CN101891792B

CN101891792B - 一种丹参花中三萜类化合物及其提取方法和应用

Info

Publication number: CN101891792B
Application number: CN201010212515.XA
Authority: CN
Inventors: 刘普; 邓瑞雪; 段文录; 梁菊; 尹卫平; 柴元武; 孙鲜明
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2030-06-29
Also published as: CN101891792A

Abstract

一种丹参花中三萜类化合物，所述的三萜类化合物分子式为C₃₀H₅₀O₂，结构式为I或II所示；从丹参花中提取分离得到的三萜类化合物，经药理试验证明具有一定的细胞毒作用可以抑制肿瘤细胞，其制备过程快速、简便。

Description

一种丹参花中三萜类化合物及其提取方法和应用

(一)技术领域

本发明属于天然产物化学领域，特别涉及一种丹参花中三萜类化合物及其提取方法和应用。

(二)背景技术

丹参为多年生直立草本植物，其干燥根及根茎，也就是我们常说的中药“丹参”，是一种主治心血管系统疾病的常用中药。研究表明，中药丹参主要有两类活性成分：一种为脂溶性的二萜类化合物，另一种为水溶性的多聚酚酸类成分。

丹参花为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的花。丹参为无限性开花植物，一年生即可开花。丹参一般四月份开花，持续到10月下旬植株几近枯萎时。丹参植株地上部分生长旺盛，分枝较多，持续开花，为无限花序，花序轴一般为腋生，从地上部分生长观察来看，地上茎分枝越多，腋生花序相应的也较多，特别是在7-8月份地上生长旺盛时期。丹参花中三萜类化合物的发现以及提取一直是研究的热点。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种丹参花中三萜类化合物，所述的三萜类化合物具有一定细胞毒作用，具有较强抗肿瘤作用。

本发明采用的技术方案如下：

一种丹参花中三萜类化合物，所述的三萜类化合物分子式为C₃₀H₅₀O₂，结构式为I或II所示：

两个新化合物的名称分别为：Olean-12-ene-3α，23-diol(SMBF-1)(式I化合物)，中文名丹参二醇A；Urs-12-ene-3α，23-diol(SMBF-2)，中文名丹参二醇B(式II化合物)，分子量都是442。

新化合物的结构鉴定是通过各种有机波谱分析(¹H NMR¹³C NMR DEPT2D-NMR ¹H-¹H COSY，HSQC，HMBC，NOESY)以及与类似化合物的波谱数据进行比较而获得其未知化合物的结构。

化合物SMBF-1的波谱数据如下：

白色粉末.IR(KBr)：3404，2930，1635，1459，1384，1258，1045.¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)：δ5.21(1H，t，3.5，H-12)，3.72(1H，brs，H-3)，3.44，3.58(each 1H，d，11.3，H-23)，0.72，0.84，0.87，0.88，0.98，0.99，1.17(each 3H，s，).¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)：δ(C1～30)：32.8，26.3，76.6，40.2，42.7，18.0，32.2，40.0，47.5，36.7，23.5，121.6，145.3，41.8，27.0，26.1，32.5，47.3，46.8，31.1，34.8，37.2，71.4，17.9，16.8，15.6，26.2，28.4，33.3，23.7。HR-ESI-MS：442.3802([M+Na]⁺，C₃₀H₅₀O₂Na⁺；calc.442.3788)。

化合物SMBF-2的波谱数据如下：

白色粉末.

