(heregulins)或神经调节蛋白，例如EGF。
可替代地，生物活性多肽能够是对于以上定义的生物活性多肽的受体或拮抗剂。
在本发明的一个实施方式中，生物活性多肽是抗体，优选重组抗体。
可替代地，生物活性多肽能够是抗微生物肽或其合成变体。抗微生物肽包括杀菌肽、爪蟾抗菌肽(或蛙皮素，magainin)和防卫素(defensin)。
杀菌肽是第一族特征化较佳的结构相关的抗微生物肽，据发现广泛分布于昆虫体内(Boman，2003)。在脊椎动物中，爪蟾抗菌肽(或蛙皮素)族抗微生物肽已经从爪蟾皮肤和胃肠道的腺体中分离出来，而被认为是构成两栖动物粘膜表面抗感染防御体系的基础(Soravia et al.，1988)。
防卫素是在从几种哺乳动物物种包括人类中分离出的吞噬细胞中发现的抗微生物肽，而其特征是序列中的8个不变残基(Gabayet al.，1989)。肽，如防卫素的抗微生物活性机理是经由选择性地破坏膜而产生抗生物活性的特征广谱(Boman，1995)。防卫素的抗微生物谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、许多真菌和一些包膜病毒。
细菌源的抗微生物肽已知为小菌素、大肠杆菌素和细菌素(Jacket al.，1995；Ingham et al.，2003)。据所知，细菌素活性的序列、结构和机理是不同的。最丰富的和研究最透彻的细菌素包括I类(羊毛硫抗生素)和II类(含非羊毛硫氨酸的小热稳定肽)细菌素(Ennahar et al.，2000)。II类细菌素因为其活性和潜在的应用构成了一重要的亚群。IIa类细菌素包括Piscicolin 126、明串珠菌素A(leucocin A)和肠道菌素P(或促肠活动素，enterocin P)等。IIa类细菌素具有共同的N-端基序：YGNGVXaaCXaa(K/N)XaaXaaCXaaV(N/D)(W/K/R)Xaa-(G/A/S)(A/N)，其中具有较高可变性的残基表示为Xaa(Bhugaloo-Vial，et al.，1996)。在论证细菌素抗微生物性质的实例中，Piscicolin 126，当其被注入小鼠体内时，已经证实表现出体内抗微生物活性，并显著降低了肝脏和脾中的李斯特负载(listerial load)(Ingham et al.，2003)。
可替代地，生物活性肽能够是酶。酶能够是任何具有所需活性的酶。例如，递送在改善食物消化能力或去除抗营养化合物中起作用的酶，是合乎需要的。例如，多糖降解和纤维蛋白溶解的酶如木聚糖酶(Liu et al.，2005)、葡聚糖酶(Cho et al.，2000)、纤维素酶(Liuet al.，2005)、淀粉酶、果聚糖蔗糖酶、和菊粉蔗糖酶都可以被递送而增加食物的消化能力。蛋白酶、肽酶、和脂肪酶也可以被递送而增加被消化食物的营养价值。植酸酶(或肌醇六磷酸酶)(Vohra andSatyanarayana，2003；Nahashon et al.，1994)和酸性磷酸酶(Palacioset al.，2005)也可以被递送而降低在植物种子中发现的肌醇六磷酸(盐/酯)的抗营养效应。
在另一实施方式中，本发明的减毒细菌病原体可以表达抗原体。如果抗原是例如来自细菌、真菌、寄生生物或病毒性致病剂(viraldisease agent)，则减毒细菌菌株就能够用于对受试者接种而对抗由这种致病剂导致的疾病。例如，减毒细菌菌株能够用于递送来自禽类病原微生物的抗原。这种微生物包括但不限于以下这些物种：棒状杆菌(Corynebacteria)，支原体(Mycoplasma)，李斯特氏杆菌(Listeria)，包柔氏螺旋体菌(Borrelia)，衣原体(Chlamydia)，梭状芽胞杆菌(Clostridia)，科克斯菌属(Coxiella)，丹毒丝状菌(Eysipelothrix)，黄杆菌(Flavobacteria)，葡萄球菌(Staphylococcus)，埃希氏菌(Escherichia)，沙门氏菌(Salmonella)，弯曲杆菌(Campylobacter)和链球菌(Streptococcus)。已知感染家禽的真菌和寄生性禽类病原体的实例有以下物种：变带绦虫属(Amoebotaenia)，Aproctella，蛔虫属(Ascaridia)，曲霉菌(Aspergillus)，念珠菌(Candida)，毛细线虫属(Capillaria)，隐孢子虫属(Cryptosporidium)，杯冠木属(Cyathostroma)，咽饰带线虫属(Dispharynx)，艾美耳球虫属(Eimeria)，皱褶属(Fimbriaria)，筒线虫属(Gongylonemia)，异刺线虫属(Heterakis)，组织滴虫属(Histomonas)，尖旋尾属(Oxyspirura)，疟原虫属(Plasmodium)，瑞立绦虫属(Raillietina)，类圆线虫属(Strongyloides)，锥尾属(Subulura)，比翼属(Syngamus)，四棱属(Tetrameres)和毛圆线虫属(Trichostrongylus)。感染家禽的已知病毒包括腺病毒(adenoviruses)(例如，出血性肠炎病毒(hemorrhagic enteritisvirus))，星状病毒(astroviruses)，冠形病毒(coronaviruses)(例如，传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus))，副粘病毒(paramyxoviruses)(例如，新城疫病毒(Newcastle disease virus))、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)(例如，禽类脑脊髓炎病毒(encephalomyelitis virus))，痘病毒(pox viruses)，逆转录病毒(retroviruses)(例如，禽类白血病/肉瘤病毒(leukosis/sarcomaviruses))，呼吸道肠道孤病毒(reoviruses)和轮状病毒(rotaviruses)。具体实例包括禽流感病毒、马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus)和鸡贫血病毒(Chicken Anaemia Virus)。用作抗原的优选基因产物是多肽和肽，包括糖蛋白和脂蛋白。来自这些原核和真核生物的抗原编码的基因能够进行克隆，并采用标准技术在减毒细菌中表达。
组合物和给药
“免疫原组合物”是指含有提高所需免疫应答的物质的组合物，包括“疫苗”。术语“疫苗”涵盖了任何诱导抗靶向病原体的至少部分保护性免疫应答或其有效保护对抗病原体的组合物；例如，在给予或注射到动物(例如，禽类如家鸡或猪类家畜如猪)体内之后，诱发对抗靶向病原体的至少部分保护性免疫应答或提供对抗病原体(如产气荚膜梭菌)的有效保护。病原体的子单元例如从病原体分离出的抗原或免疫原或抗原决定基，和子单元组合物，含有或基本由一种或多种从病原体中分离出的抗原、免疫原或抗原决定基组成。对于诱发“至少部分保护性的”免疫应答，意指疫苗降低由表达本发明多肽的细菌产生的感染和/或群集(或殖民化)或者降低由表达本发明多肽的细菌感染而产生的至少一种症状。
免疫原的组合物可以选择、活化或扩展包括记忆B细胞和T细胞在内的免疫系统细胞，而例如使之能够消除传染性致病物，如表达含有SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3氨基酸序列、或其抗原片段的多肽的细菌病原体。
在一些实施方式中，免疫原的组合物包括合适的载体，如佐剂，其是这样的一种试剂，其以非特异性方式作用而增加对特异性抗原、或抗原组的免疫应答，而能够以既定剂量降低抗原数量，或者降低产生所需的免疫应答而需要的剂量频率。例如，在接种动物中所需的免疫应答相对于未接种动物可以包括10％至100％之间的任何值，例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％对抗细菌病原体散发或群集的保护。
佐剂对于改善免疫应答和/或增加疫苗制剂的稳定性是有用的。佐剂典型地描述为免疫系统的非特异性刺激物，而且对于靶向免疫系统的特异性分支也是有用的。一种或多种具有这种活性的化合物可以加入到疫苗中。因此，本发明的具体疫苗另外含有一种佐剂。能够用作佐剂的化学化合物的实例包括但不限于，铝化合物(例如，氢氧化铝)，可代谢的和不可代谢的油，矿物油包括矿物油溶液中的油酸二缩甘露醇酯衍生物(例如，购自Seppic SA，France的MONTANIDE ISA 70)和轻矿物油如DRAKEOL 6VR、嵌段共聚物、ISCOM′s(免疫刺激络合物)、维生素和矿物质(包括但不限于：维生素E、维生素A、硒和维生素B12)和
其它合适的佐剂，有时候也称之为免疫刺激剂，包括但不限于：细胞因子、生长因子、趋化因子、淋巴细胞的细胞培养基的上清液、单核细胞、来自淋巴器官的细胞、来自植物、细菌或寄生生物的细胞制剂和/或提取物(金黄色葡萄球菌或脂多糖制剂)或促细胞分裂剂。
一般而言，佐剂随本发明的抗原同时给药。然而，佐剂也能，或可替代地在疫苗给药之前2个星期的时间内给药、和/或疫苗给药之后一定时间内给药，即只要抗原，例如含有按照SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3提供的氨基酸序列的多肽或其抗原片段，存留于组织内。
根据本发明的免疫原的组合物可以包括本文中所描述的多肽和核酸分子、或其免疫原片段，并且可以采用本领域已知的或本文中描述的任何给药形式进行给药。在本发明一些实施方式中，免疫原组合物或疫苗可以包括活体细菌病原体、杀灭的细菌病原体，或其组分。活体细菌病原体可以以口服疫苗的形式给药，可以进行减毒而使之降低细菌病原体的毒性，而不是其免疫应答的诱导。活体疫苗可以能够群集于接种动物如禽类的肠内。
