CN101885681B - 截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物来源化合物的提取工艺，特别涉及截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺，包括以下步骤：从截短侧耳素产生菌全发酵液中分离出菌丝体，干燥，粉碎过筛，烘焙至菌丝体总含水量低于5％，得烘焙菌丝体，备用；将所得烘焙菌丝体置超临界萃取釜中，在萃取压力为12～24Mpa、萃取温度为35～55℃、二氧化碳流速为25kg/h的条件下进行超临界二氧化碳萃取，萃取时间为60～100分钟，收集萃取物，即得截短侧耳素；该工艺具有稳定易行，溶剂用量小，提取时间短，产物含杂质少，生产成本低等优点。

Description

截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺
技术领域
本发明涉及微生物来源化合物的提取工艺，特别涉及截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺。
背景技术
截短侧耳素(pleuromutilin)是一种三环二萜类广谱抗生素，1951年首先由学者Kavanagh等从担子菌Pleurotus mutilis及P.passeckerianus中分离得到，已发现担子菌纲斜盖菇(Clitopilus)属中11个真菌能产生此抗生素。截短侧耳素主要作用于细菌50S核糖体亚基，通过抑制肽基转移酶的活性阻断细菌蛋白合成，其独特的抗菌机制使其展示出对耐药菌的良好抗菌活性，同时还具有不易与其他药物发生交叉耐药的优越性，但由于其存在半衰期短、水溶性差等缺点，在应用上受到很大限制。构效关系研究表明，截短侧耳素C-14位侧链的修饰可改变其水溶性和抗菌活性。由此，目前已成功开发出多种截短侧耳素衍生物，如新型兽用抗生素泰妙菌素(Tiamulin)、沃尼妙林(Valnemulin)及新型人用抗生素瑞他莫林(Retapamulin)，这些衍生物的水溶性和抑菌活性均较截短侧耳素有较大提高，尤其是瑞他莫林的开发实现了从兽用抗生素到人用抗生素的飞跃。此外，日本住友制药、Nabriva Therapeutics和GSK制药公司开发的几种新型截短侧耳素衍生物目前已相继进入临床。这些皆预示着截短侧耳素衍生物良好的开发应用前景。
截短侧耳素是合成截短侧耳素衍生物的重要中间体。目前有关其提取工艺的研究报道较少。国内生产厂家多采用溶剂提取工艺，即用板框压滤法从截短侧耳素产生菌全发酵液中分离出菌丝体，再用甲醇进行浸提。但该工艺在实际工业应用过程中存在溶剂用量大、提取时间长、溶剂回收能耗大、产品纯度较差、生产成本高等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺，具有稳定易行、溶剂用量小、提取时间短、产品纯度高、生产成本低等优点。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺，包括以下步骤：
a、从截短侧耳素产生菌全发酵液中分离出菌丝体，干燥，粉碎过筛，烘焙至含水量低于5％，得烘焙菌丝体，备用；
b、将步骤a所得烘焙菌丝体置超临界萃取釜中，在萃取压力为12～24Mpa、萃取温度为35～55℃、二氧化碳流速为25kg/h的条件下进行超临界二氧化碳萃取，萃取时间为60～100分钟，收集萃取物，即得截短侧耳素。
进一步，所述步骤b中还添加夹带剂，所述夹带剂为体积分数为95％的乙醇水溶液，所述夹带剂用量为每克烘焙菌丝体添加夹带剂0.5～1.5毫升；
进一步，所述步骤b中萃取压力为24Mpa、萃取温度为35℃、萃取时间为80分钟、夹带剂用量为每克烘焙菌丝体添加夹带剂0.5毫升。
本发明的有益效果在于：首先，本发明改进了提取前菌丝体的预处理方式，将菌丝体经粉碎、烘焙预处理，利于超临界二氧化碳在菌丝体中的传质，利于与脂类或蛋白质紧密结合的截短侧耳素的溶出，还利于减少提取过程中由于水分的存在对超临界二氧化碳萃取的干扰；其次，本发明对截短侧耳素超临界二氧化碳萃取工艺的条件如萃取压力、萃取温度、萃取时间、是否添加夹带剂及夹带剂用量等进行了考察和优化，所得优化工艺具有稳定易行、溶剂用量小、提取时间短、产品纯度高、生产成本低等优点，工业应用前景好。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例中使用的主要材料和仪器：截短侧耳素全发酵液按照文献方法(Hu C，et al.Effect of soybean oil on the production of mycelial biomass andpleuromutilin in the shake-flask culture of Pleurotus mutilis.World J Microb Biot，2009，25(10)：1705-1711)通过产生菌Pleurotus mutilis-04发酵制得；二氧化碳购自重庆巴人气体有限公司；95％乙醇(分析纯)购自成都市科龙化工试剂厂；超临界萃取装置(TC-SFE-50-0.5-210S型)购自沈阳天诚超临界萃取有限公司；高效液相色谱仪(LC-20AT型)购自日本岛津公司。