IR(KBr)：3406，2931，1640，1461，1384，1258，1040.¹H-NMR(CDCl₃，500MHz)：δ5.16(1H，t，3.6，H-12)，3.72(1H，brs，H-3)，3.44，3.58(each 1H，d，11.3，H-23)，0.72，0.81(3H，d，6.5)，0.83，0.93(3H，d，6.4)，0.97，0.98，1.13(each 3H，s).¹³C-NMR(CDCl₃，125MHz)：δ(C1～30)：32.4，26.4，76.7，40.2，42.7，18.1，33.1，40.2，47.5，36.7，23.3，124.3，139.7，42.2，28.1，26.6，33.8，59.1，39.6，39.6，31.3，41.6，71.4，18.0，16.9，15.8，23.4，28.8，17.5，21.4。HR-ESI-MS：442.3784([M+Na]⁺，C₃₀H₅₀O₂Na⁺；calc.442.3788)。

化合物SMBF-1和SMBF-2的晶体数据

从丹参花中提取的三萜类化合物，除了上述两个新的化合物外，还有6个已知的化合物，这六个已知的化合物分别为：齐墩果酸(oleanolic acid，记作SMBF-3)，C₃₀H₄₈O₃；熊果酸(ursolic acid，记作SMBF-4)，C₃₀H₄₈O₆；2α-羟基乌苏酸(corosolic acid，记作SMBF-5)，C₃₀H₄₈O₄；2α-羟基齐敦果酸(2α-ursolicacid，记作SMBF-6)，C₃₀H₄₈O₄；3β，23-二羟基-12-烯-28-齐墩果酸(hederagenin，记作SMBF-7)，C₃₀H₄₈O₄；2α，3β，23-三羟基-12-烯-28-齐墩果酸(arjunolic acid，记作SMBF-8)，C₃₀H₄₈O₅。它们的结构式如下：

本发明还提供了一种所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，包括下列步骤：

1)将丹参花用体积浓度为60-95％的乙醇水溶液回流提取，减压浓缩得到浸膏状物；

2)将浸膏状物与蒸馏水/石油醚混合物充分混合，待溶液分液后，石油醚层减压浓缩得石油醚提取物；水层用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；

3)石油醚提取物用硅胶柱层析分离，先以石油醚-乙酸乙酯溶剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比从8∶1逐渐递减至1∶1；之后以乙酸乙酯-甲醇溶液进行梯度洗脱，乙酸乙酯与甲醇的体积比从100％乙酸乙酯、19∶1逐渐递减到100％甲醇；对上述柱层析馏分纯化分离得三萜类化合物I、II以及化合物SMBF-3、SMBF-4。

较为具体的，步骤1)中丹参花先用重量为其8-10倍的60-95％的乙醇水溶液回流提取3-5小时，过滤后滤渣用重量为丹参花6-8倍的60-95％的乙醇水溶液回流提取两次，每次提取3-5小时，合并三次提取液减压浓缩得到浸膏状物。

步骤2)中分液后，水层再用石油醚萃取1-2次，萃取液与石油醚层合并后再减压浓缩。

步骤3)中石油醚与乙酸乙酯的体积比的递减按照8∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1进行，每个梯度的洗脱体积为1.5BV；乙酸乙酯与甲醇的体积比的递减按照100％乙酸乙酯、19∶1、10∶1、5∶1、100％甲醇进行，每个梯度的洗脱体积为1.5BV。

具体的，所述的分离纯化为部分馏分采用凝胶柱层析脱色，用氯仿-甲醇体积比为2-3∶1的溶剂进行重结晶得到式I、II化合物，凝胶柱可选择ToyopearlHW-40C；后续重结晶采用乙酸乙酯-石油醚溶剂。部分馏分采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、高效液相色谱分离得到化合物SMBF-3、SMBF-4。所述的分离纯化并不仅限于上述方法，采用常规实验手段即可，是本领域技术人员的公知常识，此次不再赘述。

化合物SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8提取步骤如下：

将步骤2)中的乙酸乙酯提取物用硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯溶剂进行洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比从4∶1逐渐递减至1∶4；之后以乙酸乙酯-甲醇溶剂进行洗脱，乙酸乙酯与甲醇的体积比从100％乙酸乙酯、10∶1逐渐递减到100％甲醇；然后薄层色谱分析合并相似馏分，对馏分进行分离纯化获得三萜类化合物SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8。

具体的，石油醚-乙酸乙酯溶剂按照4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的梯度递减，每个梯度的洗脱体积为1.5BV；乙酸乙酯-甲醇溶剂按照100％乙酸乙酯、10∶1、5∶1、3∶1、100％甲醇进行梯度递减，每个梯度的洗脱体积为1.5BV。