在一些实施方式中，本文中描述的多肽和核酸分子，或其抗原片段，或本文中描述的变异细菌(例如，减毒细菌)可以给予家禽，例如家鸡、鸭、火鸡等，而诱发家禽内的免疫应答，例如，产生抗体。由这种家禽获得的蛋，或其产品，表现出对抗本文中描述的多肽和核酸分子、或其免疫原片段的免疫应答的，可以给予动物，如人、牛、山羊、绵羊等，而在动物内诱发对本文中描述的多肽和核酸分子、或其免疫原片段的免疫应答。在家禽中产生抗体的方法，以及给予这种抗体的方法，描述于例如美国专利US 5,750,113和美国专利US 6,730,822中。
根据本发明的免疫原组合物和疫苗可以进一步通过加入其它的当给予动物受试者时可以导致产生各种特异性抗体的重组或纯化抗原而进行补充。并非所有的这些抗体都需要是保护性地对抗疾病。在这种类型的具体实施方式中，这样的抗原也来自产气荚膜梭菌。因此，本发明的疫苗可以与本发明的多肽一起含有各种其它活性的或失活的病原因子。因此，根据本发明，本发明的多肽能够与其它的梭菌和非梭菌细胞、类毒素和提取物一起组合。
其它抗原可以包括病毒抗原体和/或细菌抗原体和/或寄生生物抗原体。例如，抗原体可以衍生于微生物，包括但不限于以下物种：棒状杆菌(Corynebacteria)，支原体(Mycoplasma)，李斯特氏杆菌(Listeria)，包柔氏螺旋体菌(Borrelia)，衣原体(Chlamydia)，梭状芽胞杆菌(Clostridia)，科克斯菌属(Coxiella)，丹毒丝状菌(Eysipelothrix)，黄杆菌(Flavobacteria)，葡萄球菌(Staphylococcus)，埃希氏菌(Escherichia)，沙门氏菌(Salmonella)，弯曲杆菌(Campylobacter)、和链球菌(Streptococcus)。已知感染家禽的真菌和寄生性禽类病原体的实例有以下物种：变带绦虫属(Amoebotaenia)，Aproctella，蛔虫属(Ascaridia)，曲霉菌(Aspergillus)，念珠菌(Candida)，毛细线虫属(Capillaria)，隐孢子虫属(Cryptosporidium)，杯冠木属(Cyathostroma)，咽饰带线虫属(Dispharynx)，艾美耳球虫属(Eimeria)，皱褶属(Fimbriaria)，筒线虫属(Gongylonemia)，异刺线虫属(Heterakis)，组织滴虫属(Histomonas)，尖旋尾属(Oxyspirura)，疟原虫属(Plasmodium)，瑞立绦虫属(Raillietina)，类圆线虫属(Strongyloides)，锥尾属(Subulura)，比翼属(Syngamus)，四棱属(Tetrameres)和毛圆线虫属(Trichostrongylus)。已知的感染家禽的病毒包括腺病毒(adenoviruses)(例如，出血性肠炎病毒(hemorrhagic enteritisvirus))，星状病毒(astroviruses)，冠形病毒(coronaviruses)(例如，传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus))，副粘病毒(paramyxoviruses)(例如，新城疫病毒(Newcastle disease virus))、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)(例如，禽类脑脊髓炎病毒(encephalomyelitis virus))，痘病毒(pox viruses)，逆转录病毒(retroviruses)(例如，禽类白血病/肉瘤病毒(leukosis/sarcomaviruses))，呼吸道肠道孤病毒(reoviruses)和轮状病毒(rotaviruses)。
本发明的多价疫苗还能够含有一种或多种以下抗原体：产气荚膜梭菌β毒素，产气荚膜梭菌β2毒素，产气荚膜梭菌肠毒素，产气荚膜梭菌ε毒素，产气荚膜梭菌ι毒素，产气荚膜梭菌κ毒素，产气荚膜梭菌λ毒素，产气荚膜梭菌θ毒素，索氏梭菌失血性(C.sordellii hemorrhagic)毒素，索氏梭菌致命毒素，艰难梭菌(C.difficile)A毒素，艰难梭菌B毒素，败毒梭菌(C.septicum)α毒素，诺维梭菌(C.novyi)α毒素和诺维梭菌β毒素。
本发明的免疫原组合物和疫苗可以作为液体、乳液、干粉给药，和/或以雾剂通过任何肠道外途径、静脉内、腹膜内、皮内，通过破皮，皮下、肌肉内给药，或通过粘膜途径，例如口服、作为气溶胶鼻吸，通过眼滴，通过卵内注射给药，或作为冻干粉末灌输给药。
本文中描述的多肽和核酸分子，或其免疫原片段，变异细菌(例如减毒细菌)和/或本文中描述的免疫原组合物的给药，可以通过向禽类(例如家禽)的蛋内注射和注射到气囊中而很方便实现。尽管气囊是卵内注射给药的优选途径，但是其它区域如卵黄囊或绒毛膜尿囊液也可以通过注射接种。当气囊不是用于给药的靶标时尽管没有必要是不可接受的商业水平，但是孵化能力比率或许会稍微降低。注射的机理并不严格限于本发明的实施内容，但是优选的是针不会导致对蛋或胚胎发育的组织和器官或胚胎周围的外胚膜造成不合宜的损害。
一般而言，配备约22号针的皮下注射器是合适的。本发明的方法尤其适用于自动注射系统，如描述于美国专利US 4,903,635、US 5,056,464、US 5,136,979和US 20060075973中的那些系统。
本发明还提供了对雌性动物(例如，怀孕母畜)后代提供被动免疫的方法，包括在其后代出生之前向该雌性动物(例如，母体)给予本发明的疫苗。“被动免疫”是指将免疫性从母体转移到后代并能够尤其是通过初乳消化来完成，正如在哺乳动物中所发生的那样，或将抗体从蛋卵黄吸收到血流中，正如在家禽中所发生的那样。
在一个实施方式中，雌性动物是禽类，而疫苗在其产下含有后代的蛋之前向禽类母体给药。以这种方式，其后代就被提供了被动免疫。在一个这种实施方式中，禽类是家禽。优选地，家禽是家鸡、火鸡或鸭子。
本发明的免疫原组合物和疫苗可以含有药用载体。药用载体包括兽医药可接受的载体。在一个具体实施方式中，术语“药用的”是指由联邦或州政府管理机构批准的或在适用于动物，而尤其是人类的美国药典或其它一般认知的药典中所列出的。术语“载体”是指治疗给药所用的稀释剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体能够是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。
一般而言，本发明的制剂成分要么独立地要么在单位剂量形式中一起混合供给，例如，作为冻干粉或无水浓缩物储存于气密性密封容器如指示活性剂的量的安瓿瓶或粉囊中。
本发明还提供了含有本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或宿主细胞的组合物。对于本领域技术人员应该理解到该组合物可以含有合适的载体或赋形剂。
DNA疫苗
DNA接种涉及将DNA编码抗原直接体内引入受试者的细胞和/或组织而由受试者组织的细胞表达抗原。这种疫苗在本文中称之为“DNA疫苗”或“核酸基疫苗”。DNA疫苗的实例描述于美国专利US 5,939,400，美国专利US 6,110,898，WO 95/20660和WO 93/19183中。直接注射编码抗原而诱发保护性免疫应答的DNA的能力已经在各种实验系统中得以证实(参见，例如，Conry et al.，1994；Cardosoet al.，1996；Montgomery et al.，1993；Yang et al.，1997)。
已知的影响由DNA免疫诱发的免疫应答的因素是DNA递送的方法，例如，肠道外途径能够产生的基因转移速率低，而产生的基因表达的可变性很大(Montgomery et al.，1993)。采用基因枪的高速接种质粒，能够增强小鼠的免疫应答(Fynan et al.，1993)，大概是因为DNA转染效率更大，而抗原通过树突细胞渗透更有效。含有本发明核酸基疫苗的载体也可以通过其它本领域已知的方法如转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE葡萄糖、磷酸钙沉淀、脂质体转染(溶酶体融合)、或DNA载体转运子而引入到所需宿主中。
衍生于转基因植物的疫苗
术语“植物”是指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞等。可设想用于本发明的实施中的植物包括单子叶植物和双子叶植物。典型的双子叶植物包括玉米、土豆、西红柿、菜豆、大豆等。典型的转基因植物常规上都作为用于农场动物，尤其是家鸡的食物(或饲料)来源而进行使用。
转基因植物，正如在本发明上下文中所定义的，包括植物(以及所述植物的部分和细胞)及其后代，这种后代已采用重组DNA技术遗传修饰而在所需植物或植物器官内导致或增强了本发明的至少一种多肽的生产。
现有的几种技术能够将外源遗传物质引入到植物细胞中，而获得稳定维持和表达所引入基因的植物。这样的技术包括加速涂覆到微粒上的遗传物质直接进入细胞中(参见，例如，美国专利US4,945,050和US 5,141,131)。植物可以采用土壤杆菌技术(或农杆菌技术，Agrobacterium technology)进行转化(参见，例如，US5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。电穿孔技术也用于植物转化(参见，例如，WO 87/06614、US 5,472,869、US 5,384,253、WO 92/09696和WO 93/21335)。除了用于转化植物的各种技术外，与外源基因相接触的组织类型也可以进行变化。这种组织可以包括但不限于，胚胎发生组织、胼胝体I型和II型、胚轴、分生组织等。几乎所有的植物组织在发育和/分化期间采用本文中描述的合适技术就可以被转化。
