CN101880672B

CN101880672B - 一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用

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Publication number: CN101880672B
Application number: CN2010101915048A
Authority: CN
Inventors: 曹必好; 雷建军; 陈国菊; 曾国平; 王勇; 柯剑; 陈清华
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2012-01-25
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN101880672A

Abstract

本发明公开了一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用。本发明抗植物青枯病基因是从半野生茄子E-31中得到的，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白如SEQ ID NO：2所示。将本发明抗植物青枯病基因转入植株中，通过筛选可得到具有抗青枯病能力的转基因植株，增强了植株的抗病性，改良了植物品种，可广泛应用到农业生产中。

Description

一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物抗病领域，具体涉及一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用。

背景技术

茄子作为中国栽培的主要蔬菜之一，2006年全国播种面积70.27万hm²，总产量2247万t。但是在茄子的生产过程中常由于病害的发生给广大的菜农造成严重经济损失，危害茄子的主要病害有黄萎病、青枯病、绵疫病、褐纹病等，例如茄子青枯病的发生一般会减产20～30％，严重时损失达50～60％，已成为影响茄子高产的主要因素。而且这种病很难根除，采取化学防治为主的综合防治措施也只能收到40～50％的防治效果，用轮作可起到一定的防治作用，但实施比较困难。要防治这些病害的经济，有效的主要对策就是选育抗病茄子品种，既能提高茄子产量，又能减少农药的使用，防止环境污染，而想选育出抗病性强的品种必须有比较理想的育种材料。目前各国开展茄子育种的所用资源遗传基础比较狭窄，是制约茄子抗病育种取得突破性进展的主要因素，野生的茄子材料由于存在生殖隔离的问题，也难以将有利的抗病基因转移到栽培种中。因此要选育优良抗病品种，必须不断地发掘和创新抗病材料，才是解决问题的根本途径。随着植物基因工程的深入研究，分离植物抗病基因已成为现实，将抗病基因导入到受体植物后既可增强植物的抗病性又能保持优良的经济性状，从而为开展植物抗病育种成找到一条新的途径。

目前有关茄子抗青枯病基因工程研究比较落后，大多数主要集中在与抗青枯病性状相连锁的分子标记筛选研究，还没有茄子抗青枯病基因分离的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于根据现有植物育种中存在的遗传基础狭窄、青枯病侵害问题严重且农药的使用会对环境造成污染的问题，提供一种具有抗青枯病功能的基因。

本发明另一目的在于提供上述抗植物青枯病基因的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述抗植物青枯病基因的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种抗植物青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白如SEQ ID NO：2所示。

本发明抗植物青枯病基因是从半野生茄子E-31中扩增得到的。

本发明抗植物青枯病基因的制备方法是通过cDNA-AFLP差异显示法及RACE法从抗青枯病的半野生茄子E-31中克隆得到的，步骤如下：

(1)对E-31、E-32、F1和F2茄子植株进行人工抗青枯病鉴定，得到抗病植株和感病植株；

(2)分别提取上述抗病植株和感病植株的总RNA，合成cDNA；

(3)利用cDNA-AFLP差异显示法进行筛选，用序列如SEQ ID NO：3～4所述引物扩增出与抗病基因连锁的抗病基因片段，序列如SEQ ID NO：5所示；

(4)利用RACE法扩增抗青枯病基因片段的全长序列：根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增5’端序列，如SEQ ID NO：6所示；所述引物序列如SEQ ID NO：7～8所示；

(5)根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增3’端序列，如SEQID NO：9所示；所述引物序列如SEQ ID NO：10～11所示；

(6)根据扩增出的5’端序列和3’端序列进行连接，得到抗青枯病基因的全长序列。

本发明从半野生茄子E-31分离到一个茄子抗青枯病基因，通过转基因把该基因导入到表现优良的感病品种中，可以提高茄子的抗病性，从而可以快速培育出新的茄子抗病品种。具体方法如下：将抗植物青枯病基因序列构建到克隆载体上，利用限制性内切酶进行双酶切，获得目的基因片段，利用内切酶双酶切植物正义表达载体，把酶切获得的基因片段和正义表达载体通过连接酶进行连接，将构建好的植物表达载体转化到农杆菌中，利用农杆菌导入法进行转化，通过筛选，得到具有抗青枯病能力的转基因植株。其中，所述克隆载体优选为pMD19-T；所述限制性内切酶优选为sma I和sac I。