实施例1～21、截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取
方法：采用板框过滤法从截短侧耳素全发酵液中分离出菌丝体，自然风干，粉碎过16目筛，45℃烘焙8～10小时至含水量＜5％，得烘焙菌丝体，采用高效液相色谱法(邹祥.高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量.食品与发酵工业，2006，32(03)：83-85)测得烘焙菌丝体中截短侧耳素含量为15.80％(w/w)；称取烘焙菌丝体100g置超临界萃取釜中，不添加夹带剂或添加夹带剂(甲醇、95％乙醇、醋酸丁酯或醋酸乙酯)，在萃取压力为12～24Mpa、萃取温度为35～55℃、二氧化碳流速为25kg/h的条件下进行超临界二氧化碳萃取，萃取时间为60～100分钟，收集萃取物，即得截短侧耳素。将萃取后的菌丝体于45℃干燥至恒重，按20mL/g的用量加入甲醇，超声1小时，再空气浴振荡24小时，滤过，取滤液，用高效液相色谱法测定萃取后菌丝体中截短侧耳素残余量，计算截短侧耳素提取率。具体工艺条件及结果见下表。
附表截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺条件及结果
Figure BSA00000191820300041
由实施例1～5可知，4种夹带剂的截短侧耳素提取率为77.09％～86.85％，最高值与最低值之间仅相差10％，说明夹带剂的种类对截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取效果不具有显著性影响，但与不添加夹带剂相比，添加夹带剂后能够小幅改善截短侧耳素的提取率，因此优选添加夹带剂，其中夹带剂优选安全性好且价廉易得的95％乙醇。
由实施例6～11可知，当萃取时间为45分钟时，截短侧耳素提取率仅为31.3％；当萃取时间增加至60分钟时，截短侧耳素提取率大幅提高，达到82.09％；之后继续增加萃取时间，截短侧耳素提取率的增幅变小；当萃取时间超过105分钟后，截短侧耳素提取率基本无变化；因此萃取时间优选为60～105分钟。
由实施例12～21可知，萃取压力对截短侧耳素提取率的影响较显著，当萃取压力由12Mpa升高至24Mpa时，截短侧耳素的提取率由54.49％提高至89.69％，提高了近30％；推测其原因在于，压力升高可以明显改善超临界二氧化碳对截短侧耳素的选择性，并显著提高截短侧耳素在超临界二氧化碳中的溶解度，从而提高了截短侧耳素提取率。当萃取压力一定时，截短侧耳素的提取率随着萃取温度的升高而呈现下降趋势；推测其原因在于，温度升高虽然可以增加超临界二氧化碳的扩散性，提高其传质性能，但同时使超临界二氧化碳的密度降低，对截短侧耳素的溶解能力降低，且此效应强于扩散效应，从而降低了截短侧耳素的提取率。由于添加夹带剂仅能小幅提高截短侧耳素提取率，而萃取时间超过60分钟时截短侧耳素提取已比较充分，故夹带剂用量和萃取时间对截短侧耳素提取率的影响不明显。最佳萃取工艺条件为：萃取压力为24Mpa、萃取温度为35℃、萃取时间为80分钟、夹带剂用量为0.5mL/g。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (1)

1.截短侧耳素的超临界二氧化碳萃取工艺，其特征在于：包括以下步骤：
a、从截短侧耳素产生菌全发酵液中分离出菌丝体，干燥，粉碎过筛，烘焙至含水量低于5％，得烘焙菌丝体，备用；
b、将步骤a所得烘焙菌丝体置超临界萃取釜中，添加夹带剂，所述夹带剂为体积分数为95％的乙醇水溶液，所述夹带剂用量为每克烘焙菌丝体添加夹带剂0.5毫升，在萃取压力为24Mpa、萃取温度为35℃、二氧化碳流速为25kg/h的条件下进行超临界二氧化碳萃取，萃取时间为80分钟，收集萃取物，即得截短侧耳素。
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