适合稳定转染植物细胞或转基因植物的建立的许多载体已经描述于例如文献Pouwels et al.，Cloning Vectors：A LaboratoryManual，1985，supp.1987；Weissbach and Weissbach，Methods forPlant Molecular Biology，Academic Press，1989；和Gelvin et al.，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990中。典型地，植物表达载体包括，例如，一种或多种在5′和3′调节序列和显性选择标记的转染控制下克隆的植物基因。这种植物表达载体还能够含有启动子调节区(例如，控制可诱导的或组成型的、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性表达的调节区)，转染开始的始发位点，核糖体结合位点，RNA处理信号、转染终止位点，和/或多腺苷酸化信号。
植物启动子的实例包括但不限于，核酮糖-1，6-二磷酸羧化酶小子单元、β-伴大豆球蛋白(conglycinin))启动子、菜豆蛋白启动子、ADH启动子、热冲击启动子和组织特异性启动子。启动子也可以含有某些可以改善转录效率的增强子序列元件。典型的增强子包括但不限于Adh-内含子1和Adh-内含子6。
组成型启动子引导所有细胞型中在所有时间的连续基因表达(例如，肌动蛋白、泛素、CaMV 35S)。组织特异性启动子负责在特异性细胞和组织类型如叶子或种子(例如，玉米蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白(或种子储藏蛋白，napin)、ACP、球蛋白等)中的基因表达，而这些启动子也可以使用。启动子也可以在植物发育的某些阶段是活性的，以及在植物组织和器官中也是活性的。这种启动子的实例包括但不限于，花粉特异性的、胚胎特异性的、玉米穗丝特异性的、棉纤维特异性的、根特异性的、种子胚乳特异性的启动子等。
在某些情况下，采用可诱导的启动子或许是合乎需要的。可诱导的启动子负责响应特异性信号如：物理刺激(热冲击基因)；光(RUBP羧化酶)；激素(Em)；代谢物；和应力，而用于进行基因表达。其它在植物中发挥功能的所需的转录和翻译元件也可以使用。
除了植物启动子之外，各种来源的启动子都能在植物细胞中有效使用而表达外源基因。例如，细菌源的启动子，如章鱼碱合酶(或真蛸碱合成酶，octopine synthase)启动子、胭脂氨酸合成酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒源的启动子，如花椰菜花叶病毒(35S和19S)等，都可以使用。
许多植物衍生的可食用疫苗目前已经发展为用于动物和人的病原体(Hood and Jilka，1999)。免疫应答也已经用以下物质口服免疫化而产生：产生类病毒粒子(VLP)的转基因植物、或显示抗原决定基的嵌合植物病毒(Modelska et al.，1998；Kapustra et al.，1999)。由之启示如下：这些VLP或嵌合病毒的粒子形式可以导致抗原在胃中更大的稳定性，有效地提高了在内脏中吸收的可利用的抗原的量(Modelska et al.1998)。
食物
在一个实施方式中，本发明的组合物是食物或食料。为本发明之目的，“食物”或“食料”包括人或动物(如，牛、马、山羊和绵羊)消耗的任何食物或制剂(包括肠或肠胃外的消耗)，当吸收到身体内之后，(a)起到供给营养或构建组织或供给能量；和/或(b)维持、储存或支持足够的营养状态或代谢功能。
食物包括对于具体用途所需的用量的营养物质如可食用常量营养物、维生素，和/或矿物质。这些成分的量将会根据组合物是否打算用于正常个体还是具有专用需求的个体所用，如患有代谢障碍等的个体，而进行变化。
具有营养价值的物质的实例包括但不限于，常量营养物如可食用脂肪、碳水化合物和蛋白质。这样的可食用脂肪的实例包括但不限于，椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑加伦油、豆油、和酸-和二酸-甘油酯。这样的碳水化合物的实例包括(但不限于)：葡萄糖、可食用乳糖、和水解淀粉。另外，在本发明的营养组合物中可以使用的蛋白质的实例包括(但不限于)大豆蛋白、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清、或这些蛋白的水解产物。
关于维生素和矿物质，以下可以添加到本发明的食物组合物中：钙、磷、钾、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘，以及维生素A、E、D、C、和B族复合物。也可以添加其它的这样的维生素和矿物质。
在本发明的食物组合物中可以利用的组分能够是半纯化的或纯化的来源。对于半纯化或纯化的物质，意指通过营养物质的纯化或通过从头合成(novo synthesis)制备的物质。
在一个实施方式中，本发明的多肽用于食物的生产中。例如含有本发明多肽的食物能够用于动物接种而通过细菌病原体表达具有毒素活性的多肽以提供对感染和/或群集的至少部分的保护作用。优选地，细菌病原体表达的多肽含有至少40％相同于SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。在一个实施方式中，细菌病原体来自于梭状芽孢杆菌属，例如，细菌病原体是产气荚膜梭菌。
在另一实施方式中，食物含有本发明的转基因植物，和/或所述植物的部分，和/或所述植物的提取物。
激动剂和拮抗剂-试验分析(或测定)和分子
本发明的多肽可以应用于该多肽的毒素活性的活化(激动剂)或抑制(拮抗剂)的化合物的筛选过程中。
潜在的拮抗剂的实例包括抗体、寡糖及其衍生物。潜在的拮抗剂包括结合于本发明的多肽使之无法接近该多肽的底物的小分子。小分子的实例包括但不限于，小肽或类肽分子。小分子可以模拟根据本发明多肽的底物的结构。
本发明还包括识别与具有毒素活性的多肽相互作用或抑制其生物活性(即，影响酶活性)的化合物的高通量筛选(HTS)分析法。HTS分析法容许以有效的方式筛选大量化合物。HTS分析法经设计而识别具有所需性能的“命中化合物”或“先导化合物”，这种先导化合物能够经过设计而改善所需的性能。对于“命中化合物”或“先导化合物”的化学改性(或修饰)经常基于“命中化合物”和毒素多肽之间的可识别结构/活性关系。
本发明多肽的拮抗剂通过将其添加到动物食物或饮料中可以用于保护动物免于生病。这种处理能够降低该动物暴露的活性环境衍生生物的负载。因此，本发明提供的食物和/或饮料含有本发明多肽的拮抗剂。拮抗剂可以是例如，结合本发明多肽的抗体。本发明还提供了含有这样的拮抗剂的食物和/或饮料用于降低动物被表达本发明多肽的细菌感染和/或群集的用途。
实施例
实施例1.产气荚膜梭菌NetB毒素
编码NetB基因的测序
将10μg从产气荚膜梭菌菌株EHE-NE18分离出来的染色体组DNA用于获得序列读取、重叠群和序列质量得分。氨基酸序列由核苷酸序列推断。信号肽的预测采用SignalP v 3.0程序实施(Bendtsen et al.，2004)。与所推断的氨基酸序列同源的序列采用gapped BLAST程序搜索(Altschul et al.，1997)。
编码NetB的基因的核苷酸序列按照SEQ ID NO：1提供，而包括信号序列的NetB的氨基酸序列按照SEQ ID NO：3提供。信号肽序列从成熟分泌的蛋白(SEQ ID NO：2)中切取。当与NetB共享同一性低于39％时，BLAST搜索识别产气荚膜梭菌β-毒素(图1)。
重组NetB的纯化和兔抗-rNetB抗血清的产生
将netB基因进行PCR扩增并克隆入pENTR/SD/D-TOPO，并从框架中亚克隆入表达载体pDest41BA。蛋白在镍亲合柱上接着通过凝胶过滤(S200)而进行纯化。将峰组分汇集并进行TEV裂解，而重新载入到镍柱上以除去未裂解的蛋白和TEV。将重组蛋白(～1.3mg)送入Chemicon而进行抗体生产(Chemicon-Millipore，CA，USA)。将抗-rNetB抗血清用于产气荚膜梭菌菌株的免疫印迹分析(或蛋白质印迹分析)和中和研究中。
天然NetB纯化
产气荚膜梭菌EHE-NE18在TPG汤内生长直至OD600nm为0.6。通过以18000g的转速在4℃下离心15min而获取培养基上清液(3L)。采用超滤(Amicon 8400)通过10kDa膜(YM10-76mm，Amicon)将上清液浓缩×5倍，接着在4℃下用40％(w/v)的(NH4)2SO4沉淀过夜，并通过以18000g转速在4℃下离心2h来分离。将含有毒素的沉淀物浓缩20倍(总共100倍)并在48h内于4℃下用pH 7.2的10mM Tris-HCl透析。将蛋白在琼脂糖Sepharose Q FF(GE)阴离子交换树脂中用Tris缓冲液(pH8.5)进行色谱分离，并流过收集。
实施例2.缺乏毒素的产气荚膜梭菌突变菌株的产生