本发明抗青枯病基因还可用于其它抗青枯病资源比较缺乏的植物，如番茄的基因工程育种。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从半野生茄子E-31中分离出抗青枯病基因，将该基因倒入到受体植物后既可增强植物的抗病性又能保持优良的经济性状，改良了植物品种；通过本发明将基因导入植物中以提高植物的抗青枯病能力，既能提高植物的产量，还可以减少农药的使用，防止环境污染，适合在农业生产中进行推广。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1 抗病基因的制备

1.对所用的材料(E-31，E-32及其F1、F2代植株)用灌根法进行人工抗青枯病抗性鉴定，确定抗病材料与感病材料。

2.抗病材料E-31，感病材料E-32及它们F1、F2代抗病植株，感病植株的总RNA分离提取，采用Trizol法。

3.cDNA的合成

双链cDNA合成方案参照CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library constructionkit Manual。其中Powerscript Reverse Transcriptase购于Invitrogen公司，而50×advantage 2 polymerase Mix购置于CLONTECH公司。cDNA Synthesis(CDS)、SMARTП引物及5′-PCR primer由上海生工合成，SMARTП序列如SEQ ID NO：12所示，CDS序列如SEQ ID NO：13所示，PCR Primer序列如SEQ ID NO：14所示。

第一链cDNA的合成：

(1)在一无菌的0.5mL的微量离心管中加入下列试剂：

RNA(0.025～0.5μg的poly A⁺RNA或0.05～1μg的total RNA) 1～3μg

cDNA Synthesis(CDS)Primer(10μM) 1μL

SMARTПOligonuCleotide(10μM) 1μL

加入DEPC处理水至总体积为 5μL

(2)混合样品，短暂离心；

(3)70℃保温2min；

(4)短暂离心收集样品于管底，保持试管于室温；

(5)加入下列试剂于反应管中：

5×First-Strand Buffer 2μL

DTT(20mM) 1μL

dNTP Mix(10mM) 1μL

Powerscript Reverse Transcriptase 1μL.

总体积为 10μL

(6)轻轻地涡旋且短暂离心试管；

(7)42℃温浴1h。如用PCR仪保温，样品上要加一滴矿物油；

(8)通过补充适合体积的TE缓冲液(10mM Tris[pH7.6]，1mM EDTA)稀释第一链反应产物：

若用总RNA作为开始材料，补充40μL的TE缓冲液；

若用多于0.2μg poly A⁺RNA作为开始材料，补充450μL TE缓冲液；

若用少于0.2μg poly A⁺RNA作为开始材料，补90μL TE缓冲液；

(9)加热试管72℃，7min；

(10)如不进行第二链的反应，第一链的cDNA存于-20℃可保存3个月；

4.cDNA的LD-PCR扩增：每个样品准备3个管。

(1)预热PCR仪到95℃；

(2)加入下列试剂于反应管中：

10×advantage 2PCR buffer 5μL

5′-PCR primer(10μM) 2μL

dNTP Mix(10mM) 1μL

50×advantage 2polymerase Mix 1μL

第一链cDNA 8μL

ddH₂O 33μL

总体积为 50μL

(3)混合样品，短暂离心收集样品于管底；

(4)加两滴矿物油于反应液上，将反应管置于预热好的PCR仪上；

(5)PCR反应程序如下：

95℃ 预变性1min；

95℃ 15s

65℃ 15s

68℃ 6min

循环次数全部先进行15个循环，加入1μL 0.5M EDTA到各自的反应中，终止反应，4℃保存；

5.cDNA酶切和连接

酶切：取合成好的cDNA酶切进行，先用Taq I进行酶切，酶切温度为65℃，时间3h。

酶切体系为：

cDNA(约100ng) 8μL

Taq I(10U) 1μL

10×NEB buffer 3 2μL

10×BSA 0.2μL

ddH₂O 9μL

总体积为 20μL

Ase I酶切在上述酶切体系中加入下列成分：

Taq I酶切体系 20μL

Ase I(10U) 1μL

10×Ase I buffer 3 1μL

ddH₂O 8μL

总体积为 30μL

温度为37℃，时间3h。双酶切结束后，取8μL体积的酶切产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