所述的丹参花中三萜类化合物具有一定的细胞毒活性，在制备抗肿瘤药物中有很好的应用。

本发明相对于现有技术，有以下优点：

从丹参花中提取分离得到新的三萜类化合物，并经药理试验证明这些三萜类化合物具有一定的细胞毒作用可以抑制肿瘤细胞，其制备过程快速、简便。

(四)具体实施方式：

原料丹参花2Kg，于2007年4月采自河南省栾川县豫西丹参GAP种植基地，由洛阳梓生科技开发有限公司王忠东教授鉴定。

实施例1

丹参花2Kg用18Kg体积浓度为95％的乙醇在50℃回流提取4小时，过滤，再用15Kg的95％乙醇回流提取两次，每次4小时，合并滤液，减压浓缩得到浸膏状物300g，将浸膏状物加水3L和石油醚2.5L混旋，分离石油醚层，水层再用石油醚萃取4次，每次2L，合并石油醚萃取液，浓缩至浸膏状得石油醚萃取物58g；采用同样的方法，水层用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物75g。

1、将上述石油醚层萃取物50g用硅胶柱层析分离(1000g硅胶，层析柱：50×1200mm)，以石油醚-乙酸乙酯溶剂系统(8∶1，6∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1)，然后用乙酸乙酯-甲醇系统(100％乙酸乙酯，19∶1，10∶1，5∶1，100％甲醇)各1500mL进行梯度洗脱，得馏分20个(以SMB0101-SMB0120命名)。

馏分SMB0106(2.3g)采用凝胶柱色谱(HW-40C)层析，洗脱剂氯仿∶甲醇＝2∶1，得5个组分(SMB0301-0305)，组分SMB0304经乙酸乙酯-石油醚重结晶得单体化合物SMBF-1和化合物SMBF-2。

馏分SMB0110(5.1g)采用硅胶柱层析(硅胶700g，洗脱剂∶氯仿/甲醇＝99∶19，7∶3，95∶5，9∶1，8∶2)进行洗脱，薄层层析检测合并类似馏分，得10组分(SMB0401-0410)。将馏分SMB0406(1.1g)经凝胶柱色谱层析(HW-40C，洗脱剂：氯仿∶甲醇＝2∶1，)分离，得5个组分(SMB0501-0505)，组分SMB0503经反相高效液相色谱分离得单体化合物SMBF-3和SMBF-4。

乙酸乙酯萃取物(70g)用硅胶柱层析分离(1300g硅胶，层析柱：50×1200mm)，以石油醚-乙酸乙酯溶剂系统(4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4)，然后用乙酸乙酯-甲醇系统(100％乙酸乙酯，10∶1，5∶1，3∶1，100％甲醇)各2000mL进行梯度洗脱，薄层色谱分析合并相似馏分，得馏分22个(以SMB1001-SMB1022命名)。

馏分SMB1010(8.8g)经硅胶柱层析(硅胶1000g，洗脱剂∶氯仿/甲醇＝95∶5，9∶1，8∶2，7∶3)进行洗脱，薄层层析检测合并类似馏分，得12个组分(SMB1301-SMB1312)，组分SMB1305采用凝胶柱色谱(HW-40C)层析，洗脱剂氯仿∶甲醇＝2∶1，得5个组分(SMB1401-1405)，组分SMB1403经反相高效液相色谱(ODS-A色谱柱：20×250mm，5μm，流动相∶甲醇/水＝8∶2)，分离得单体化合物SMBF-5、SMBF-6和SMBF-7。

馏分SMB1014(5.7g)经硅胶柱层析(硅胶700g，洗脱剂∶氯仿/甲醇＝95∶5，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4)进行洗脱，薄层层析检测合并类似馏分，得15个组分(SMB1601-SMB1615)，组分SMB1607采用凝胶柱色谱(HW-40C，洗脱剂∶氯仿/甲醇＝2∶1)层析，得6个组分(SMB1701-1706)，组分SMB1704经反相高效液相色谱(ODS-A色谱柱：20×250mm，5μm，流动相∶甲醇/水＝8∶2)，分离得单体化合物SMBF-8。