根据标准技术实施DNA操作。在自杀质粒的构建中所使用的寡核苷酸是AKP60(SEQ ID NO：7)、AKP61(SEQ ID NO：8)、AKP58(SEQ ID NO：9)和AKP59(SEQ ID NO：1 0)。将所有的扩增产物都克隆入克隆载体-T Easy载体系统(Promega)，随后按需进行亚克隆。标记的、部分删除(或缺失)、自杀质粒，pALK16，通过在pALK1内catP盒的任意一侧上克隆netB基因区域的片段进行构建。首先，将采用AKP60和AKP61扩增的1490 bp MfeI-SpeI片段定向克隆入pALK1的EcoRI-SpeI位点，接着，将采用AKP58和AKP59扩增的1937 bp BamHI-NheI片段克隆入所得质粒的BamHI-NheI位点。最后，将由pJIR1457扩增的ermB和oriT钝端(blunt end)克隆入SmaI位点。将最终的自杀质粒pALK16如先前所描述地引入到产气荚膜梭菌菌株EHE-NE18中(Scott and Rood，(1989))。在37℃下于用甲砜霉素补充的TSC上生长后，将菌落交叉贴到用红霉素补充的TSC上而证实双交叉事件已经发生。在合适抗生素上生长的菌落经过选择而用于进一步分析。制备染色体DNA后，采用PCR和DNA印迹分析而证实突变体衍生于netB基因区域中的双交叉事件。将互补质粒，pALK20，通过将全长netB基因克隆入产气荚膜梭菌穿梭载体pJIR1457而引入到两个突变体中。采用细胞毒性分析(或测定)中的红霉素选择和试验来证实互补。NE18-ΔnetB染色体区域的示意图如图2所示。
实施例3.NetB活性分析
细胞毒性分析在产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液上实施。将LMH细胞培养直至在0.2％白明胶涂覆并在37℃下于EMEM介质中生长的24孔板中达到70％汇合。将培养基上清液加入到整个孔板用2倍稀释的介质中高达1∶32，并在37℃下孵育达16h。将LMH细胞在纯的TPG培养介质(图3a)；产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液，1∶16稀释(图3b)；产气荚膜梭菌JIR325非-坏疽肠炎菌株13培养基上清液，1∶2稀释(图3c)；或产气荚膜梭菌NE18-M1(plc突变体不表达α-毒素)培养基上清液，1∶16稀释(图3d)存在下培养。在100×放大倍数的光学显微镜下观察细胞变性效应(CPE)。
正常细胞(图3a)看起来是健康的，然而，添加产生NetB的菌株的培养基上清液导致细胞圆形收拢(round-up)而死亡(图3b)。并不表达NetB的菌株的上清液不感染细胞(图3c)。删除(或缺失)α-毒素基因并未影响培养基上清液杀死细胞的能力(图3d)。
实施例4.产气荚膜梭菌NetB毒素突变体的互补
NE18-缺失(或删除)的netB1菌株(netB阴性菌株)用pALK20netB互补质粒补充。然后对互补的产气荚膜梭菌菌株测试毒素活性。对于细胞毒性分析，将LMH细胞培养直至在以0.2％白明胶涂覆并在37℃下于EMEM介质中生长的24孔板中达到70％汇合。将培养基上清液加入到整个孔板用2倍稀释的介质中高达1∶32，并在37℃下孵育达16h。将LMH细胞用以下培养液的任一种孵育：EHE-NE18培养基上清液，1∶16稀释(图4a)；NE18-缺失的netB1培养基上清液，1∶2稀释(图4b)；NE18-缺失的netB1+pJIR1457(穿梭质粒)培养基上清液，1∶2稀释(图4c)；NE18-缺失netB1+pALK20(netB互补质粒)培养基上清液，1∶16稀释(图4d)；纯TPG培养基介质(图4e)；或柱纯化重组NetB，1∶8稀释(图4d)。
netB基因的缺失(或删除)消除了在细胞培养基分析中的杀灭活性。具有克隆到质粒上的基因的突变体的互补作用恢复了杀灭活性。重组NetB蛋白杀死了培养的细胞。
实施例5.由毒素蛋白杀死的细胞的定量分析
为了测定NetB杀死细胞的能力，在用NetB处理的LMH细胞上实施乳酸脱氢酶细胞毒性分析。将LMH细胞培养直至在以0.2％白明胶涂覆并在37℃下于EMEM介质中生长的96孔板中达到70％汇合。将来自NE18-M1的半纯化NetB加入到整个孔板用2倍稀释的介质中高达1∶128，并在37℃下孵育4h。将在上清液中释放的LDH作为细胞溶解的指示剂(或指征)采用Cyto-Tox(Promega)试剂盒进行测定，而以细胞毒性百分数给出。每次稀释按一式三份完成，对每次稀释计算SEM(图5)。
实施例6.在家鸡疾病模型中的netB突变菌株
将20和2 1天龄的11只鸟组用产气荚膜梭菌(NE18)野生型菌株或netB缺失的菌株的突变体(NE18-NetB-M1和NE18-NetB-M2)进行免疫性试验(challenge)。在24天龄，将鸟尸体解剖而对肠道中的坏疽病变打分。将测定的约2～4cm的回肠或空肠的片段收集到10％中性磷酸钠缓冲的福尔马林中。将小肠样品以4mm的间隔截取(cross-sectioned)，并将片段加工处理成石蜡嵌埋块用于常规组织学分析，并以4～5μm切割并用苏木精和署红(HE)染色。将组织学载玻片通过光学显微镜检测。对肠道根据坏疽病变的数目进行评分：0-没有病变，1-薄壁化和易碎肠，2-病灶性坏死或溃疡(1～5个病灶)，3-病灶性坏死或溃疡(6～15个病灶)，4-病灶性坏死或溃疡(16或更多个病灶)，5-坏疽块2～3cm长，6-弥漫性坏死典型现场病例。野生型菌株显示出显著的致病水平，而独立地分离突变体二者都未显示出任何致病迹象。我们推断，NetB是疾病发病机理中必要的关键毒性因子。
表2 NetB突变体菌株在家鸡疾病模型中具有下降的毒性
实施例7.产气荚膜梭菌菌株中毒素的观测
对于产气荚膜梭菌菌株中毒素的PCR观测
通过PCR研究了netB基因在产气荚膜梭菌的NE和非-NE菌株中的存在。对于试验的每一产气荚膜梭菌菌株，将单菌落悬浮于0.1mL蒸馏水中并煮沸10min，然后以10000g离心10min。收集上清液并用作PCR中的模板DNA。PCR在含有以下物质的总量为25μL反应混合物中实施：1×PCR缓冲液(无Mg2+)；2.5mM MgCl2；0.2mM dNTP混合物；2.5单位的Go Taq DNA聚合物酶(Promega)；50Pm的引物AKP78和AKP79；以及5μL模板溶液。以下条件用于PCR中：在94℃下变性2min；在94℃下变性30s的35个循环；在55℃下退火30s；和在72℃下延伸1min；在72℃下最后延伸12min。将PCR产物通过在如图6所示的1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离而进行分析：a.NE菌株；b.Non-NE菌株。在从坏疽肠炎病家鸡中分离出来的大多数产气荚膜梭菌菌株中都看到了384bpnetB片段。在任何其它菌株中都没有观察到netB特异性PCR片段。这表明netB基因的存在是家鸡中产气荚膜梭菌毒性的良好指示剂(或指征)，而这种分析法能够用于检测潜在的毒性菌株。
对于在产气荚膜梭菌菌株中毒素存在的免疫蛋白印迹观测
产气荚膜梭菌菌株在预煮沸的TPG汤内生长直至OD600nm为～0.6。培养基上清液通过以18000g离心10min后获得。将上清液通过SDS-PAGE(Novex 4-12％Bis-Tris gel，Invitrogen)在MES SDS工作缓冲液(MES SDS Running Buffer，Invitrogen)中分离。将蛋白转移到PDVF(Millipore)膜上并用兔多克隆抗-rNetB抗体(Chemicon，USA)探测。将印迹用ECL蛋白质印迹试剂盒(Amersham Biosciences，NJ，USA)显影，如图7所示将结果记录于自体放射照相胶片上。括号表示NE和非-NE产气荚膜梭菌菌株。蛋白质印迹试验结果证明了PCR观测结果-基因和蛋白出现在大多数NE衍生菌株而不是非-NE菌株中。这种基于抗体的检测方法是检测潜在毒性菌株的另一途径。
实施例8.重组NetB子单元疫苗的保护效能
重组NetB蛋白(SEQ ID NO：2)的效能当作为子单元疫苗递送时在接种试验中进行测试。
接种试验1193-4
将Ross 308肉鸡(Aviagen)用50μg作为每剂量抗原的重组NetB/以0.5mL氢氧化铝作为佐剂进行接种。这种家禽以7天和14天接种，而以20天和21天用1.5mL口服剂量的产气荚膜梭菌菌株EHE-NE18进行免疫性试验。为了提高这种家禽对坏疽肠炎的易感性，在免疫性试验期间对其喂食含有鱼肉的高蛋白饮食。在第25天这些家禽进行安乐死并尸检以对坏疽肠炎肠道病变打分。
病变根据以下方案打分：
0  没有病变
1  薄壁化易碎肠
2  病灶性坏死或溃疡(1～5个病灶)
3  病灶性坏死或溃疡(6～15个病灶)
4  病灶性坏死或溃疡(16或更多个病灶)
5  坏疽块2～3cm长
6  弥漫性坏死的典型现场病例
结果
用NetB重组抗原接种的家鸡和佐剂对照家鸡的平均病变得分提供于表3中。
表3.用NetB重组抗原接种的家鸡的平均病变得分
分组 家禽数量 平均病变得分 感染数量(标准化至10组) 平均得分×数量(标准化至10组)
佐剂对照(NE18免疫性试验) 27 1.74 5.93 12.37
NetB接种的(NE18免疫性试验) 18 0.21 2.1 0.46
采用Mann-Whitney检验进行病变得分的统计分析，表明NetB接种分组和佐剂对照分组之间的差异在大于95％的置信度下是统计显著性的。
实施例9.来自接种家禽血清的蛋白质印迹分析
来自接种家鸡的血清通过蛋白质印迹法分析而确定家鸡是否对NetB蛋白产生了血清抗体。在每孔聚丙烯酰胺凝胶中上样4μg的重组NetB抗原并进行SDS-PAGE。将蛋白通过蛋白质印迹转移到PVDF膜中。将来自接种家禽的血清在5％脱脂奶于TBS/0.5％吐温20中稀释1∶1000，并用膜在室温下孵育1h。将膜用TBS/0.5％Tween 20冲洗3次，并随后用在5％脱脂奶于TBS/0.5％吐温20中稀释1∶10,000的山羊抗家鸡HRP抗体(KPL；Cat#14-24-06；Lot#050860)室温下孵育1h。随后，将孵育的膜用TBS/0.5％吐温20冲洗3次。用GE Healthcare ECL蛋白质印迹试剂(Cat#RPN2106)根据厂商说明书检测HRP-标记的二抗。用重组NetB接种的大多数家禽都对NetB蛋白产生了血清抗体(图8)，这表明所使用的疫苗能够诱发对NetB抗原的显著免疫应答。