Taq I和Ase I接头的配制：取25μg T₁和22μg T₂混合后水定容到100μL，此为5pM Taq I的接头。另取2.6μg A₁和2μg A₂混合后水定容到100μL，此为终浓度为5pM Ase I的接头。

连接：16℃恒温槽下进行，连接过夜。取5μL于1.0％电泳，检测连接结果。

双酶切后的产物 22μL

Taq I接头 1μL

Ase I接头 1μL

T4Ligation buffer 3μL

T4DNA连接酶 1μL

补充ddH₂O总体积为 30μL

连接后产物稀释20倍最适宜用于模板的预扩增。

6.模板的预扩增和选择性扩增

预扩增反应体系：稀释的连接产物5μL，引物T₃(100ng/μL)1μL，引物A₃(100ng/μL)1μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺(25mM))2.5μL，Mg²⁺25ml)1μL，dNTPs(25mM)0.5μL，Taq酶(5U)0.4μL，补充ddH₂0至总体积为25μL。

PCR反应条件为：94℃预变性1min；94℃ 30s，退火温度分别对56℃ 30s，72℃ 1min，30个的循环次数，PCR产物取10μL，在1.5％琼脂糖胶上电泳比较。PCR产物稀释到约1ng/μL(稀释20倍)，用于选择性扩增。

选择性扩增体系：13.8μL ddH₂0，2.5μL PCR buffer(含Mg²⁺(25mM))，Mg²⁺(25mM)1.0μL，0.5μL dNTP，1μL引物T，1μL引物A，5μL预扩稀释产物，0.2μL Tag聚合酶，总体积25μL。94℃，5min；94℃，30s，65℃，30s，72℃，1min，以后每轮扩增温度递减0.7℃，扩增12个循环后；94℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，共28个循环；72℃延伸7min。

cDNA-AFLP的引物和接头：由上海生工生物程技术服务有限公司合成，Taq I、Ase I接头和选扩的引物见表1。

表1 引物和接头序列表

Table 1 Adaptor and primer sequence of Tag I and Ase I

7.变性

选扩反应结束后，加入等体积的甲酰胺上样缓冲液，95℃变性5min后迅速放置冰上2min，-20℃贮藏备用。甲酰胺上样缓冲液的配制：二甲苯青1mg，溴酚蓝1mg，0.5M EDTA溶于去离子甲酰胺。

8.测序胶电泳

(1)洗板用洗衣粉洗净有机玻璃板和玻璃板的双面，再用ddH₂0冲洗干净，注意玻璃板不要有划痕；

(2)涂板洗净的玻璃板及有机玻璃板，晾干后用Eppendorf枪均匀的在板的上部点洒1mL无水乙醇擦拭，注意擦拭朝同一方向进行，不要在板上来回划，重复擦3次，晾干；玻璃板用1mL稀释的亲和硅烷(100μL亲和硅烷+900μL ddH₂O)均匀涂抹；有机玻璃板用1mL的剥离硅烷均匀涂抹一遍。5min后各用无水乙醇均匀涂抹3次；

(3)制板晾干后，将两块板组装，梳子斜向倒插，两边用夹紧，注意受力均匀；

(4)凝胶配制尿素21g，10×TBE 2.5mL，40％Arc：Bis贮液7.5mL，重蒸水26mL，400μL 10％的过硫酸氨(Ammonium persulfate)，用磁力搅拌机搅拌溶解，加水定容至50mL。灌胶前加入40μL TEMED；

10×TBE：108g Tris+55g硼酸+3.72gEDTA，定容1L；

40％测序胶贮存液(40％Arc：Bis)：38g丙烯酰胺+2g N-甲叉双丙烯酰胺溶于60mL水中，37℃助溶，定容至100mL；

10％过硫酸氨，4℃可贮数周；

(5)灌胶将固定好的板一方倾斜放置，将凝胶通过注射器从下至上快速注入，注意排除气泡，保证胶面通过毛细作用左右方呈直线水平前进，当胶填满底部后，将斜向倒插的梳子小心插入两夹板间，凝固3h以上；