上述分离得到的化合物的细胞毒活性采用MTT法测试，试验具体操作步骤如下：

1.取对数生长期细胞，用含10％胎牛血清的RPM1640培养液，制成单细胞悬液5×10⁴个/mL，将该悬液加到96孔培养板中，每孔加入1×10⁴个细胞。培养24h后，加入受试药物，化学单体浓度分别为30μg/mL、10μg/mL。

2.将平板在37℃，含5％CO₂空气及100％湿度的温箱中孵育3天，去除培养液。

3.MTT用无血清的RPM1640培养液配成1mg/mL溶液，每孔加100μL，37℃温育4h，使MTT还原为甲臢。

4.吸出上层清液，加入150μL DMSO使甲膜溶解，于ELISA仪570nm处测OD值。

表4分离化合物细胞毒活性实验数据(n＝6)

以上只是本发明的优选实施方式，但本发明保护范围不限于此，凡是不违背本发明的原理、精神……都在本发明的保护之列。

Claims

1.一种丹参花中三萜类化合物，其特征在于，所述的三萜类化合物分子式为C₃₀H₅₀O₂，结构式为I或II所示：

2.丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）将丹参花用体积浓度为60-95%的乙醇水溶液回流提取，减压浓缩得到浸膏状物；

2）将浸膏状物与蒸馏水/石油醚混合物充分混合，待溶液分液后，石油醚层减压浓缩得石油醚提取物；水层用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；

3）石油醚提取物用硅胶柱层析分离，先以石油醚-乙酸乙酯溶剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比从8：1逐渐递减至1：1；之后以乙酸乙酯-甲醇溶液进行梯度洗脱，乙酸乙酯与甲醇的体积比从100%乙酸乙酯、19：1逐渐递减到100%甲醇；对上述柱层析馏分纯化分离得三萜类化合物I、II以及化合物SMBF-3、SMBF-4；化合物I、II的结构式如下所示，所述的SMBF-3、SMBF-4如式III中所示；

3.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤1）中丹参花先用重量为其8-10倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取3-5小时，过滤后滤渣用重量为丹参花6-8倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取两次，每次提取3-5小时，合并三次提取液减压浓缩得到浸膏状物。

4.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤2）中分液后，水层再用石油醚萃取1-2次，萃取液与石油醚层合并后再减压浓缩。

5.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤3）中石油醚与乙酸乙酯的体积比的递减按照8：1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1进行，每个梯度的洗脱体积为1.5BV。

6.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤3）中乙酸乙酯与甲醇的体积比的递减按照100%乙酸乙酯、19:1、10:1、5:1、100%甲醇进行，每个梯度的洗脱体积为1.5BV。

7.如权利要求2-6之一所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，分离纯化为采用凝胶柱层析，然后用乙酸乙酯-石油醚溶剂重结晶。

8.如权利要求2-6之一所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，将步骤2）中的乙酸乙酯提取物用硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯溶剂进行洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比从4：1逐渐递减至1：4；之后以乙酸乙酯-甲醇溶剂进行洗脱，乙酸乙酯与甲醇的体积比从100%乙酸乙酯、10：1逐渐递减到100%甲醇；然后薄层色谱分析合并相似馏分，对馏分进行分离纯化获得三萜类化合物SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8；所述的SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8如下式中所示：

9.如权利要求8所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，石油醚-乙酸乙酯溶剂按照4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4的梯度递减，每个梯度的洗脱体积为1.5BV；乙酸乙酯-甲醇溶剂按照100%乙酸乙酯、10:1、5:1、3:1、100%甲醇进行梯度递减，每个梯度的洗脱体积为1.5BV。

10.丹参花中三萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述三萜类化合物为I、II，结构式如下所示：