实施例10.接种和免疫性试验程序的重复
接种试验1219-1
对在试验1193-4中产生的结果通过采用单独制备的各批重组NetB蛋白重复接种和免疫性试验程序而测试再现性。将重复试验的结果提供于表4中。
表4.NetB接种组对佐剂对照
  分组   家禽数量   平均病变得分   感染数量   平均得分×数量(标准化至组10)
  佐剂对照(NE18免疫性试验)   9   2.33   7   18.1
  NetB接种(NE18免疫性试验)   11   0.64   3   1.74
采用Mann-Whitney检验进行病变得分的统计分析，表明NetB接种分组和佐剂对照分组之间的差异在大于95％的置信度下是统计显著性的。
接种试验1250-1
按照前述试验采用相同的接种和免疫性试验方案，在尸检时测定家禽的活体体重。将每一阴性对照、阳性对照和NetB接种家禽的平均重量提供于表5中。
表5.NetB接种家禽的活体体重对阳性对照分组的活体体重
  分组 家禽数 平均重量(g)   标准偏差(Std.Dev.)(g)
  阴性对照(无免疫性试验)   23   930   105.5
  阳性对照(NE18免疫性试验)   22   798   107.5
  NetB接种(NE18免疫性试验)   22   914   85.7
采用家禽重量的未配对t-检验进行统计分析，表明NetB接种分组和阳性对照分组在大于99％的置信度(P＝0.0004685)下重量差异是统计学显著性的。接种家禽受到保护而免于在未受保护、阳性对照免疫性试验家禽中所见的体重增益的限制。
实施例11.可替代NetB基疫苗的保护效能
在接种试验1250-1中，对许多可替代疫苗进行了试验。可替代疫苗有：菌苗+NetB；表达NetB的大肠杆菌活体载体；和活体产气荚膜梭菌(netB缺失体)。以下描述可替代疫苗，而接种家禽的活体体重对阳性对照组的活体体重提供于表6中。
菌苗+NetB
制备产气荚膜梭菌菌株EHE-NE18(400ml TPG)的过夜培养基。将培养基离心，并保留细胞颗粒和上清液部分。将细胞颗粒再悬浮于20Ml的磷酸盐缓冲的盐水中，超声破碎细胞，然后用0.3％的甲醛处理。将上清液通过超滤浓缩至20mL，然后用0.3％的甲醛处理。将所处理的细胞颗粒、上清液和佐剂溶液等体积混合并加入重组NetB蛋白至最终浓度为100μg/mL。采用每只家禽每次接种为皮下接种0.5mL如此配制的疫苗。
表达NetB的大肠杆菌活体载体
将大肠杆菌菌株CCEC31rn(如WO 2007/025333中所描述的)采用表达来自其天然启动子的netB的质粒来转化。NetB由该质粒组成性地表达。在第2天使每只家禽口服剂量为0.5mL的过夜培养基(Luria汤)。
活体产气荚膜梭菌(netB缺失体)
将产气荚膜梭菌EHE-NE18的netB缺失突变体衍生物在液体巯基醋酸盐(thoiglylate)汤中生长，并对2天龄家禽口服接种0.5mL。
表6.接种家禽的活体体重对阳性对照分组的活体体重
分组   家禽数 平均重量(g)   标准偏差(Std.Dev.)(g)
  菌苗+NetB   21   895   97
  表达NetB的活体大肠杆菌载体   23   877   127.5
  活体产气荚膜梭菌(netB缺失体)   23   924   101
采用家禽重量的未配对t-检验进行统计分析，表明菌苗+NetB接种分组和阳性对照分组在大于99％的置信度(P＝0.003879)下重量差异是统计学显著性的，表达NetB的大肠杆菌活体载体接种分组和阳性对照分组在大于95％的置信度(P＝0.0217605)下重量差异是统计学显著性的，而用缺失netB基因接种的活体产气荚膜梭菌接种分组和阳性对照分组在大于99％的置信度(P＝0.0003855)下重量差异是统计学显著性的。这些结果表明不同的疫苗都能保护家禽免于在未接种的免疫性试验家禽中所见的体重增益的限制。
在本领域的技术人员应该理解到，对本发明可以作出如具体实施方式所示的各种变化和/或修改，而不偏离广泛描述的本发明的精神或范围。因此，本发明的实施方式应该被当作各个方面的举例说明，而不是限制性的。
本文中所讨论的和/或参考的所有出版物都以其全文结合于此。
本申请要求享有美国专利US 60/942,858的优先权，将其全部内容结合于此作为参考。
任何已经包含于本说明书中的文档、行为、物质、设备、制品等的讨论都是作为单独目的提供于本发明的上下文。这不能以此为允诺，因为这在本申请的每一权利要求的优先权日之前都业已存在，任何或所有这些物质构成现有技术基础的一部分或在关于本发明的领域内是常用的一般性知识。
参考文献
Altschul，et al.(1997)Nucleic Acids Res，25：3389-3402.
Awad，et al.(1995)Mol Microbiol，15：191-202.
Bendtsen，et al.(2004)J Mol Biol，340：783-795.
Bhugaloo-Vial，et al.(1996)Appl Environ Microbiol，62：4410-4416.
Boman，(1995)Annu Rev Immunol，13：61-92.
Boman，(2003)J Intern Med，254：197-215.
Cardoso，et al.(1996).Virology，225：293-9.
Cho，et al.(2000)Curr Microbiol，40：257-263.
Conry，et al.(1994).Cancer Research，54：1164-68.
Cowen，et al.(1987)Avian Dis，31：904-906.
Craven，et al.(1999)Avian Dis，43：484-490.
Ennahar et al.(2000)FEMS Microbiol Rev，24：85-106.
Fynan，et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA，90：11478-82.
Gabay，et al(1989)Proc Natl Acad Sci USA，86：10183.
Gruber et al.(1994)J Immunol 152：5368.
Harayama，(1998)Trends Biotechnol，16：76-82.
Hollinger et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-6448.
Hood and Jilka(1999)Current Opinions in Biotechnology，10：382-6.
Ingham，et al.(2003)J Antimicrob Chemother，51：1365-1371.
Jack，et al.(1995)Microbiol Rev，59：171-200.
Kaldhusdal，(1999) FEMS Immunol Med Microbiol，24：337-343.
Kapustra，et al.(1999)FASEB Journal，13：1796-99.
Kozbor et al.(1985)J Immunol Methods，81：31-42.
Liu，et al.(2005)Appl Environ Microbiol，71：6769-6775.
Milstein and Cuello，(1983)Nature，305：537-539.
Modelska，et al.(1998).Proc Natl Acad Sci USA，95：2481-85.
Montgomery，et al.(1993)DNA and Cell Biology，12：777-83.
Morrison(1994)Nature 368：812-13.
Munson and Pollard，(1980)Anal Biochem，107：220.
Myers and Miller(1989)CABIOS，4：11-17.
Nahashon，et al.(1994)Poult Sci，73：1552-1562.
Needleman，and Wunsch，(1970)J Mol Biol，48：443-453.
Palacios，et al.(2005)J Appl Microbiol，98：229-237.
Scott and Rood(1989)Gene，82：327-333.
Songer，et al.(1997)Trends Microbiol，5：156-161.
Soravia，et al.(1988) FEBS Lett，228：337-340.
Traunecker et al.(1991)EMBO J，10：3655-3659.
Tschirdewahn，et al.(1991)Int J Food Microbiol，14：175-178.
Tutt et al.(1991)J Immunol 147：60.
Vohra and Satyanarayana，(2003)Crit Rev Biotechnol，23：29-60.
Wahl，et al.(1987)Methods Enzymol，152：399-407.
Yang，et al.(1997)Vaccine，15：888-91。
序列表
P29952FRAC ST25
SEQUENCE LISTING
 