(6)电泳待胶凝固好后，拔出注射器，将胶板组装好，清洗板表面和上部点样孔附近的胶，将梳子齿向下插入，稍微接触胶面，形成点样孔。首先在1×TBE中，50W预电泳30min，使电泳槽温度达到45℃。取8μL变性的选扩PCR产物上样。45℃，50W恒功率电泳90min，至二甲苯青指示带距底部约10cm处。

9.银染方法

银染液按照下列配方配制：固定/终止液(900mL ddH₂O+5mL冰醋酸+100mL无水乙醇)；染色液(2g AgNO₃+固定液)；显色液(20g NaOH+1000mL ddH₂O+5mL甲醛)；

(1)固定在托盘A中加入固定/终止液，将在胶的短板放入托盘，轻摇20min或直到指示剂颜色消失为止。也可在溶液中浸泡过夜(不摇动)。将溶液回收留用，清洗托盘；

(2)洗胶在托盘B中用ddH₂O漂洗凝胶3次，每次2min，在将玻璃板取出时，让玻板竖直滴干10～20s；

(3)染色在长盘A中加入1L染色液，将有胶的玻板放入托盘，轻摇30min；

(4)显色准备完全配制好显色液，将1L预冷的显色液置于托盘B中剩下产溶液仍置于冰上，将胶从染色液中拿出放在一边；

(5)洗胶将胶浸入装有ddH₂O的托盘中，拿出滴干水，立即将胶置于预冷的显色液中。注意，从将胶置于水中到将其放入显色液中，时间不超过5～10s。如洗胶时间过长，重复染色过程；

(6)显色轻摇显色液，至胶上条带出现(或第一条条带出现)后，将胶移入剩余的1L预冷显色液继续显色2～3min或直到所有条带都出现；

(7)固定将1L固定液加入到显色液中，终止显色反应；

(8)洗涤用ddH₂O洗凝胶两次，每次2min；

(9)干胶室温下自然晾干。

10.差异片断的回收和二次PCR扩增

(1)差异条带的回收先用少量ddH₂O浸润差异表达的条带，然后用手术刀在酒精灯上灭菌后沿条带边缘小心切下条带，溶解在50μL ddH₂O中，4℃冰箱浸泡过夜，100℃煮沸15min，其间用枪头或牙签小心捣碎凝胶，12000rpm室温离心10min，取上清液可以用作二次PCR反应的模板。

(2)差异片段扩增的PCR反应体系及反应条件利用与回收条带相匹配的引物进行二次PCR，25uL扩增体系中含有：10×PCR buffer(含Mg²⁺)2.5μL，Mg²⁺(25mM)1μL，dNTPs(25mM)0.5μL，引物A(50ng/μL)1μL，引物T(50ng/μL)1μL，Taq酶(5U)0.2μL，回收模板5μL，加ddH₂O至25μL。PCR条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min终止反应。

(3)差异片段PCR扩增产物的纯化差异条带PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，若只有一条亮带，则该产物可直接用于后续的连接反应，若有两条或更多的条带则需经辨别后，从胶上回收目的条带(用于回收PCR反应体系增加到50μL)

11.目的片段的测序

经过差异筛选后，发现T3/A8的引物组合得到与抗病材料紧密连锁的片段，经过测序后得到序列如SEQ ID NO：5所示。

12.利用RACE扩增出该基因片段的全长序列

(1)所有锚定引物均由上海生工合成，用于3’和5’RACE第一链cDNA合成的引物序列如下：

3′-CDS(12μM)如SEQ ID NO：13所示，其中N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C