<110>澳大利亚家禽CRC私人有限公司(Australian Poultry CRC Pty Ltd)
 
<120>梭菌毒素NETB
 
<130>P29952FRAC
 
<150>US 60/942,858
<151>2007-06-08
 
<160>10
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>1320
<212>DNA
<213>产气荚膜梭菌
 
<400>1
atcattttac aagtttaact tgattattac ttatttttgc ataaatttta ataaaattta     60
tgcaaaaata gaatttaaaa tagattttta taatttttta taaattaaga atactaaaca    120
aaaaaccagt tatgtataaa ttttgaccag ttttaccaaa gttattgaaa atatcaaata    180
aacaagtgat aataactata ataatattat aaaggaggaa ttattttgaa aagattaaaa    240
attatttcaa ttacactagt tcttacaagt gtaattagta caagcctttt ttcaactcaa    300
actcaagttt ttgcaagtga attaaatgac ataaacaaaa ttgagttgaa aaatctaagt    360
ggagaaataa taaaagaaaa tggaaaggaa gctattaaat atacttctag tgataccgct    420
tcacataaag gttggaaggc aactttaagt ggaacattta ttgaagatcc tcattctgat    480
aagaaaactg ctttattaaa tttagaagga tttatacctt ctgataaaca gatttttggt    540
tctaaatatt acggaaaaat gaaatggcct gaaacttata gaattaatgt aaaaagtgct    600
gatgtaaata ataatataaa aatagcaaat tctattccta aaaatactat agataaaaaa    660
gatgtatcta attcaattgg ttattctata ggcggtaata tatctgttga aggaaaaact    720
gctggtgctg gaataaatgc ttcatataat gtccaaaata ctataagcta tgaacaacct    780
gattttagaa caattcaaag aaaagatgat gcaaatttag catcatggga tataaaattt    840
gttgagacta aggacggtta taatatagat tcttatcatg ctatttatgg aaatcaatta    900
ttcatgaaat caagattgta taataatggt gataaaaatt tcacagatga tagagattta    960
tcaacattaa tttctggtgg attttcaccc aatatggctt tagcattaac agcacctaaa   1020
aatgctaaag aatctgtaat aatagttgaa tatcaaagat ttgataatga ctatatttta   1080
aattgggaaa ctactcaatg gcgaggaaca aacaaacttt cgtcaacaag tgaatataac   1140
gaatttatgt ttaaaataaa ttggcaagat cataaaatag aatattatct gtaatttaat   1200
attttatttt tataagtttg attaatttac aatatgattt gatttcttac aagttaatca   1260
aagatatcaa taaataaatt gtttttatta gaataatcat taatattaaa attggacaat   1320
 
<210>2
<211>292
<212>PRT
<213>产气荚膜梭菌
 
<400>2
Ser Glu Leu Asn Asp Ile Asn Lys Ile Glu Leu Lys Asn Leu Ser Gly
1               5                   10                  15
Glu Ile Ile Lys Glu Asn Gly Lys Glu Ala Ile Lys Tyr Thr Ser Ser
            20                  25                   30
Asp Thr Ala Ser His Lys Gly Trp Lys Ala Thr Leu Ser Gly Thr Phe
        35                  40                  45
Ile Glu Asp Pro His Ser Asp Lys Lys Thr Ala Leu Leu Asn Leu Glu
    50                  55                  60
Gly Phe Ile Pro Ser Asp Lys Gln Ile Phe Gly Ser Lys Tyr Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Lys Met Lys Trp Pro Glu Thr Tyr Arg Ile Asn Val Lys Ser Ala Asp
                85                  90                  95
Val Asn Asn Asn Ile Lys Ile Ala Asn Ser Ile Pro Lys Asn Thr Ile
            100                 105                 110
Asp Lys Lys Asp Val Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Asn
        115                 120                 125
Ile Ser Val Glu Gly Lys Thr Ala Gly Ala Gly Ile Asn Ala Ser Tyr
    130                 135                 140
Asn Val Gln Asn Thr Ile Ser Tyr Glu Gln Pro Asp Phe Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Gln Arg Lys Asp Asp Ala Asn Leu Ala Ser Trp Asp Ile Lys Phe Val
                165                 170                 175
Glu Thr Lys Asp Gly Tyr Asn Ile Asp Ser Tyr His Ala Ile Tyr Gly
            180                 185                 190
Asn Gln Leu Phe Met Lys Ser Arg Leu Tyr Asn Asn Gly Asp Lys Asn
        195                 200                 205
Phe Thr Asp Asp Arg Asp Leu Ser Thr Leu Ile Ser Gly G1y Phe Ser
    210                 215                 220
Pro Asn Met Ala Leu Ala Leu Thr Ala Pro Lys Asn Ala Lys Glu Ser
225                 230                 235                 240
Val Ile Ile Val Glu Tyr Gln Arg Phe Asp Asn Asp Tyr Ile Leu Asn
                245                 250                 255
Trp Glu Thr Thr Gln Trp Arg Gly Thr Ash Lys Leu Ser Ser Thr Ser
            260                 265                 270
Glu Tyr Asn Glu Phe Met Phe Lys Ile Asn Trp Gln Asp His Lys Ile
        275                 280                 285
Glu Tyr Tyr Leu
290
 