5′-CDS(12μM)：5′-(T)₂₅V N-3′(N＝A，C，G，or T；V＝A，G，or C)，如SEQ IDNO：37所示；

用于3’和5’RACE PCR扩增的锚定引物序列如下：

10×universal Primer A Mix(UPM)：

Long(0.4μM)如SEQ ID NO：38所示；

Short(2μM)如SEQ ID NO：39所示。

Nested universal Primer A(NUP；10μM)如SEQ ID NO：40所示。

扩增5端序列所用的特异引物如SEQ ID NO：7～8所示；

扩增3端序列所用的特异引物如SEQ ID NO：10～11所示。

PCR反应的体系：1μL cDNA模板，2.5μL 10×PCR buffer(含25mM Mg²⁺)，Mg²⁺(25mM)0.5μL，0.5μL dNTP，1μL锚定引物，1μL特异引物，0.25μL Tag聚合酶(5U)，加18.25μL ddH₂0使总体积为25μL。PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃ 30s，退火温度60℃ 30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃再延伸7min。套式PCR的退火温度提高到62℃。PCR产物回收、连接和克隆等，送上海英骏生物技术有限公司测序。

扩增3端的PCR反应为：94℃预变性3min；94℃ 30s，退火温度52℃ 50s，72℃延伸2.5min，30个循环，72℃再延伸10min。

把扩增出来的片段克隆到pMD19-T载体上，进行测序。

得到5端序列如SEQ ID NO：6所示，得到3端序列如SEQ ID NO：9所示。

13RE-bw全长序列的连接与扩增

根据5端序列与3端序列的测序结果，进行连接得到全长序列如SEQ IDNO：1所示；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

提取抗病材料“E-31”的总RNA，而后合成cDNA。

根据抗病基因序列SEQ ID NO：1设计引物P3和P4，序列如SEQ IDNO：41～42所示；以“E-31”的cDNA为模板，按照以下PCR反应体系进行：2.5μl 10XPCR buffer(Takara，Bio USA)，0.5μl 10mmol 1-1dNTPs(Takara，BioUSA)，0.5μl(20μM)引物(P1+P2)，0.25μl 5U/μL Taq酶(Takara，Bio USA)，20μl ddH₂O and 1μl(20-50ng)的cDNA模板，放置在PCR仪上，按照程序94℃下预变性5分钟，而后94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟，循环35次，72℃放置10分钟，在1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，在成像系统(Bio-Rad，sub-cellmodel 192，USA)下分离出目的基因片段。

利用PCR产物回收纯化试剂盒(Takara，Bio USA)进行目的基因的回收，使用Takara pMD-19 Ligation Kit进行即连接反应体系：pMD19-T载体0.5μL，回收纯化产物4.5μL，Solution I 5μL，总体积为10μL，16℃反应12h。即可以把抗病基因连接到克隆载体pMD19-T上。

将含有目的基因的克隆载体可以通过热激法转化到大肠杆菌DH5α中，在液体LB培养基中培养后，添加15％的甘油，可在-80℃长期保存。

实施例2 将基因导入植物中的方法

将含有目的基因的pMD19-T用sma I和sac I双酶切，切下目的基因，而后同样用sma I和sac I双酶切pBI121的GUS基因，用T4连接酶把抗病基因与酶切后的pBI121进行16℃连接12h，即可得到抗病基因的正义植物表达载体pBI121-RE-bw，用冻融法将构建好的植物表达载体转化到农杆菌EHA105或LBA4404，即可进行遗传转化。

以感病茄子自交系“E-32”为转化材料，介绍用农杆菌介导法具体的遗传转化方法。具体的操作方法为：培养茄子无菌幼苗，切下7d苗龄的上胚轴，浸泡于浓度为OD₆₀₀0.5的农杆菌菌液中13分钟，用滤纸吸干上胚轴外植体，而后在培养基【MS+6-BA(2.0mg.L^-1)+IAA(0.1mg.L^-1)+ZT(2.0mg.L^-1)+蔗糖(30g.L^-1)+琼脂(6.5g.L^-1)，pH5.8】上预培养2d，转入筛选培养基【MS+6-BA(2.0mg.L^-1)+IAA(0.1mg.L^-1)+ZT(2.0mg.L^-1)+Km(50mg.L^-1)+Cb(500mg.L^-1)+蔗糖(30g.L^-1)+琼脂(6.5g.L^-1)，pH5.8】上进行筛选，25天后，有抗性芽分化出现，对获得的抗性芽在培养基上【MS+6-BA(2.0mg.L^-1)+IAA(0.1mg.L^-1)+ZT(2.0mg.L^-1)+蔗糖(30g.L^-1)+琼脂(6.5g.L^-1)，pH5.8】进行2-3代的快繁，可以得到大量的不定芽。