<210>3
<211>322
<212>PRT
<213>产气荚膜梭菌
 
<400>3
Leu Lys Arg Leu Lys Ile Ile Ser Ile Thr Leu Val Leu Thr Ser Val
1               5                   10                  15
Ile Ser Thr Ser Leu Phe Ser Thr Gln Thr Gln Val Phe Ala Ser Glu
            20                  25                  30
Leu Asn Asp Ile Asn Lys Ile Glu Leu Lys Asn Leu Ser Gly Glu Ile
        35                  40                  45
Ile Lys Glu Asn Gly Lys Glu Ala Ile Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Thr
    50                   55                  60
Ala Ser His Lys Gly Trp Lys Ala Thr Leu Ser Gly Thr Phe Ile Glu
65                  70                  75                  80
Asp Pro His Ser Asp Lys Lys Thr Ala Leu Leu Asn Leu Glu Gly Phe
                85                  90                  95
Ile Pro Ser Asp Lys Gln Ile Phe Gly Ser Lys Tyr Tyr Gly Lys Met
            100                 105                 110
Lys Trp Pro Glu Thr Tyr Arg Ile Asn Val Lys Ser Ala Asp Val Asn
        115                 120                 125
Asn Asn Ile Lys Ile Ala Asn Ser Ile Pro Lys Asn Thr Ile Asp Lys
    130                 135                 140
Lys Asp Val Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Asn Ile Ser
145                 150                 155                 160
Val Glu Gly Lys Thr Ala Gly Ala Gly Ile Asn Ala Ser Tyr Asn Val
                165                 170                 175
Gln Asn Thr Ile Ser Tyr Glu Gln Pro Asp Phe Arg Thr Ile Gln Arg
            180                 185                 190
Lys Asp Asp Ala Asn Leu Ala Ser Trp Asp Ile Lys Phe Val Glu Thr
        195                 200                 205
Lys Asp Gly Tyr Asn Ile Asp Ser Tyr His Ala Ile Tyr Gly Asn Gln
    210                 215                 220
Leu Phe Met Lys Ser Arg Leu Tyr Asn Asn Gly Asp Lys Asn Phe Thr
225                 230                 235                 240
Asp Asp Arg Asp Leu Ser Thr Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ser Pro Asn
                245                 250                 255
Met Ala Leu Ala Leu Thr Ala Pro Lys Asn Ala Lys Glu Ser Val Ile
            260                 265                 270
Ile Val Glu Tyr Gln Arg Phe Asp Asn Asp Tyr Ile Leu Asn Trp Glu
        275                 280                 285
Thr Thr Gln Trp Arg Gly Thr Asn Lys Leu Ser Ser Thr Ser Glu Tyr
    290                 295                 300
Asn Glu Phe Met Phe Lys Ile Asn Trp Gln Asp His Lys Ile Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Tyr Leu
 
<210>4
<211>336
<212>PRT
<213>产气荚膜梭菌
 
<400>4
Met Lys Lys Lys Phe Ile Ser Leu Val Ile Val Ser Ser Leu Leu Asn
1               5                   10                  15
Gly Cys Leu Leu Ser Pro Thr Leu Val Tyr Ala Asn Asp Ile Gly Lys
            20                   25                 30
Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp Gly Tyr Thr Ile Ile
        35                  40                  45
Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Ser Val Asp Ser Ser
    50                  55                  60
Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile Asp Ala Arg Phe Ile
65                  70                  75                   80
Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu Ile Asn Leu Thr Gly
                85                   90                 95
Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys Lys Tyr Asn Leu His
            100                 105                 110
Asp Val Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro Val Arg Tyr Ser Ile
        115                 120                 125
Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val Lys Ile Val Asp Ser
    130                 135                 140
Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val Ser Asn Thr Met Gly
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Lys Asn Lys Pro Lys Ala
            165                     170                 175
Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Ile Glu Tyr Val Gln
            180                 185                 190
Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser Thr Ser Lys Ala Ser
        195                 200                 205
Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly Asn Tyr Asn Leu Lys
    210                 215                 220
Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe Met Tyr Gly Arg Tyr
225                 230                 235                 240
Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro Asp Tyr Gln Met Ser
                245                 250                 255
Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met Ser Val Val Leu Thr
            260                 265                 270
Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys Val Lys Met Glu Arg
        275                 280                 285
Glu Arg Asn Cys Tyr Tyr Leu Asn Trp Asn Gly Ala Asn Trp Val Gly
    290                 295                 300
Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro Asn Val Asp Ser His
305                 310                 315                 320
Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His Lys Val Thr Ala Ile
                325                 330                 335
 
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>5
gctggtgctg gaataaatgc                                                20
 
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>6
tcgccattga gtagtttccc                                                20
 
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>7
gcaattggca agatcataaa atagaa                    26
 
<210>8
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>8
ccctaggtat tttcttatcg ctacttg                   27
 
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>9
gggatccaat tgtaaacatt cctgata                   27
 
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>寡核苷酸引物
 
<400>10
agctagctat tattatttac atcagcactt t              31

Claims (18)

1.一种纯化的多肽，其中所述多肽由按照SEQ ID NO:2提供的氨基酸序列构成。
2.一种分离的多核苷酸，编码根据权利要求1的多肽。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种载体，含有根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接于启动子。
5.根据权利要求4所述的载体，其是一种病毒载体或质粒载体。
6.一种宿主细胞，转化有根据权利要求2或权利要求3的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其是一种细菌。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述细菌是大肠杆菌。
9.一种用于生产根据权利要求1所述的多肽的方法，所述方法包括对根据权利要求6至8任一项所述的宿主细胞在容许表达编码所述多肽的所述多核苷酸的条件下进行培养。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括纯化所述多肽。
11.一种免疫原的组合物，含有根据权利要求1所述的多肽和/或根据权利要求6至8任一项所述的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的免疫原的组合物，进一步含有佐剂和/或药用载体。
13.一种含有抗原的疫苗，其中所述抗原由根据权利要求1所述的多肽构成。
14.根据权利要求13所述的疫苗，进一步含有佐剂和/或药用载体。
15.根据权利要求1所述的多肽、根据权利要求6至8任一项所述的宿主细胞、和/或根据权利要求13或14所述的疫苗在制备用于提高受试者体内免疫应答的药物中的用途。
16.根据权利要求11或权利要求12所述的组合物在制备用于提高受试者体内免疫应答的药物中的用途。
17.一种筛选用于调节根据权利要求1的多肽的活性的激动剂的方法，所述方法包括将所述多肽与候选化合物接触，并确定所述化合物是否增加所述多肽的毒素活性。
18.一种筛选用于调节根据权利要求1的多肽的活性的拮抗剂的方法，所述方法包括将所述多肽与候选化合物接触，并确定所述化合物是否减少所述多肽的毒素活性。
CN200880019023.XA 2007-06-08 2008-06-06 梭菌毒素netb Active CN101903399B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94285807P 2007-06-08 2007-06-08
US60/942,858 2007-06-08
PCT/AU2008/000813 WO2008148166A1 (en) 2007-06-08 2008-06-06 Clostridial toxin netb

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101903399A CN101903399A (zh) 2010-12-01
CN101903399B true CN101903399B (zh) 2014-09-10

Family

ID=40093085

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880019023.XA Active CN101903399B (zh) 2007-06-08 2008-06-06 梭菌毒素netb

Country Status (14)

Country Link
US (1) US8263088B2 (zh)
EP (2) EP2164862B1 (zh)
JP (2) JP5901115B2 (zh)
CN (1) CN101903399B (zh)
AU (1) AU2008258277B2 (zh)
BR (1) BRPI0812346B1 (zh)
CA (1) CA2689302C (zh)
ES (1) ES2550685T3 (zh)
HU (1) HUE025717T2 (zh)
MX (1) MX2009012924A (zh)
PL (1) PL2164862T3 (zh)
PT (1) PT2164862E (zh)
RU (1) RU2474587C2 (zh)
WO (1) WO2008148166A1 (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2391640B1 (en) * 2009-01-30 2014-05-14 Intervet International B.V. A clostridium chauvoei polypeptide, dna encoding the polypeptide and a vaccine comprising the polypeptide
WO2011113801A1 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Universiteit Gent Use of clostridium perfringens strain 23 to protect against necrotic enteritis
US10174086B2 (en) 2011-10-25 2019-01-08 University Of Exeter Vaccine
GB201118394D0 (en) 2011-10-25 2011-12-07 Univ Exeter Vaccine
KR101293667B1 (ko) 2011-11-16 2013-08-07 대한민국 닭의 괴사성 장염을 예방하는 백신 조성물
AU2013239465B2 (en) 2012-03-29 2017-04-20 One Health Ventures Limited Epsilon toxin epitopes from clostridium perfringens with reduced toxicity
CA2874191A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 University Of Guelph A novel toxin in type a clostridium perfringens
GB201322463D0 (en) * 2013-12-18 2014-02-05 Univ Exeter Composition
CA2901333C (en) 2014-08-22 2023-08-22 University Of Guelph Novel toxins in type a clostridium perfringens
EP3112474A1 (en) * 2015-06-29 2017-01-04 Evonik Degussa GmbH Method of detecting avian necrotic enteritis
KR20200006108A (ko) * 2017-05-12 2020-01-17 에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하 동물에서 씨. 퍼프린젠스 유발된 질환을 검출하는 방법
WO2018206690A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Evonik Degussa Gmbh Method for detecting c. perfringens induced diseases in animals
EP3630800A4 (en) * 2017-05-31 2021-03-24 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food VACCINE AGAINST NECROTIC ENTERITIS IN POULTRY
US12031991B2 (en) 2018-03-02 2024-07-09 Evonik Operations Gmbh In vitro method for detecting intestinal barrier failure in animals
KR20210014136A (ko) * 2018-05-29 2021-02-08 에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하 동물 집단에서의 병원체 부하를 모니터링하기 위한 시험관내 방법
HUE064250T2 (hu) * 2018-06-15 2024-02-28 Evonik Operations Gmbh Eljárás madárpopulációban elhalásosbélgyulladás-járvány korai kimutatására
EP3818079A4 (en) * 2018-07-05 2022-04-06 Novobind Livestock Therapeutics Inc. ANTIBODIES AGAINST POULTRY PATHOGENS AND THEIR USE
KR102207354B1 (ko) * 2019-09-02 2021-01-27 (주)제이비바이오텍 CRISPR/Cas9 기반 Bacillus subtilis 유전체 편집 메커니즘을 이용한 닭의 괴사성장염 백신
US11381146B2 (en) 2019-09-04 2022-07-05 Nti Ag Drive device having a tubular linear motor and a stainless steel casing
CN113717292B (zh) * 2021-09-27 2023-04-21 华中农业大学 一种针对鸡坏死性肠炎的融合蛋白疫苗及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1215729A (zh) * 1997-06-20 1999-05-05 阿克佐诺贝尔公司 产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗
WO2003096812A1 (en) * 2002-04-15 2003-11-27 Washington University Regulated attenuation of live vaccines to enhance cross protective immunogenicity
WO2005047458A2 (en) * 2003-06-18 2005-05-26 Genelux Corporation Modified recombinant vaccina viruses and other microorganisms, uses thereof