对获得的抗性芽进行Southern杂交鉴定，有杂交信号的为转基因抗性芽，没有杂交信号出现的为加阳性不定芽，对获得的转基因不定芽在生根培养基上【1/2MS+NAA(0.1mg.L^-1)+蔗糖(30g.L^-1)+琼脂(6.5g.L^-1)】进行生根，即可得到转基因植株。

实施例3 所得到的转基因植株的抗病性评价

转基因当代植株，定植于田间，发病率低于20％，发病植株的发病症状表现为1-2级(即整个植株有1～3片枯萎)，而对照(为转化植株)发病率超过80％，发病植株的症状表现为4-5级(即整个植株叶片枯萎，甚至死亡)；转基因植株进行人工接种青枯病鉴定，发病时间较对照植株推迟15天，而对照植株在接种7天后即表现感病症状。转基因植株病情指数为8.74，群体抗性表现为抗，而对照植株病情指数为76.68，群体抗性表现为高感。

一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用序列表SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>一种抗植物青枯病基因及其制备方法和应用

<130>

<160>42

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>823

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(8)..(766)

<400>1

cacaacg atg ggg ggc ttt agt ctt tct ggg gtg ggg ggg aag acg acg 49

Met Gly Gly Phe Ser Leu Ser Gly Val Gly Gly Lys Thr Thr

1 5 10

gtg ccc ttc aat tta caa aaa ctt cat tat cag gca att gca cga aat 97

Val Pro Phe Asn Leu Gln Lys Leu His Tyr Gln Ala Ile Ala Arg Asn

15 20 25 30

tgg aga atg gcc gaa agg agt ggc att tac aga gac tca cag agt tct 145

Trp Arg Met Ala Glu Arg Ser Gly Ile Tyr Arg Asp Ser Gln Ser Ser

35 40 45

cag ctg atc gtt cta gat gac aga tgg gag gga cga aga gat tct tgc 193

Gln Leu Ile Val Leu Asp Asp Arg Trp Glu Gly Arg Arg Asp Ser Cys

50 55 60

ttg gga gtt gcc ttg ctg tat tca aag gct tac cac atg caa tct caa 241

Leu Gly Val Ala Leu Leu Tyr Ser Lys Ala Tyr His Met Gln Ser Gln

65 70 75

aag acc tca gct gcc aac ttg aac gtc tca cgt ccc tcg aat atc tct 289

Lys Thr Ser Ala Ala Asn Leu Asn Val Ser Arg Pro Ser Asn Ile Ser

80 85 90

ata ttc agg gtt att cac ctc aaa ttc agt cat tgc tgg aag aag gga 337

Ile Phe Arg Val Ile His Leu Lys Phe Ser His Cys Trp Lys Lys Gly

95 100 105 110

agc ttc cct ctt atc ttt cag agc tcc att aga tca cca tca gga gct 385

Ser Phe Pro Leu Ile Phe Gln Ser Ser Ile Arg Ser Pro Ser Gly Ala

115 120 125

cca ttc att aca tct ttg cca cct cac ttc tct tca aat tct ata cat 433

Pro Phe Ile Thr Ser Leu Pro Pro His Phe Ser Ser Asn Ser Ile His

130 135 140

cga aca ttg cct ttg tct cca atc cct ttc aga atc atc act gcc ttg 481

Arg Thr Leu Pro Leu Ser Pro Ile Pro Phe Arg Ile Ile Thr Ala Leu

145 150 155

ctc cct ctc tca gct atc cat cat caa ttg ccg gaa cct ccg atc cct 529

Leu Pro Leu Ser Ala Ile His His Gln Leu Pro Glu Pro Pro Ile Pro

160 165 170

tcc ggt aaa tgg aat gcc ctc ttc tct ctc aag act aga tat tcg caa 577

Ser Gly Lys Trp Asn Ala Leu Phe Ser Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln

175 180 185 190

ctg ccc att gct cac acc aca aat aga att aga caa ggg aga ata ctg 625

Leu Pro Ile Ala His Thr Thr Asn Arg Ile Arg Gln Gly Arg Ile Leu

195 200 205

gcc aca aat tgc tca tac ggg ctg ccc ctc gcc ctt aca tct ttg cca 673

Ala Thr Asn Cys Ser Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Leu Thr Ser Leu Pro

210 215 220

cct cac ttc tct tca aat tct ata cat cga aca ttg cct gag caa aac 721

Pro His Phe Ser Ser Asn Ser Ile His Arg Thr Leu Pro Glu Gln Asn

225 230 235

ggg caa aaa aaa aag ggg gga ttt tta tct cca atc cct ttc tga 766

Gly Gln Lys Lys Lys Gly Gly Phe Leu Ser Pro Ile Pro Phe

240 245 250

atcatcactg ccttgctccc tctctcagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 823

<210>2

<211>252

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Met Gly Gly Phe Ser Leu Ser Gly Val Gly Gly Lys Thr Thr Val Pro

1 5 10 15

Phe Asn Leu Gln Lys Leu His Tyr Gln Ala Ile Ala Arg Asn Trp Arg

20 25 30

Met Ala Glu Arg Ser Gly Ile Tyr Arg Asp Ser Gln Ser Ser Gln Leu

35 40 45

Ile Val Leu Asp Asp Arg Trp Glu Gly Arg Arg Asp Ser Cys Leu Gly

50 55 60

Val Ala Leu Leu Tyr Ser Lys Ala Tyr His Met Gln Ser Gln Lys Thr

65 70 75 80

Ser Ala Ala Asn Leu Asn Val Ser Arg Pro Ser Asn Ile Ser Ile Phe

85 90 95

Arg Val Ile His Leu Lys Phe Ser His Cys Trp Lys Lys Gly Ser Phe

100 105 110

Pro Leu Ile Phe Gln Ser Ser Ile Arg Ser Pro Ser Gly Ala Pro Phe

115 120 125

Ile Thr Ser Leu Pro Pro His Phe Ser Ser Asn Ser Ile His Arg Thr

130 135 140

Leu Pro Leu Ser Pro Ile Pro Phe Arg Ile Ile Thr Ala Leu Leu Pro

145 150 155 160

Leu Ser Ala Ile His His Gln Leu Pro Glu Pro Pro Ile Pro Ser Gly

165 170 175

Lys Trp Asn Ala Leu Phe Ser Leu Lys Thr Arg Tyr Ser Gln Leu Pro

180 185 190

Ile Ala His Thr Thr Asn Arg Ile Arg Gln Gly Arg Ile Leu Ala Thr

195 200 205

Asn Cys Ser Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Leu Thr Ser Leu Pro Pro His

210 215 220

Phe Ser Ser Asn Ser Ile His Arg Thr Leu Pro Glu Gln Asn Gly Gln

225 230 235 240

Lys Lys Lys Gly Gly Phe Leu Ser Pro Ile Pro Phe

245 250

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctcgtagact gcgtacctaa t 21

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gatgagtcct gaccgacg 18

<210>5

<211>446

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggcttaccac atgcaatctc aaaagacctc agctgccaac ttgaacgtct cacgtccctc 60

gaatatctct atattcaggg ttattcacct caaattcagt cattgctgga agaagggaag 120

cttccctctt atctttcaga gctccattag atcaccatca ggagctccat tcattacatc 180

tttgccacct cacttctctt caaattctat acatcgaaca ttgcctttgt ctccaatccc 240

tttcagaatc atcactgcct tgctccctct ctcagctatc catcatcaat tgccggaacc 300

tccgatccct tccggtaaat ggaatgccct cttctctctc aagactagat attcgcaact 360

gcccattgct cacaccacaa atagaattag acaagggaga atactggcca caaattgctc 420

atacgggctg cccctcgccc ttacat 446

<210>6

<211>219

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cacaacgatg gggggcttta gtctttctgg ggtggggggg aagacgacgg tgcccttcaa 60

tttacaaaaa cttcattatc aggcaattgc acgaaattgg agaatggccg aaaggagtgg 120

catttacaga gactcacaga gttctcagct gatcgttcta gatgacagat gggagggacg 180

aagagattct tgcttgggag ttgccttgct gtattcaaa 219

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cctgatggtg atctaatgga gctctga 27

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

agggaagctt cccttcttcc agca 24

<210>9

<211>158

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ctttgccacc tcacttctct tcaaattcta tacatcgaac attgcctgag caaaacgggc 60

aaaaaaaaaa ggggggattt ttatctccaa tccctttctg aatcatcact gccttgctcc 120

ctctctcaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 158

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

cgcaactgcc cattgctcac accaca 26

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

agaattagac aagggagaat a 21

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30

<210>13

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(57)..(57)

<223>n is a，c，g，or t

<400>13

aagcagtggt atcaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttvn 57

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210>15

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

gacgatgagt cctgac 16

<210>16

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cggtcaggac tcat 14

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gacgatgagt cctgaccga 19

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

gatgagtcct gaccgatg 18

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

gatgagtcct gaccgata 18

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gatgagtcct gaccgatt 18

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gatgagtcct gaccgatc 18

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gatgagtcct gaccgaca 18

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

gatgagtcct gaccgact 18

<210>24

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

gatgagtcct gaccgacc 18

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

gatgagtcct gaccgaga 18

<210>26

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

ctcgtagact gcgtacc 17

<210>27

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

taggtacgca gtc 13

<210>28

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

gactgcgtac ctaattg 17

<210>29

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

gactgcgtac ctaatta 17

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

gactgcgtac ctaattt 17

<210>31

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

gactgcgtac ctaattc 17

<210>32

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

gactgcgtac ctaatcg 17

<210>33

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

gactgcgtac ctaatca 17

<210>34

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

gactgcgtac ctaatct 17

<210>35

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

gactgcgtac ctaatcc 17

<210>36

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

gactgcgtac ctaatgg 17

<210>37

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>n is a，c，g，or t

<400>37

tttttttttt tttttttttt tttttvn 27

<210>38

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210>39

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

<210>41

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

cacaacgatg gggggcttta gtct 24

<210>42

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

tctgacagag ggagcaaggc agtgatgatt caga 34

Claims

1.一种抗茄子青枯病基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的抗茄子青枯病基因的制备方法，其特征在于通过cDNA-AFLP差异显示法及RACE法从抗青枯病的茄子E-31中克隆得到的，步骤如下：

(1)对E-31、E-32、F1和F2茄子植株进行人工抗青枯病鉴定，得到抗病植株和感病植株；其中，E-31为抗病植株，E-32为染病植株，F1和F2为E-31和E-32的F1和F2代植株；

(2)分别提取上述抗病植株和感病植株的总RNA，合成cDNA；

(4)利用RACE法扩增抗青枯病基因片段的全长序列：根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增5’端序列，如SEQ ID NO：6所示；所用引物序列如SEQ ID NO：7～8所示；

(5)根据步骤(3)所得抗病基因片段设计引物，扩增3’端序列，如SEQID NO：9所示；所用引物序列如SEQ ID NO：10～11所示；

3.根据权利要求1所述的抗茄子青枯病基因在制备抗青枯病转基因茄子中的应用。

4.根据权利要求3所述的抗茄子青枯病基因的应用，其特征在于将抗植物青枯病基因序列构建到克隆载体上，利用限制性内切酶进行双酶切，获得目的基因片段，利用内切酶双酶切植物正义表达载体，把酶切获得的基因片段和正义表达载体通过连接酶进行连接，将构建好的植物表达载体转化到农杆菌中，利用农杆菌导入法进行转化，通过筛选，得到具有抗青枯病能力的转基因植株。

5.根据权利要求4所述的抗茄子青枯病基因的应用，其特征在于所述克隆载体为pMD19-T。

6.根据权利要求4所述的抗茄子青枯病基因的应用，其特征在于所述限制性内切酶为sma I和sac I。