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
AU7360087A (en) 1986-04-30 1987-11-24 Boyce Thompson Institute For Plant Research Inc. Electric field mediated dna transformation of plant cells and organelles
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
US4903635A (en) 1986-07-02 1990-02-27 Embrex, Inc. High speed automated injection system for avian embryos
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5141131A (en) 1989-06-30 1992-08-25 Dowelanco Method and apparatus for the acceleration of a propellable matter
US5056464A (en) 1990-01-18 1991-10-15 Embrex, Inc. Automated injection system for avian embryos with advanced fluid delivery system
AU8914291A (en) 1990-11-23 1992-06-25 Plant Genetic Systems N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
US5136979A (en) 1991-09-25 1992-08-11 Embrex, Inc. Modular injection system for avian embryos
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
WO1993021335A2 (en) 1992-04-15 1993-10-28 Plant Genetic Systems, N.V. Transformation of monocot cells
PT639640E (pt) 1993-07-30 2001-03-30 Akzo Nobel Nv Vacina para aves domesticas com infeccoes provocadas pela estirpe 4/91 do virus da bronquite
DE69536091D1 (de) 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
EP0750907B1 (en) * 1995-06-30 2002-03-20 American Cyanamid Company Stable macrolide and macrolide vaccine compositions
US5792294A (en) 1995-11-16 1998-08-11 Otis Elevator Company Method of replacing sheave liner
US5939400A (en) 1996-02-26 1999-08-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University DNA vaccination for induction of suppressive T cell response
GB9605222D0 (en) * 1996-03-12 1996-05-15 Secr Defence Clostridium perfringens epsilon toxin vaccines
WO1997044446A1 (en) 1996-05-24 1997-11-27 University Of Maryland At Baltimore Dna vaccines for eliciting a mucosal immune response
ES2357495T3 (es) 1997-10-16 2011-04-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Aves transgénicas y producción de proteína.
UA78486C2 (uk) * 1999-12-10 2007-04-10 Хемджен Корпорейшн Композиція для перорального введення птахам та тваринам для лікування або зниження ризику інфекції травного тракту (варіанти), її застосування (варіанти) та спосіб лікування або зниження ризику інфекцій травного тракту (варіанти)
US20040101531A1 (en) * 2002-04-16 2004-05-27 Roy Curtiss Immunogenic compositions and vaccines comprising carrier bacteria that secrete antigens
US7617795B2 (en) 2004-10-13 2009-11-17 Embrex, Inc. Methods and apparatus for injecting and sampling material through avian egg membranes
EP1934349A4 (en) 2005-08-30 2009-05-27 Commw Scient Ind Res Org BACTERIAL ADMINISTRATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDES
WO2007126816A2 (en) * 2006-03-30 2007-11-08 Embrex, Inc. Methods and compositions for vaccination of poultry
WO2009046449A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Recombinant bacterium capable of eliciting an immune response against enteric pathogens

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1215729A (zh) * 1997-06-20 1999-05-05 阿克佐诺贝尔公司 产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗
WO2003096812A1 (en) * 2002-04-15 2003-11-27 Washington University Regulated attenuation of live vaccines to enhance cross protective immunogenicity
WO2005047458A2 (en) * 2003-06-18 2005-05-26 Genelux Corporation Modified recombinant vaccina viruses and other microorganisms, uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Keyburn AL等.NetB, a New Toxin That Is Associated with Avian Necrotic Enteritis Caused by Clostridium perfringens,PLoS Pathogens.《PLoS Pathogens》.2008,第4卷(第2期),e26,第0001-0011页. *
KeyburnAL等.NetB a New Toxin That Is Associated with Avian Necrotic Enteritis Caused by Clostridium perfringens，PLoS Pathogens.《PLoS Pathogens》.2008

Also Published As

Publication number Publication date
EP2164862B1 (en) 2015-07-22
PT2164862E (pt) 2015-10-29
PL2164862T3 (pl) 2015-12-31
WO2008148166A1 (en) 2008-12-11
BRPI0812346A2 (pt) 2015-01-27
CA2689302C (en) 2015-08-25
JP2014221046A (ja) 2014-11-27
HUE025717T2 (en) 2016-04-28
CA2689302A1 (en) 2008-12-11
EP2164862A4 (en) 2011-11-02
US20100291131A1 (en) 2010-11-18
JP5901115B2 (ja) 2016-04-06
AU2008258277B2 (en) 2012-07-12
AU2008258277A1 (en) 2008-12-11
ES2550685T3 (es) 2015-11-11
MX2009012924A (es) 2010-03-25
US8263088B2 (en) 2012-09-11
EP2980100A1 (en) 2016-02-03
BRPI0812346B1 (pt) 2019-01-22
JP2010529838A (ja) 2010-09-02
RU2474587C2 (ru) 2013-02-10
EP2164862A1 (en) 2010-03-24
CN101903399A (zh) 2010-12-01
RU2009149378A (ru) 2011-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101903399B (zh) 梭菌毒素netb
Bonneau et al. Biotechnology in animal nutrition, physiology and health
KR20080005277A (ko) 씨. 퍼프린겐스 알파 톡소이드 백신
CN101489584B (zh) 重组减毒梭状芽孢杆菌生物体和疫苗
CN106029091B (zh) 基于藻类的可食性疫苗
CN102276730B (zh) 金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白制备方法及其应用
CN107812183B (zh) 一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
CN106540240A (zh) 抗菌肽融合细胞因子CAMPILs共表达生物制剂的制备和应用
CN109078178B (zh) 一种产气荚膜梭菌β毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
Davarpanah et al. Lactococcus lactis expressing sand fly PpSP15 salivary protein confers long-term protection against Leishmania major in BALB/c mice
CN107753940B (zh) 一种产气荚膜梭菌ε毒素重组亚单位疫苗及其生产方法
Sizemore et al. Live, attenuated Salmonella typhimurium vectoring Campylobacter antigens
CN109395072B (zh) 一种腐败梭菌α毒素基因工程疫苗及其生产方法
Zhao et al. Recombinant Lactobacillus casei expressing Clostridium perfringens toxoids α, β2, ε and β1 gives protection against Clostridium perfringens in rabbits
CN106146626B (zh) 一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及制备方法及应用
CN111961121B (zh) 产气荚膜梭菌ε毒素突变体蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN105602981B (zh) 一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备方法及应用
KR101590553B1 (ko) M 세포 표적형 mIL-6 분비 Lactococcus lactis IL1403 재조합 유산균주
CN111944838B (zh) 革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗
US20060088546A1 (en) Antigens for raising an immune response against rickettsieae and ehrlichieae pathogens
CN101906395B (zh) 一种口服免疫阻断鸡肌抑素作用的转化子及其应用
KR20220108241A (ko) 항체를 포함하는 알의 제조방법
CN116693693A (zh) 一种融合表达gcrv vp6和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用
Vogt Recombinant bacillus subtilis spores as a safe carrier for enteric immunization against echinococcus granulosus
CN116948933A (zh) 一种表达锚定柔嫩艾美耳球虫ron2抗原的重组植物乳杆菌及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant